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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Mit mehrstufigen Kultur-Systeme, berichten wir eine in-vitro-B-Zelle zur Plasmazelle Differenzierung Modell.

Zusammenfassung

Plasmazellen (PCs) absondern, große Mengen von Antikörpern und entwickeln von B-Zellen, die aktiviert wurden. PCs sind seltene Zellen im Knochenmark oder in der Schleimhaut und humorale Immunität zu gewährleisten. Aufgrund ihrer niedrigen Frequenz und Position, die Untersuchung von PCs ist schwierig in der menschlichen. Wir berichteten einen B an PC in-vitro-Differenzierung Modell mit ausgewählten Kombinationen von Zytokinen und Aktivierung Moleküle, die es ermöglichen, um die sequentielle Zelldifferenzierung Auftritt in vivo zu reproduzieren. In diesem in-vitro-Modell, Speicher, B-Zellen (MBCs) in Pre-Plasmablasts (PrePBs), Plasmablasts (PBs), früh PCs unterscheiden werden und schließlich in langlebigen schließen-PCs mit einem Phänotyp zu ihren Gegenstücken in den gesunden Einzelpersonen. Wir bauten auch eine open-Access-Bioinformatik Werkzeuge um die prominentesten Informationen von GEP-Daten im Zusammenhang mit PC-Differenzierung zu analysieren. Diese Ressourcen können verwendet werden, um menschliche B PC Differenzierung und in der aktuellen Studie zu studieren, untersuchten wir Ausdruck Genregulation epigenetische Faktoren während der menschlichen B PC Differenzierung.

Einleitung

Die Differenzierung der B-Zellen zu Plasmazellen (PCs) ist wichtig für die humorale Immunität und schützen die Gastgeber gegen Infektionen1. B PC Differenzierung ist verbunden mit großen Veränderungen in Transkription Kapazität und des Stoffwechsels, zu Antikörper-Sekretion unterzubringen. Die Transkriptionsfaktoren, die B auf PC Differenzierung Steuern wurden ausgiebig untersucht und offenbarten exklusive Netzwerke einschließlich B - und PC-spezifische Transkription Faktoren (TFs)2. In B-Zellen sind PAX5, BCL6 und BACH2 TFs die Hüter der B-Zell-Identität-2,-3. Induktion von IRF4, PRDM1 BLIMP1 und XBP1 PC TF-Codierung wird B-Zell-Gene zu löschen und induzieren eine koordinierte Antikörper-sezernierenden Zelle transkriptionelle Programm3,4,5. Diese koordinierte transcriptional Änderungen sind verbunden mit Ig Gene Transcription Aktivierung zusammen mit einem Wechsel von der Membran-gebundener Form zu sekretierte Form von Immunglobulin schwere Kette2,3, 4. B zu PC Differenzierung ist mit Induktion von Genen, die im endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat funktioniert mit unfolded Protein Response (UPR) Aktivierung bekannt, eine wichtige Rolle im PC zu spielen, durch die Aufnahme der Synthesis von abgesondert, Immunglobuline6,7. Die TF-XBP1 spielt eine wichtige Rolle in diesem zellulären Anpassung8,9,10.

B-Zellen und PCs sind Hauptakteure der humoralen Immunität. Verständnis der biologisches Prozesse, Kontrolle der Produktion und das Überleben der normalen Plasmazellen ist von entscheidender Bedeutung im therapeutischen Interventionen, die müssen effiziente Immunantworten zu gewährleisten und verhindern Autoimmunität oder Immunschwäche. PC sind seltene Zellen mit Frühstadium Differenzierung findet in anatomischen Standorten, die volle biologische Charakterisierung, besonders beim Menschen behindern. Mit mehrstufigen Kultur-Systemen, haben wir einen in-vitro-B PC Differenzierung Modell berichtet. Dieses Modell bildet die sequentielle Zell-Differenzierung und Reifung, die in den verschiedenen Organen in Vivo11,12,13. In einem ersten Schritt B Speicherzellen sind zunächst vier Tage lang durch CD40-Liganden, Oligodeoxynukleotiden und Zytokin-Kombination aktiviert und in Preplasmablasts (PrePBs) zu unterscheiden. In einem zweiten Schritt werden Preplasmablasts induziert, in Plasmablasts (PBs) zu unterscheiden durch CD40L und Oligodeoxynukleotiden Stimulation entfernen und ändern die Zytokin-Kombination. In einem dritten Schritt werden Plasmablasts induziert, in frühen PCs zu unterscheiden, indem Sie ändern die Cytokine Kombination11,12. Ein vierter Schritt wurde eingeführt, um ausgereifte PCs bekommen durch die Kultivierung dieser frühen PCs mit dem Knochenmark Stromazellen Zellen bedingt Medium oder Wachstumsfaktoren13ausgewählt. Diese ältere PCs in-vitro-mehrere Monate überleben und absondern, hohe Mengen an Immunglobulin (Abbildung 1). Interessanterweise, rekapituliert unsere in-vitro-Modell die koordinierte transcriptional Änderungen und dem Phänotyp der verschiedenen B PC-Stufen, die erkannten in-vivo-11,12,13,14 ,15. PCs sind seltene Zellen und unsere in-vitro-Differenzierung Modell erlaubt, um menschliche B PC Differenzierung zu studieren.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien entsprechend der Deklaration von Helsinki und Vereinbarung von Montpellier Universität Krankenhauszentrum für biologische Ressourcen.

(1) in Vitro Normal Plasmazelle Differenzierung Modell

Hinweis: PCs entstehen durch ein vierstufiges Kultur11,12,13.

  1. B-Zell-Verstärkung und Differenzierung
    1. Verwenden Sie peripheren Blut Zellen von gesunden Probanden für das Gedächtnis B Zellen Reinigung.
    2. Verdünnen Sie 7,5 mL Blut mit 24,5 mL RPMI 1640 Medium.
    3. Ein steril 50 mL konische Röhrchen 12,5 mL Raumtemperatur Dichtegradient (z. B. Ficoll) hinzufügen. Sanft überlagern der Dichtegradient mit 32 mL verdünnte Blut. Die Vermischung der beiden Phasen zu minimieren.
    4. Zentrifugieren Sie 20 min bei 500 X g mit der Bremse aus. Sammeln Sie die PBMCs von der verdünnten Plasmadichte gradient Schnittstelle und legen Sie die Zellen in einer sterilen 50 mL Tube und füllen Sie bis 45 mL mit Hank es ausgeglichene Salzlösung.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 500 X g. Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und halten Sie das Pellet.
    6. 45 mL RPMI1640/10% fetalen Kälberserum (FCS) und Zentrifuge 5 min bei 500 X gzugeben. Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und halten Sie das Pellet. 30 mL PBS/2% FCS hinzugeben.
    7. Entfernen Sie CD2 + Zellen mit magnetischen Beads Anti-CD2. 4 Perlen für eine Zielzelle hinzufügen. 30 min bei 4 ° c inkubieren
      1. Separate Wulst-gebundenen Zellen aus ungebundenen Zellen mit Hilfe eines Magneten für Zelle Trennung Anwendung. Ungebundene Zellen sammeln und 15 Minuten bei 4 ° C (2 µL des Antikörpers für 106 Zellen) Zelle Pellet mit anti-CD19 APC und anti-CD27 PE Antikörper inkubieren.
      2. Zweimal in PBS/10% Ziegenserum waschen.
      3. Entfernen Sie kontaminierende Ereignisse auf FSC und SSC Grundstücken. Plot-Unterhemden auf FSC-A Vs FSC-H und SSC-A Vs SSC-H Plots, Ablagerungen zu entfernen und die Bevölkerung insgesamt Leukozyten auszuwählen. Wählen Sie B Speicherzellen CD19/CD27 und CD19+CD27+.
      4. MBCs, mit einer Zelle Sorter mit einer Reinheit von 95 % zu reinigen.
    8. Alle Schritte Kultur mit IMDM und 10 % FCS, ergänzt mit 50 mg/mL menschlichen Transferrin und 5 mg/mL Humaninsulin.
    9. Platte MBCs in sechs Brunnen Kultur Platten gereinigt (1,5 x 105 MBCs/mL in 5 mL/gut), für 4 Tage, mit IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) und IL-15 (10 ng/mL).
      1. Fügen Sie Phosphorothioat CpG ODN 2006, Histidin-markierten rekombinanten menschlichen lösliche CD40L (sCD40L; 50 ng/mL) und Anti-Polyhistidine mAb (5 mg/mL) für MBCs-Aktivierung (Abbildung 1). Aktivierung von sCD40L oder ODN nur mit der gleichen Zytokin cocktail Erträge niedriger Verstärkung12. Die Kombination der beschriebenen Aktivierung Signale hier verbleit, die maximale Anzahl von B-Zellen und PrePBs11,12 (Abbildung 1) aktiviert.
      2. Gene Expression Profiling, reinigen CD38–/CD20– PrePBs, am Tag 4, mit einer Zelle Sorter (Abbildung 2).
  2. Plasmablastic Zellgeneration
    1. Am Tag 4 zählen Sie die Zellen.
    2. Platte Zellen in Kultur 12-Well Platten 2,5 x 105/mL in 2 mL/gut.
    3. Differenzierung durch Entfernung von CpG-Oligonukleotiden und sCD40L und Zugabe von ein neues Nährmedium mit einer neuen Zytokin cocktail einschließlich IL-2 induzieren (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) und IL-15 (10 ng/mL) (Abbildung 1). Zellkulturen für 3 Tage (ab Tag 4 bis Tag 7) bei 37 ° C.
    4. Gene Expression Profiling, reinigen CD38+/CD20– PBs, an Tag 7, mit einer Zelle Sorter (Abbildung 2).
  3. Frühe Plasmazelle generation
    1. Am 7. Tag zählen Sie die Zellen.
    2. Typenschild Zellen in Kultur 12-Well-Platten an 5 x 105/mL in 2 mL/gut.
    3. PB in frühen PCs mit frischem Nährmedium mit IL-6 zu unterscheiden (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) und IFN-α (500 U/mL) für 3 Tage bei 37 ° C. Gene Expression Profiling, reinigen CD20–/CD38+/CD138+ frühen PCs, an Tag 10, mit einer Zelle Sorter (Abbildung 2).
  4. Langlebige Plasma Zellgeneration
    1. Frühen PCs in langlebigen PCs durch Ändern der Kulturbedingungen zu unterscheiden.
    2. Kultur der Zellen in Kultur 12-Well Platten am 5 x 105/mL in 2 mL/gut oder in Kultur 24-Well-Platten in 1 mL/auch bei 37 ° C mit IL-6 und Stromazellen Zelle konditionierten Medium und APRIL (200 ng/mL).
    3. Stromale Zelle konditioniertes Medium durch Kultivierung Stromazellen Zellen für 5 Tage mit Nährmedium zu erhalten. Filtern Sie die stromale Zellkultur überstand (0,2 µm) und Einfrieren.
    4. Fügen Sie 50 % der Stromazellen Zelle konditioniertes Medien PC Kulturen mit Erneuerung jede Woche. Generierte langlebigen PCs konnte für Monate13gehalten werden. Langfristige Überleben von PCs konnte mit IL-6 und APRIL nur als gemeldete13abgerufen werden.
    5. Maßnahme Ig Sekret Durchflusszytometrie sortiert PCs.
    6. Kultur-PCs bei 106 Zellen/mL für 24 h und Ernte Kultur überstand. Messen Sie IgG und IgA mit menschlichen Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Kits11,12,13. Die mittlere IgG-Sekretion reichte von 10 Pg/Zelle/Tag bei 10 bis 17 Pg/Zelle/Tag um Tag 6013.

2. molekulare Atlas von B zu PC-Differenzierung

Hinweis: Wir bauten eine bequeme und open Access Bioinformatik zu extrahieren und zu visualisieren, die prominenteste Informationen von Affymetrix GEP Daten in Bezug auf PC Differenzierung (GenomicScape)15. GEP sind öffentlich zugänglich, aus ArrayExpress-Datenbank (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) einschließlich der gereinigten MBCs, PrePBs, PBs und EPC: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 und E-MEXP-3034 und BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape ist eine frei verfügbare Webtool.

  1. Auswahl der B PC-Dataset
    1. Wählen Sie B PC-Dataset im Menü Durchsuchen Daten in GenomicScape open-Access Bioinformatic Tool (http://www.genomicscape.com) namens menschlichen B-Zellen zu Plasmazellen. Visualisierung des Genexpressionsprofils eindeutig Gens oder eine Liste von Genen steht zur Verfügung, mit dem Ausdruck Coexpression Bericht -Werkzeug in der Analyse-Tools zur Verfügung, auf der Startseite.
  2. Betreute Analyse und Hauptkomponentenanalyse (PCA)
    1. Wählen Sie Analysetools | WebSAM , das SAM-Tool zu laden.
    2. Wählen Sie das Dataset menschlichen B-Zellen zu Plasmazellen und die Gruppen der Proben zu vergleichen.
    3. Verwenden Sie die verschiedenen Filter zur Verfügung, um die Filteroptionen von Interesse gelten.
    4. Um gen Expressionsprofile mit SAM-Tools vergleichen, ändern Sie die Filteroptionen inklusive Falte, Anzahl der Permutationen, False Discovery Rate und die Art des Vergleichs. GenomicScape wird die Analyse zu berechnen und Gene differentiell zwischen den ausgewählten Gruppen.
    5. Führen Sie Hauptkomponentenanalyse Principal Component Analysis im Analyse-Tools -Menü auswählen.
    6. Wählen Sie das Dataset menschlichen B-Zellen zu Plasmazellen und die Gruppen von Interesse.
    7. Fügen Sie eine Liste von Genen von Interesse oder wählen Sie Gene nach der Varianz. Eine Liste von Genen einfügen, wählen eine Liste der Gene/NcRNAs analysieren klicken Sie hier... Genomicscape wird PCA berechnen, die visualisiert und heruntergeladen werden können.

Ergebnisse

Das gesamte Verfahren der in-vitro-normale PC-Differenzierung wird in Abbildung 1dargestellt. Mit den hier vorgestellten Protokoll, konnte wir ausreichenden Menge an Zellen generiert werden, die nicht mit ex-Vivo humanen Proben gewonnen werden konnte. Obwohl die Rolle des komplexen Netzwerks von Transkriptionsfaktoren PC Differenzierung beteiligt untersucht worden ist, bleiben die Mechanismen, die Regulierung der wichtigsten PC Differenzierung Transkription N...

Diskussion

In der Human-PC sind seltene Zellen mit Differenzierung Stufen statt an anatomischen stellen, die volle biologische Charakterisierung zu behindern. Haben wir einen in-vitro-B mit PC Differenzierung Modell mehrstufige Systeme wo sind verschiedene Kombinationen von Aktivierung Moleküle und Zytokine anschließend angewendet, um die sequenzielle Zelldifferenzierung im reproduzieren der verschiedene Organe/Gewebe in Vivo11,12,13.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von INCA Französisch (Institut National du Cancer) Institut (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) und ITMO Krebs (MM & TT).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-CD2 magnetic beadsInvitrogen11159D
Anti-CD138-APCBeckman-Coulter B49219
Anti-CD19-APCBD555415
Anti-CD20-PBBeckman-Coulter B49208
Anti-CD27-PEBD555441
Anti-CD38-PEBeckman-Coulter A07779
Anti-histidineR&D SystemsMAB050
CpG ODN(PT)SigmaT*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human TransferinSigma-AldrichT3309
IFN-αMerckIntron A
IMDMGibco31980-022
Recombinan Human CD40L-hiR&D Systems2706-CL
Recombinant Human APRILR&D Systems5860-AP-010
Recombinant Human IL-10R&D Systems217-IL-
Recombinant Human IL-15Peprotech200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 ProteinR&D Systems202-IL-
Recombinant Human IL-6Peprotech200-06

Referenzen

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