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Resumo

Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, relatamos uma células B in vitro para o modelo de diferenciação de células plasmáticas.

Resumo

Os plasmócitos (PCs) secretam grandes quantidades de anticorpos e desenvolver a partir de células B que foram ativadas. PCs são raras células localizadas na medula óssea ou mucosa e garantir imunidade humoral. Devido à sua baixa frequência e localização, o estudo dos PCs é difícil em humanos. Nós relatamos um B para PC modelo de diferenciação in vitro usando combinações selecionadas de citocinas e a ativação de moléculas que permitem reproduzir a diferenciação de células sequenciais ocorrem in vivo. Neste modelo in vitro, células B (MBCs) irão diferenciar em pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), cedo PCes de memória e, finalmente, em Long-lived PCs, com um fenótipo perto de suas contrapartes em indivíduos saudáveis,. Também construímos uma acesso aberto bioinformática ferramentas para analisar as informações mais importantes de dados GEP relacionados à diferenciação de PC. Esses recursos podem ser usados para estudar B humano para diferenciação de PC e no atual estudo, investigamos a regulação da expressão gênica de fatores epigenéticos durante B humano para diferenciação de PC.

Introdução

A diferenciação das células B para células plasmáticas (PCs) é essencial para a imunidade humoral e proteger o hospedeiro contra infecções1. B a diferenciação de PC está associado com grandes mudanças na capacidade de transcrição e metabolismo para acomodar a secreção de anticorpos. Os fatores de transcrição que controlam a B para diferenciação de PC têm sido muito estudados e revelou redes exclusivas incluindo transcrição B PC-específicas e fatores (TFs)2. Em células B, PAX5, BCL6 e BACH2 TFs são os guardiães das células B identidade2,3. Indução de IRF4, PRDM1 , BLIMP1 e XBP1 PC TF de codificação irá extinguir genes de células B e induzir uma coordenada desegregação celular programa transcriptional3,4,5. Essas alterações transcricionais coordenadas estão associadas com a ativação de transcrição de genes de Ig juntamente com um interruptor de forma a membrana-limite para a forma secretada da imunoglobulina cadeia pesada2,3, 4. B para diferenciação de PC está relacionada com a indução de genes envolvidos no retículo endoplasmático e complexo de Golgi funções concomitante com ativação de resposta (UPR) unfolded da proteína conhecida por desempenhar um papel-chave no PC por acomodar a síntese de secretado imunoglobulinas6,7. A XBP1 de TF desempenha um papel importante nesta adaptação celular8,9,10.

As células B e PCs são jogadores-chave da imunidade humoral. Noções básicas sobre o biológico processos que controlam a produção e a sobrevivência das células de plasma normais é crítico em intervenções terapêuticas que precisam assegurar eficientes respostas imunes e prevenir auto-imunidade ou deficiência imunológica. PC são raras células com estágios iniciais de diferenciação que ocorrem em locais anatómicos que dificultam a caracterização biológica, particularmente em humanos. Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, registramos um B in vitro para PC modelo de diferenciação. Este modelo reproduz a diferenciação celular sequencial e maturação ocorrendo em diferentes órgãos em vivo11,12,13. Numa primeira fase, as células de memória B são ativado pela primeira vez por quatro dias por combinação de CD40 ligante, oligodeoxynucleotides e citocinas em diferenciarem em preplasmablasts (PrePBs). Em uma segunda etapa, preplasmablasts são induzidas de se diferenciarem em plasmablasts (PBs) removendo estimulação CD40L e oligodeoxynucleotides e mudar a combinação do cytokine. Em uma terceira etapa, plasmablasts são induzidos a se diferenciar em PCs cedo, alterando a combinação de citocina11,12. Um quarto passo foi introduzido para obter PCs totalmente maduros pelo cultivo destes primeiros PCs com meio condicionados de células do estroma de medula óssea ou selecionado de fatores de crescimento13. Estes PCs maduros podem sobreviver vários meses in-vitro e secretam quantidades elevadas de imunoglobulina (Figura 1). Curiosamente, o nosso modelo in vitro recapitula as alterações transcricionais coordenadas e o fenótipo do B diferente fases de PC que pode ser detectado em vivo11,12,13,14 ,15. PCs são células raras e nosso modelo de diferenciação in vitro permite estudar B humano para diferenciação de PC.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes em conformidade com o acordo do Centro Hospital Universidade de Montpellier para recursos biológicos e a declaração de Helsinque.

1. no modelo de diferenciação de células plasmáticas Vitro Normal

Nota: PCes são gerados através de uma cultura de quatro etapas11,12,13.

  1. Diferenciação e amplificação de células b
    1. Utilize células de sangue periféricas de voluntários saudáveis para purificação de células B de memória.
    2. Dilua com 24,5 mL de meio RPMI 1640, 7,5 mL de sangue.
    3. Adicione 12,5 mL de gradiente de densidade de temperatura (por exemplo, Ficoll) para um tubo cônico estéril 50 mL. Delicadamente sobrepor o gradiente de densidade com o 32 mL de sangue diluído. Minimize a mistura das duas fases.
    4. Centrífuga 20 min a 500 x g com o travão de fora. Coletar os PBMCs através da interface de gradiente de densidade/plasma diluído e colocar as células em um tubo estéril 50 mL e completar a 45 mL com solução salina equilibrada do Hank.
    5. Centrifugar as células durante 5 min à 500 x g. Retire o sobrenadante cuidadosamente e manter a pelota.
    6. Adicione 45 mL de soro de vitela fetal RPMI1640/10% (FCS) e centrifugar 5min a 500 x g. Retire o sobrenadante cuidadosamente e manter a pelota. Adicione 30 mL de PBS/2% FCS.
    7. Remova células CD2 + usando grânulos magnético anti-CD2. Adicione 4 grânulos para a célula de um destino. Incubar 30 min a 4 ° C.
      1. Células grânulo-limite separadas de pilhas unbound usando um ímã para aplicação de separação de células. Recolher pilhas unbound e incubar o centrifugado com anti CD19 APC e anti anticorpos CD27 PE durante 15 minutos a 4 ° C (2 µ l de anticorpo para 106 células).
      2. Lave duas vezes em soro de cabra PBS/10%.
      3. Remova contaminantes eventos nas parcelas de ambos FSC e SSC. Plotar singletos em FSC-A vs FSC-H e SSC-A vs QUE CCD-H lotes para remover detritos e para selecionar a população total dos leucócitos. Selecione as células de memória B CD19/CD27 e CD19+CD27+.
      4. Purifica MBCs usando um classificador de pilha com uma pureza de 95%.
    8. Execute todas as etapas de cultura usando FCS IMDM e 10%, suplementado com 50mg/mL humana transferrina e 5 mg/mL de insulina humana.
    9. Placa purificado MBCs em placas de cultura de seis poços (1,5 x 105 MBCs/mL, 5 mL/poço), por 4 dias, com IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL).
      1. Adicionar Phosphorothioate CpG ODN 2006, CD40L solúvel humana recombinante com tag histidina (sCD40L; 50 ng/mL) e mAb anti-polyhistidine (5 mg/mL) para a ativação MBCs (Figura 1). Ativação por sCD40L ou ODN somente com a mesma citocina coquetel rende-se a menor amplificação12. A combinação de sinais de ativação descritos aqui com chumbo para o número máximo de ativadas as células B e PrePBs11,12 (Figura 1).
      2. Para gene expression profiling, purificar CD38 /CD20–– PrePBs, no dia 4, usando um classificador de pilha (Figura 2).
  2. Geração de célula plasmablastic
    1. No dia 4, conte as células.
    2. Células em placas de cultura de 12 poços da placa em 2.5 x 105/mL em 2 mL/bem.
    3. Induzir a diferenciação pela remoção dos oligonucleotides CpG e sCD40L e adição de um novo meio de cultura com uma citocina novo cocktail, incluindo IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL) (Figura 1). Células de cultura por 3 dias (do dia 4 ao dia 7) a 37 ° C.
    4. Para gene expression profiling, purificar CD38+/CD20– PBs, no dia 7, usando um classificador de pilha (Figura 2).
  3. Geração precoce de células plasmáticas
    1. No dia 7, conte as células.
    2. Placa de células em placas de cultura 12-poços em 5 x 105/mL em 2 mL/bem.
    3. Diferenciar o PB no início PCs usando o meio de cultura fresco com IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) e IFN-α (500 U/mL) por 3 dias a 37 ° C. Para gene expression profiling, purificar CD20–/CD38+/CD138+ PCs cedo, no dia 10, usando um classificador de pilha (Figura 2).
  4. Geração da pilha de plasma long-lived
    1. Diferencie os primeiros PCs em PCs há muito tempo viveu alterando as condições de cultura.
    2. Cultura de células em placas de cultura 12-poços em 5 x 105/mL em 2 mL/bem ou em placas de cultura de 24-poço em 1 mL/bem a 37 ° C, usando a IL-6 e células estromais condicionado médio e abril (200 ng/mL).
    3. Obter do estroma celular-condicionado médio por cultivo de células do estroma por 5 dias com meio de cultura. Filtrar o sobrenadante de cultura de pilha do estroma (0,2 µm) e congelar.
    4. Adicione 50% da mídia condicionada por células do estroma para culturas de PC com renovação toda semana. PCs long-lived gerados podem ser mantidos por meses13. Sobrevivência de longo prazo dos PCs poderia ser obtida com a IL-6 e abril apenas como relatado13.
    5. Secreção de Ig medida de citometria de fluxo classificado unid.
    6. Cultura de PCs em 106 células/mL de sobrenadante de cultura de 24 h e colheita. Medir a IgG e IgA usando humana enzima-lig da imunoabsorção kits de ensaio (ELISA)11,12,13. A secreção de IgG mediana variou de 10 pg/célula/dia, no dia 10 a 17 pg/célula/dia em 60 dias13.

2. molecular Atlas de B para diferenciação de PC

Nota: Nós construímos um acesso conveniente e aberto de ferramentas de Bioinformática para extrair e visualizar as informações mais proeminentes de dados Affymetrix GEP relacionados com PC diferenciação (GenomicScape)15. GEP estão publicamente disponíveis do banco de dados ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) incluindo purificada MBCs, PrePBs, PBs e EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 e E-MEXP-3034 e E BMPC-MEXP-2360 de14,15. Genomicscape é uma ferramenta Web livremente disponível.

  1. Seleção de B para PC dataset
    1. Selecione B para PC dataset no menu Procurar dados na ferramenta de bioinformatic de acesso aberto GenomicScape (http://www.genomicscape.com) chamado humano B células de células plasmáticas. Visualização do perfil de expressão do gene do gene original ou uma lista de genes está disponível usando a ferramenta de Relatório de expressão-Coexpression nas Ferramentas de análise disponíveis na página inicial.
  2. Análise de supervisão e análise de componentes principais (PCA)
    1. Selecione ferramentas de análise | webSAM para carregar a ferramenta de SAM.
    2. Escolha o dataset de células B humano de plasmócitos e selecione os grupos de amostras para comparar.
    3. Use os filtros diferentes disponíveis para aplicar as opções de filtragem de interesse.
    4. Para comparar perfis de expressão de gene com ferramenta de SAM, modifica as opções de filtragem, incluindo mudança de dobra, o número de permutações, taxa falsa da descoberta e o tipo de comparação. GenomicScape irá calcular a análise e fornecer genes diferencialmente expressados entre os grupos selecionados.
    5. Execute análise de componentes principais, selecionando Análise de componente Principal no menu de Ferramentas de análise .
    6. Escolha o dataset de células B humano de plasmócitos e selecione os grupos de interesse.
    7. Cole uma lista de genes de interesse ou selecionados genes de acordo com a variação. Para colar uma lista de genes, selecione Genomicscape para analisar uma lista de genes/ncRNAs, clique aqui... irá calcular PCA que poderia ser visualizada e baixada.

Resultados

O procedimento geral de diferenciação in vitro de PC normal é representado na Figura 1. Usando o protocolo apresentado aqui, nós poderia gerar uma quantidade adequada de células que não pode ser obtido com ex vivo amostras humanas. Embora o papel da rede complexa de fatores de transcrição envolvidos na diferenciação do PC tem sido investigado, os mecanismos de regulação principais redes de transcrição de diferenciação de PC permanecem pouco co...

Discussão

Em humanos, PC são raras células com estágios de diferenciação, ocorrendo em locais anatómicos que dificultam a caracterização biológica. Nós desenvolvemos um B in vitro para PC modelo de diferenciação usando sistemas de cultura de várias etapas onde várias combinações de moléculas de ativação e citocinas posteriormente são aplicadas a fim de reproduzir a diferenciação celular sequencial ocorrendo na diferentes órgãos/tecidos em vivo11,12<...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por concessões do INCA francês (Institut National du Cancer) Instituto (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) e câncer ITMO (MM & TT).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-CD2 magnetic beadsInvitrogen11159D
Anti-CD138-APCBeckman-Coulter B49219
Anti-CD19-APCBD555415
Anti-CD20-PBBeckman-Coulter B49208
Anti-CD27-PEBD555441
Anti-CD38-PEBeckman-Coulter A07779
Anti-histidineR&D SystemsMAB050
CpG ODN(PT)SigmaT*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human TransferinSigma-AldrichT3309
IFN-αMerckIntron A
IMDMGibco31980-022
Recombinan Human CD40L-hiR&D Systems2706-CL
Recombinant Human APRILR&D Systems5860-AP-010
Recombinant Human IL-10R&D Systems217-IL-
Recombinant Human IL-15Peprotech200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 ProteinR&D Systems202-IL-
Recombinant Human IL-6Peprotech200-06

Referências

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