JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

С помощью системы многоступенчатого культуры, мы доклад в vitro клетки B модели дифференцировки клеток плазмы.

Аннотация

Клетки плазмы (шт) выделяют большое количество антител и развиваются из клеток B, которые были активированы. Компьютеры являются редкие клеток, расположенных в костный мозг или слизистую оболочку и обеспечить гуморального иммунитета. Из-за их низкой частоты и местоположение, трудно изучение ПК в человека. Мы сообщили B для ПК модель в пробирке дифференциации, с использованием выбранных комбинаций цитокинов и активация молекул, которые позволяют воспроизводить последовательный клеточная дифференцировка, происходящих в естественных условиях. В этой модели в пробирке, памяти, клетки B (MBCs) будет дифференцироваться в предварительно plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), рано ПК и наконец, в долгоживущих ПК, с фенотипом близко к их коллег в здоровых индивидуалах. Мы также построили открытый доступ Биоинформатика инструменты для анализа наиболее известных информации от GEP данные, относящиеся к ПК дифференциации. Эти ресурсы могут использоваться для изучения человека B ПК дифференциации и в текущем исследовании, мы исследовали регулирование выражение гена эпигенетических факторов во время человека B PC дифференциации.

Введение

Дифференцировки лимфоцитов в плазматические клетки (шт) имеет важное значение для гуморального иммунитета и защиты узла против инфекций1. B для PC дифференциация ассоциируется с значительные изменения в транскрипции потенциала и метаболизм для размещения до антитела секрецию. Факторы транскрипции, которые контролируют Б PC дифференциации широко изучены и выявлены эксклюзивные сетей, в том числе B - и PC-определенного транскрипции факторы (TFs)2. В B-клеток PAX5, BCL6 и BACH2 TFs являются хранителями клетки B личность2,3. Индукции IRF4, PRDM1 кодировки BLIMP1 и XBP1 PC TF будет потушить B клетки генов и побудить скоординированного антитела секретирующих клеток транскрипционный анализ программы3,4,5. Эти скоординированные транскрипционный анализ изменения связаны с активацией транскрипции генов Ig вместе с переход от мембраны Присоединенная форма выделяется форму иммуноглобулин тяжелые цепи2,3, 4. B PC дифференциации связан с индукции генов, участвующих в эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи функции сочетанной с активацией ответ (УНР) разворачивались белка известен играть ключевую роль в ПК путем размещения синтез выделяется иммуноглобулины6,7. TF XBP1 играет важную роль в этой клеточной адаптации8,9,10.

B клетки и ПК являются ключевыми игроками гуморального иммунитета. Понимание биологических процессов, управления, производства и выживания нормальных клеток плазмы имеет решающее значение в терапевтических вмешательств, которые нужны для обеспечения эффективного иммунного ответа и предотвратить аутоиммунных заболеваний или иммунодефицит. PC являются редкими клетки с ранних стадиях дифференцировки происходящих в анатомических местах, которые препятствуют полной биологических характеристик, особенно в человека. С помощью системы многоступенчатого культуры, мы сообщали в пробирке B PC дифференциация модели. Эта модель воспроизводит последовательных ячеек дифференцировки и созревания, происходящих в различных органах в vivo11,12,13. В качестве первого шага клетки памяти B сначала активируются для четырех дней CD40 лиганд, oligodeoxynucleotides и цитокина комбинации и дифференцироваться в preplasmablasts (PrePBs). В качестве второго шага preplasmablasts вынуждены дифференцироваться в plasmablasts (PBs) путем удаления CD40L и oligodeoxynucleotides стимуляции и изменения цитокинов комбинации. В качестве третьего шага plasmablasts вынуждены дифференцироваться в начале ПК, изменив цитокина сочетание11,12. Четвертый шаг был введен получить полностью зрелые ПК путем культивирования этих ранних ПК с костного стромальные клетки кондиционером среднего или выбранные факторы роста13. Эти пожилые ПК могут выжить несколько месяцев в пробирке и выделяют большое количество иммуноглобулина (рис. 1). Интересно, что наши экстракорпоральное моделью резюмирует скоординированных transcriptional изменений и фенотип различных B PC этапов, которые могут быть обнаружены в естественных условиях11,12,13,14 ,15. Компьютеры являются редкие клетки и наша модель в пробирке дифференциация позволяет изучить человека B PC дифференциации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Протокол придерживается руководящих принципов, в соответствии с Хельсинкской декларации и соглашения центра больницы университета Монпелье биологических ресурсов.

1. в Vitro нормальной клетки плазмы дифференциация модели

Примечание: Компьютеры создаются через четыре этапа культуры11,12,13.

  1. B клетки усилители и дифференциация
    1. Используйте периферийные клетки крови от здоровых добровольцев для памяти клетки B очистки.
    2. Разбавьте 7,5 мл крови с 24,5 мл RPMI 1640 среды.
    3. Добавьте 12,5 мл градиент плотности комнатной температуры (например, Ficoll) в стерильных 50 мл Конические трубки. Аккуратно наложение градиента плотности с 32 мл разбавленной крови. Минимуму смешивания двух этапов.
    4. Центрифуга 20 мин на 500 x g с тормозом выкл. Сбор получения от интерфейса градиента разбавленной плазмы/плотность и место клетки в стерильных 50 мл трубки и завершить до 45 мл с Хэнка сбалансированного солевого раствора.
    5. Центрифуга клетки для 5 мин на 500 x g. Тщательно удалить супернатант и держать гранулы.
    6. В 500 x gдобавьте 45 мл сыворотки RPMI1640/10% плода теленка (FCS) и центрифуги 5 мин. Тщательно удалить супернатант и держать гранулы. Добавьте 30 мл PBS/2% FCS.
    7. Удаление CD2 + клеток с помощью анти CD2 магнитные бусы. Добавьте 4 Бусины для одной целевой ячейки. Инкубируйте 30 мин при 4 ° C.
      1. Отдельные шарик прыгните клетки от свободных клеток с помощью магнита для клетки разделения приложения. Собирать свободные клетки и клетки лепешка с анти CD19 APC и анти CD27 PE антитела Инкубируйте 15 минут при температуре 4 ° C (2 мкл антител для 106 клеток).
      2. Мыть два раза в PBS/10% козьего сыворотки.
      3. Удаление загрязняющих события на FSC и SSC участках. Участок фуфайки на FSC-A против FSC-H и SSC-A против SSC-H участков для удаления мусора и выбрать общий лейкоцитарный населения. Выбор ячейки памяти B CD19/CD27 и CD19+CD27+.
      4. Очищайте многобайтовой кодировки с помощью сортировщика ячейки с 95% чистоты.
    8. Выполните все культуры с использованием IMDM и 10% FCS, дополнена 50 мг/мл трансферрина и 5 мг/мл человеческого инсулина человека.
    9. Пластина очищенного MBCs в шести ну культуры пластин (1,5 x 105 MBCs/мл в 5 мл/хорошо), 4 дней, с Ил-2 (20 ед/мл), Ил-10 (50 нг/мл) и IL-15 (10 нг/мл).
      1. Добавить, гистидин тегами рекомбинантного человеческого растворимого CD40L фосфоротиоат CpG ODN 2006 (sCD40L; 50 нг/мл) и анти polyhistidine МАБ (5 мг/мл) для активации MBCs (рис. 1). Активация sCD40L или ODN только с же цитокина коктейль урожайности ниже амплификации12. Комбинация активации сигналов описанных здесь этилированного максимальное количество активации лимфоцитов и PrePBs11,12 (рис. 1).
      2. Для профилирования выражение генов, очистит CD38 /CD20–– PrePBs, в день 4, используя сортировщик клеток (рис. 2).
  2. Поколения Plasmablastic клетки
    1. На 4 день подсчитать количество ячеек.
    2. Плита клетки в 12-ну культуры пластин на 2,5 x 105/мл в 2 мл/хорошо.
    3. Вызвать дифференциации, удаление CpG олигонуклеотиды и sCD40L и добавлением новой питательной среды с новой цитокина коктейль, включая Ил-2 (20 ед/мл), Ил-6 (50 нг/мл), Ил-10 (50 нг/мл) и Ил-15 (10 нг/мл) (рис. 1). Культура клетки для 3 дней (от дня 4 до 7 день) при 37 ° C.
    4. Для профилирования выражение генов, очистит CD38+/CD20– PBs, день 7, с помощью сортировщика клеток (рис. 2).
  3. Ранние поколения клетки плазмы
    1. На 7 день подсчитать количество ячеек.
    2. Плиты клетки в 12-ну культуры пластин на 5 x 105/мл в 2 мл/хорошо.
    3. Дифференцировать PB в начале ПК с использованием свежей питательной среды с ИЛ-6 (50 нг/мл), IL-15 (10 нг/мл) и ИФН α (500 ед/мл) в течение 3 дней при 37 ° C. Для профилирования выражение генов, очистит CD20–/CD38+/CD138+ начале ПК, на день 10, используя сортировщик клеток (рис. 2).
  4. Поколение долгоживущих клеток плазмы
    1. Дифференцировать ранних ПК в долгой историей ПК путем изменения условий культуры.
    2. Культура клетки в 12-ну культуры пластин на 5 x 105/мл в 2 мл/хорошо или в 24-ну культуры пластин в 1 мл/хорошо при 37 ° C, с помощью ИЛ-6 и стромальных клеток кондиционером среднего и апреле (200 нг/мл).
    3. Получите стромальные клетки кондиционером среднего путем культивирования стромальных клеток на 5 дней с питательной среды. Фильтр супернатанта культуры стромальных клеток (0,2 мкм) и заморозить.
    4. Добавьте 50% стромальных клеток кондиционером СМИ PC культур с обновления каждую неделю. Сгенерированный PCs long-lived можно сохранить для13месяцев. Долгосрочной перспективе выживание ПК могут быть получены с ИЛ-6 и апреле только как сообщалось13.
    5. Мера Ig секрета из проточной цитометрии сортировка шт.
    6. Культура ПК на 106 клеток/мл за 24 часа и урожай культуры супернатант. Измерьте IgG и IgA, используя человека иммуноферментного анализа (ИФА) наборы11,12,13. Средний секрецию IgG, варьировались от 10 ПГ/Мобильный/день в день 10-17 pg/клеток/день на день 6013.

2. молекулярные Атлас b к дифференциации ПК

Примечание: Мы создали удобный и открытого доступа Биоинформатика инструменты для извлечения и визуализировать наиболее известных информацию от Affymetrix GEP данные, относящиеся к PC дифференцировки (GenomicScape)15. GEP публично доступны из базы данных ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/), включая очищенный MBCs, PrePBs, PBs и Пэк: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 и E-MEXP-3034 и BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape является webtool свободно доступны.

  1. Выбор B ПК набор данных
    1. B выберите набор данных ПК в меню Просмотреть данные в GenomicScape открытого доступа bioinformatic инструмент (http://www.genomicscape.com) под названием человека лимфоцитов в плазматические клетки. Визуализация профиль выражение гена уникальных гена или список генов доступен, с помощью средства Отчетов выражения-ИССЛЕДОВАНИџ в Инструменты анализа имеющихся на домашней странице.
  2. Под наблюдением анализ и анализ главных компонент (PCA)
    1. Выберите инструменты анализа | webSAM для загрузки средство SAM.
    2. Выберите набор данных, человека лимфоцитов в плазматические клетки и выберите группы образцов для сравнения.
    3. Используйте различные фильтры для применить параметры фильтрации интерес.
    4. Чтобы сравнить профили выражение гена с Сэм инструмент, измените параметры фильтрации, включая изменение раза, количество перестановок, ложные обнаружения скорость и тип сравнения. GenomicScape будет вычислять анализ и предоставлять гены, дифференциально выразил между выбранным группам.
    5. Запустите анализ главных компонентов, выбрав в меню Инструменты анализа Анализ основных компонентов .
    6. Выберите набор данных человека лимфоцитов в плазматические клетки и групп интересов.
    7. Вставьте список генов интерес или выберите генов по дисперсии. Чтобы вставить список генов, выберите анализировать список генов/ncRNAs, нажмите здесь... Genomicscape будет вычислять СПС, которые могут быть визуализированы и загружены.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Общая процедура экстракорпорального нормальный PC дифференциации представлена на рисунке 1. С использованием протокола, представленные здесь, мы могли бы генерировать достаточное количество клеток, которые не могут быть получены с ex vivo человека образ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В человека PC являются редкими клетки с этапами дифференцировки происходящих в анатомических местах, которые препятствуют полной биологической характеристике. Мы разработали в пробирке B PC дифференциация модель с использованием культуры многоступенчатой системы, где различные комби?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Эта работа была поддержана грантов от французского ИНКОВ (Институт национального du рака) институт (PLBIO15-256), НРУ (галстук-скип) и НИУ ИТМО рака (мм & TT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-CD2 magnetic beadsInvitrogen11159D
Anti-CD138-APCBeckman-Coulter B49219
Anti-CD19-APCBD555415
Anti-CD20-PBBeckman-Coulter B49208
Anti-CD27-PEBD555441
Anti-CD38-PEBeckman-Coulter A07779
Anti-histidineR&D SystemsMAB050
CpG ODN(PT)SigmaT*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human TransferinSigma-AldrichT3309
IFN-αMerckIntron A
IMDMGibco31980-022
Recombinan Human CD40L-hiR&D Systems2706-CL
Recombinant Human APRILR&D Systems5860-AP-010
Recombinant Human IL-10R&D Systems217-IL-
Recombinant Human IL-15Peprotech200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 ProteinR&D Systems202-IL-
Recombinant Human IL-6Peprotech200-06

Ссылки

  1. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
  3. Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
  4. Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
  5. Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
  6. Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
  7. Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
  8. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  9. Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
  10. Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
  11. Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
  12. Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
  13. Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
  14. Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
  15. Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).
  16. Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).
  17. Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
  18. Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
  19. Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
  20. Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
  21. Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
  22. Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
  23. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
  24. Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
  25. Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
  26. Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
  27. Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
  28. Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
  29. Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
  30. Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
  31. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
  32. Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
  33. McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
  34. Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
  35. Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
  36. Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
  37. Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877(2017).
  38. Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121(2018).
  39. Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
  40. Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
  41. Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4(2015).
  42. Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
  43. Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
  44. Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены