げっ歯類胎盤の Ex 生体灌流

要約

ここでは、ex vivo の母体血管灌流のプロトコルを提示して、試験的な物品を母体血管系に投与し、生体異物粒子または薬理学的薬剤の胎盤移動を評価し、改変に加えて胎盤生理学

要約

胎盤は胎児の生体異物暴露の障壁となる妊娠中の重要な器官であり、廃棄物のための栄養素の交換を媒介する。ここでは、単離されたラット胎盤を perfuse し、生体異物 ex in vivo の母体間の転座を評価するアッセイを説明する。さらに、この方法論を用いて、胎児への流動流や胎盤代謝などの生理的過程の評価を行うことができる。この技術は、医薬品候補または環境汚染物質の母体間動態を評価するのに適しています。現在の代替アプローチとは対照的に、この方法論は、分離された母体胎児脈管構造の評価を可能にし、全身性の神経または免疫の関与が取り除かれ、観察される生理的機能の変化を可能にする分離組織内の局所要因に起因する。

概要

形態学的構造および生理的反応性を維持することによって、臓器灌流は、代謝機能を分析するための受け入れられたシステムまたは組織ベースのアプローチとなっている。これらの灌流技術は、様々な薬理学的および機械的刺激に対する無傷の組織応答の ex インビボ検査を可能にする。ヒト胎盤の灌流は、最初に1958に記載され、クエン酸サイクルの代謝活性に対するホルモン効果を同定した。組織ホモジネートで以前に同定された、Troen とゴードンは、新規な生理学的アプローチ¹を使用して内分泌活性を明らかにする必要性を認識した。同じ時代に、単一灌流 (母体間または胎児間) 戦略は、大^2、3および小⁴動物モデルにおいて、糖、塩、および antipyrine の胎盤移動を理解するために説明された。インビボおよび ex インビボ二重灌流 (協調的母体および胎児灌流) 技術において、インビボ⁵および ex インビボ^6、7、8の方法論を用いて胎盤移動をさらに特徴付けることが記載された。伝送および走査型電子顕微鏡における技術の進歩は、灌流⁹後のヒト胎盤組織の構造的および機能的完全性を検証する研究者を可能にした。

ヒト胎盤組織および個々の子葉の灌流は最も関連性が高いが、薬理学的薬剤および環境汚染物質の急速な発達は、生体異物の早期スクリーニングのための動物の灌流モデルの使用を必要とする胎盤関門を越えて転送します。この胎盤灌流法は、より容易に達成可能で生理学的に関連するラット胎盤を使用して、胎盤関門を横切って転移を評価することができる。さらに、曝露後の一定期間にわたる胎盤関門を横切った流体の流れは、臍動脈から来る灌流液の体積を測定することによって評価することができる。母体および胎児の両方の循環からの胎盤灌流を可能にすることによって、この二重流全体の器官アプローチは、インビトロおよびインビボにおける現在のアプローチと比較して有利であり得る。この方法は、母体の側面を通る生体異物の投与を、臍静脈を通して胎盤を横切って現れる灌流液から測定することを可能にする、またはその逆である。ここで提示されるプロトコールは、母体子宮動脈から胎児区画までの 20 nm ポリスチレン (食品および医療製品で使用される一般的な nanoplastic) の移送と、胎盤を横切った流体の流れの関連減少を説明する複数の生理的、薬理学的、および毒物学的設定におけるこの方法の使用は、胎盤転移、代謝、および母体および/または胎児の流れに影響を及ぼす生理的変化を評価する。

プロトコル

すべての実験手順は、「ラトガース大学の機関動物ケアおよびユース委員会」によって承認されました。

1. 実験前の準備

注: これらのステップは、実験の数日前または数週間以内に実行することができます。

1. 容器室を改造する。
   注:図 1a、Bは、修正された単一容器室を示す。
   1. サーミスタセンサーをクリップの下から動かし、散水槽に自由に垂れ下がるように曲げてください (図 1b)。
   2. 標準の luer 接続のハブが付いている4インチの鈍い先端のステンレス鋼の針を取付けなさい、1 25 G および 1 23 G はサーミスタクリップの下で固定し、臍の脈管構造の cannulation を可能にするために3方向活栓を加える (図 1b)。
      注: 異なるゲージサイズのルアー接続は色分けされています。これは実験の間に容器の容易な同一証明を促進する。
2. 2つの70−100μ m ガラス micropipettes を取付けてください。これらの手順の詳細については、以下の参考文献^10,11を参照してください。
   注: これらの実験で一般的に使用されるチップ直径は、70−100μ m の範囲です。チップ径がこの範囲よりも大きいと、cannulation プロセスが困難になり、60μ m より小さいチップ径が cannulation 中に血管壁を穿刺することがあります。
3. 滅菌ナイロン縫合糸 (子宮動脈の近位および遠位端用) および黒色編組絹非滅菌縫合 (臍容器用) からの結合を準備する。前に説明したように、正方形の結び目を開始するか、または靴を結ぶためにループ縫合によって単一のネクタイを作る。
   注: 単一のネクタイは、一般的に作られており、粘着性の背景に作業を支援するためにシリコーンゴムの小さな層で満たさペトリ皿に保持される。
4. 1ミリモル/L、129.8 NaCl、5.4 KCl、0.5 いいえ₂PO₄、0.83 MgSO₄、19 NaHCO₃、1.8 CaCl₂、および5.5 グルコースを含む生理的塩溶液 (PSS) の 2 L を調製します。溶液に酸 (1 M 塩酸) または塩基 (1 N 水酸化ナトリウム) を数滴加えることにより pH を7.40 ±0.02 に調整し、調整された pH 測定を読む前に少なくとも20秒待ってください。PSS を冷蔵庫で使用できる状態になるまで保管して、汚染を減らしますが、2週間以上保管することはできません。
5. 各時点で「母体」および「胎児」の廃水を収集するためのラベルマイクロ遠心管、すなわち、「MBaseline、M10、M20、...」180分 timepoint まで。胎児の廃水についても同じ準備をしてください (FBaseline、M10、M20、...)。
6. 子宮 (80 mmHg) および臍 (50 mmHg) の灌流液圧力を維持するための循環浴温度および血圧モニターを含む、システム内で使用されるすべての装置を較正します。
7. 解剖室 (4 "直径 x 1" 深い) またはシリコーンゴムの層 (< 0.25 ") を充填することにより、循環ヒーター皿を準備します。この変更は、事前に行う必要があり、それはゴムが乾くために12−24時間かかります。
   注意: 皿が動いていないと組織が一貫した温度を維持しますように、再循環ヒーター/冷却皿の使用は、初心者の外科医のために推奨されます。

2. 手術所の準備と設備の平衡化

1. 灌流システムをサポートするすべての装置をオンにして、適切な機能をチェックします。PSS を冷蔵から室温に温めて取り外します。PSS は、灌流液と superfusate の両方として使用されます。
2. Superfusate 貯水池にガス混合物を送達するために、小さなバブリング石を配置します。一般的に使用される混合物には、21%O2、8% o2、3% o2、および 0% o2 があります。Superfusate 溶液に小さな気泡を提供するためにガスをオンにします。飛散を避けるために、ガスの配信を調整します。
3. 麻酔をチェックし、外科手術器具を配置し、縫合糸の関係を準備することによって動物を解剖する場所を配置する。冷却装置を切開して解剖ピンを回収し、チラー (または氷を取り出す) をオンにして、コールド PSS で解剖室 (ゴムシリコーンで裏打ちされた) を充填します。
4. 温めた PSS ですべてのチャンバ、針、ガラス micropipettes、チューブ、および貯水池を優しく満たし、慎重に監視し、微細なチップ搬送ピペットでそれらを吸引することにより、気泡を除去します。すべての3ウェイ stopcocks を「off」にしてピペットの方向に向け、ピペット内の流体を固定します。
5. 子宮 cannulation と臍帯 cannulation 用に指定された2つの鈍い先端の針のために準備された2つのガラス micropipettes のそれぞれに1つのネクタイを置きます。部屋の動きの間に損失を防ぐためにピペットおよび鈍い先端の針への安全な関係 (図 1c)。

3. 胎盤の収穫

1. 妊娠20日に妊娠した雌ラットを 5% イソフルランで約4分間、または動物が麻酔呼吸を示すまで。鼻コーンに動物を移動し、2.5% − 3% のイソフルランを投与して麻酔を維持する。つま先のピンチ反射の欠如によって無意識を確認します。
   注: 妊娠日20におけるラットの使用は、このプロトコールにおいて提示される。ただし、実験条件では、胎盤の評価を妊娠の早期に行う必要がある場合は、プロトコルは同じままである。
2. ラットカーカスの外に持ち上げて長い方法で広げることによって、選択の子宮の角 (右または左) を識別し、分離します。編組絹の縫合糸を使用して、卵巣の端と腟の末端で子宮動脈を結ぶ。子宮の角が付いている縫合線の中の卵巣を含んでいる。
3. 手術用はさみを使用して、卵巣タイと膣のタイの近位側に切り込みを加えて子宮角を切除し、子宮角を両端の縫合糸で結んだままにする。シリコーンゴムが並ぶ解剖皿に子宮の角を移し、冷 (4 ° c) PSS で満たした。右または左のホーンが選択されているかどうかにかかわらず、一貫性のために各実験で選択のための同じ側面を維持します。
   注: 胎児麻酔のために、仔は氷冷 PSS で保持されます。したがって、解剖室内の PSS 温度は、冷間循環浴または解剖チャンバによって維持され、氷上で維持されるべきである。
   注: この時点で、ダムを麻酔して、実験室 IACUC プロトコルの承認ごとに安楽死させることができる。この場合、安楽死は、気胸 (横隔膜を切断することによる) および母体の心臓の除去によって起こる。
4. 子宮の角を通って、シリコーンゴムに解剖ピンをそっと押し込み、卵巣側を左に、そして腟側を右にして子宮の脈管構造を視覚化する。これは子宮を安定させ、胎児コンパートメントの解剖の間にティッシュの動きを防ぐ。結紮の母体-胎盤-胎児ユニットを選択し、外科用はさみで子宮動脈と静脈を再使用します。選択された胎盤と胎児への子宮筋の近位および遠位を切断する。子宮の筋肉は、側に引っ張ることによって撤回することができます;それは無傷のままにしておくことが重要ですが、胎児の子犬を覆うからそれを引っ張ってください。
   注: 母体胎盤胎児単位の選択は、弓形動脈の両側の子宮動脈セグメントの長さに基づくべきである。長いセグメントは、より成功した cannulation を許可します。
5. 微細な鉗子とはさみを用いて、胎盤の胎児表面から羊水を取り除き、臍帯を避けるように注意する。
6. 結紮を解明し、胎児の子犬を分離するために臍帯を解きます。
7. 臍動脈 (厚い容器) および静脈 (より薄い容器) を識別する。臍動脈よりも僅かに短く切断することによって容易に識別できるように臍静脈に印を付ける。
8. 臍帯動脈と静脈を互いに優しく分離します。
9. 子宮血管系、子宮筋、胎盤、および臍帯を含む全胎盤ユニットは、切断および除去され得る。

4. 胎盤灌流

1. 子宮動脈の正しい遠位間配向を保持する解剖学的血流を維持し、胎盤ユニット (子宮脈管系、子宮筋、胎盤、および臍帯) を、充填された分離血管室に入れ暖かく、酸素化した PSS を使って。
2. それぞれの手で一組の微細な鉗子を使用して、cannulate は、ガラス micropipettes 上に子宮動脈の近位および遠位端を有する。
3. 以前にマイクロピペットに固定されていた無菌ナイロン縫合ネクタイを使用して子宮動脈をしっかりと固定します。
   注: 2 つのタイ・ループ (ノット) が必要になる場合があります。ただし、単一のタイループでは、より大きな調整が可能です。
4. Cannulate (胎児から母体への血流) を 23 G (より大きい) 針に照射し、黒色の編組シルク縫合糸で固定する。
5. Cannulate (母子血流) を 25 G (小さい) 鈍い針に通し、黒色の編組シルク縫合糸で固定する。
6. 胎盤灌流ステーションに移動し、気泡を防止するために、すべての stopcocks とチューブを埋め戻します。図 2に従ってすべてのチューブを接続します。
7. 母親の子宮動脈の遠位 cannulation の下に小さな体重のボートを置き、処置の間に出てくる流出物を捕まえるために胎児の臍静脈の針の cannulation。
8. 蠕動ポンプ、圧力コントローラ、圧力モニタをオンにして活栓を開き、圧力トランスデューサに向かってチューブを通る流体の流れを許可しますが、まだ胎盤にはありません。圧力を 80 mm Hg にゆっくりと増加させる。
9. ゆっくりと活栓を胎盤に回して、チャンバー内やネクタイ周りの漏れを観察します。
   注: 蠕動ポンプが高速で実行されている場合は、近位子宮 cannulation を再評価し、流体リークのためのネクタイ。特定された場合、リークを是正する必要があります。また注意してください、平均子宮動脈圧は一定のままであるが (80 mmHg に設定)、流体流速は、血管および胎盤の生理的応答に応じて可変であり得る。流体フローの定量化は、生体異物暴露に応答して実験変数として識別され得る。
10. 活栓を回して、臍動脈への体液の流れを許可する。蠕動ポンプ (図 3) または静水圧列で実装できる約50の mmHg に圧力を設定します。
11. すべての貯留槽 (子宮、臍、および superfusate) を補充して、実験全体を通して体液量を維持します。
    注意: 灌流が開始され、実験が進行していると、解剖皿に残っている仔を麻酔し、神経学的応答を惹起するために鉗子で仔をタッチすることによって生存性を評価することができる。仔の Exsanguination は子宮角の子宮摘出術によって起こる。それ以上の安楽死は承認された IACUC プロトコルによって完了することができる。この場合、冷蔵 PSS で羊膜嚢を開き、肋骨を切断して気胸を発生させる。

5. 模擬実験

1. PSS 灌流の cannulation および開始後、組織を30分間平衡化して、血管系が新しい流体の流れに適応できるようにします。ピペットで排水液を吸い上げ、それに応じてラベルの付いたマイクロ遠心チューブに保存します。
2. 平衡化の後、マイクロ遠心管の計量艇の両方から10分間の排水を回収し、子宮動脈と臍静脈を通して現れる体液量を測定することにより、ベースライン灌流を確立する。
3. 遠位子宮動脈および臍静脈からの廃水を集めることによって10分間隔でサンプルコレクションを開始してください。例えば、20 nm のローダミン標識ポリスチレンナノ粒子 (8 x 10¹⁴粒子/ml) の900μ l のボーラス投与量を 0.01% の界面活性剤で懸濁させ、子宮動脈等量線に生体異物の時間経過を識別する。胎盤関門を横切るナノ粒子
   注: これらの廃水のサンプルは液体 (生体異物、薬理学的、または代謝物) 内の汚染物の測定を可能にし、子宮動脈を通して、または胎盤を渡ってそして胎児コンパートメントに液体の流れの速度を提供する (図 4)。
4. ボーラス注入後、遠位子宮動脈および胎児臍静脈廃水からの試料を、注入後に合計180分間、10分ごとに採取する。

6. 装置のクリーニング

1. 各実験の後、胎盤ユニットをピペットから取り出します。すべての縫合糸は、将来の実験で再利用されるように保存され得る。胎盤組織は、さらなる組織学的または機械的研究のために保存されてもよい。
2. 70% エタノールで灌流システムのすべてのチューブとカニューレを洗浄し、続いて蒸留水と真空乾燥します。
   注: チューブまたはピペットが変色し始めたり、破損していると思われる場合は、次の実験の前に交換してください。さらに、実験コホートが完了した後 (例えば、単一の汚染物質に関するすべての研究)、交差汚染を防止するためにチャンバ内のすべてのチューブを交換する。

結果

図 5は、エバンの青色染料を使用した原理実証実験を示しており、システムをテストし、適切な流体および胎盤バリア機能を可視化し、胎児コンパートメントへの封じ込め移動を防止します。エバンの青い染料が到達し、このシステム内の胎盤の組織を灌流しました (図 5a)。さらに調査すると、エヴァンの青い染料が胎児の臍静脈に入らなかったことは明らかである (図 5b)、エヴァンの青い染料はアルブミンに結合していると予想される。

図 6は、このプロトコルで説明されている模擬実験のデータを示しています。子宮動脈および胎児臍静脈の遠位端からの廃液サンプルを各10分セグメントで測定し、そのボーラス投与量を母体の子宮動脈に投与した後の経時的な流動流れを評価した (図 6)。ポリスチレン輸液が同定された後10分以内に胎児室への体液移動が減少した。それが起こるときの時間経過中の胎児区画へのポリスチレンの移送を定量化するために、各時点からの灌流液の25μ l を96ウェルプレートに入れて複製し、サンプル蛍光を測定した。蛍光は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて 546/575 nm (ex/em) での分光学的読み取りにより測定した。胎児コンパートメントへのポリスチレン移送は10分以内に発生し、20分でピークに達し、90分間継続した (図 6b)。

灌流胎盤組織のサブセットは、組織病理学および形態学的評価のために保存された。組織をホルマリン固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色し、ボード認定獣医病理医によって検討した。これらの専門家は、ローダミン標識ポリスチレンのボーラス用量で PSS、または PSS のみによって胎盤灌流の構造的異常を特定しました。

図 1: 変更された単一容器室。(A) 変更されたチャンバの概要。(B) 血管室内に固定された鈍い先端の針のクローズアップ画像。赤い矢印は、臍 cannulation のために針を適所に保持するように変更されたサーミスタクリップを示しています。(C) 組織 cannulation のために調製した4カニューレの代表的な画像。赤い矢印は4つのカニューレのそれぞれを指しています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: 胎盤灌流室のより近い図。(A) これは、圧力トランスデューサに取り付けられたチューブと、近位母体子宮動脈のカニューレ、または「流入」を表す。圧力は、文献で定義されるように一定の 80 mmHg に設定される。(B) これは、灌流中に胎盤組織を取り囲む superfusate のチャンバードレンポートを表す。(C) これは、灌流中に温めた PSS で胎盤を浴びる superfusate のチャンバ流入を表す。(D) これは、子宮灌流から流出物が採取され得る遠位母体子宮ポートを表す。(E) これは温度の港を表し、容器の部屋は実験室中一貫した温度を維持するために温度計およびヒーターに付すことができる。(F) これは、臍動脈 cannulation を表す。臍動脈は、胎盤のレベルで逆流流を可能にするために 50 mmHg に加圧される。(G) これは、臍静脈廃水収集を表す。灌流中に胎児室に向かって流れる体液をここに集めます。(H) これは、灌流システムの中心であり、これは、胎盤がカニューレされて、散水を通して保たれる。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: 胎盤灌流システムのビュー。(AおよびB) 子宮動脈を通して灌流液の 80 mmHg を監視し、維持するのに使用される圧力制御システム。(C) これは、灌流室の熱調節を表す。(D) 顕微鏡。(E) 灌流室。(F) 重力を与えられた臍動脈灌流を 50 mmHg に設定した。(G) 胎盤 superfusate PSS を充填および排出するために使用される蠕動ポンプ。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: 胎盤灌流システムの概略この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5: エヴァンの青い染料を使った、原理実証実験の代表的な画像(AおよびB) エバンの青色が子宮脈管系、子宮筋、および胎盤を perfuse するが、アルブミン結合による胎盤関門を越えることはないという原理証明。緑色の矢印は、胎盤から母体の循環に戻る青色の静脈排水を示す。赤い矢印は、胎児区画に向かう臍静脈の流出を示す。青色染料の不足に注意してください。(C) 臍静脈から流出した流出物を捕集する代表的な画像である。赤い矢印は、収集前のドロップ形成を示しています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 6: 模擬実験から得られたデータローダミン標識ポリスチレンナノ材料の蛍光測定は、ベースライン蛍光に対して正規化され、(A) 子宮動脈および (B) 胎児臍静脈廃水の収集を介して行う。ベースライン蛍光±標準誤差 (SE) に正規化された平均値。*: p < 0.05 および T: p < 分散分析 (ANOVA) を介して0.1。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この灌流法により、胎盤関門および子宮脈管系と栄養膜層の生理的機能を迅速に評価することができます。母体の子宮動脈の近位端までの Cannulation および灌流は、発達中の胎児に血液を送ることを担うこの主要な血管を通る母体血流の生理学を模擬する。この方法論は、孤立した母体、胎盤および臍脈管構造の生理学的評価を可能にし、したがって生理学の変化は血管病変として同定することができる。免疫および神経 innervations は、元インビボ手順で除去される。したがって、適切な評価を行うためには、血管壁に涙や穿刺を発生させたり、気泡を除去したりしないように、これらの血管を慎重に cannulate することが重要です。ガス塞栓は、血管の内皮層への損傷を引き起こし、血管を妨害することがある。郭清中の子宮、胎盤と胎児の間の血管の接続を維持することによって、体液の評価と胎児への転座を観察することができます。生体異物の投与により、この場合 20 nm のポリスチレンは、子宮動脈の遠位端に及び胎盤を通って胎児コンパートメントに動力学し、180分の時間経過にわたる廃水の分析によって評価することができる。

二重灌流モデルが記載され、母体から胎児コンパートメントへの粒子および流体の移送がこの記事でモニターされたが、評価は胎児から母体コンパートメントまで逆に行うこともできる。ここで記載される方法の1つの制限は、遠位子宮静脈がカニューレまたはサンプリングされなかったことである。将来の研究では、特に胎児から母体への移動に焦点を当てたものは、遠位子宮血管を cannulate してサンプリングすることが重要であろう。この模擬実験から採取した廃水は、生体異物の移動を評価するために使用されました。しかしながら、内分泌および分子胎盤機能または胎児栄養に関する幅広い評価が行われ得る。

このプロトコルの長所は、そのマイナーな制限をはるかに上回ります。この調製は、実験条件を評価するために器官全体の生理的構造および完全性を維持する。Ex インビボ胎盤灌流は、細胞内から全動物曝露までの科学的な進展であり、適切に生殖リスク評価を決定する。これは、胎盤薬理学的薬物の性質、薬物動態、毒物学、生理学、および母子胎児医学を評価する研究にとって貴重な技術であると考えられる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile	Surgical Specialties Look	AACO805
Fine forceps	FST by Dumont Switzerland	11252-20
Fine scissors	FST by Dumont Switzerland	14060-10
Glass cannula pack	Living Systems Instrumentation (LSI)	GCP-75-100
Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED	Fisherbrand	02-681-299
Non-serrated fine curved micro serrefine clamps	InterFocus	18052-03
Perfusate pump	ISMATEC	ISM795C
Pressure monitor	Living Systems Instrumentation (LSI)	Mode PM-4
Self-heating single vessel chamber	Living Systems Instrumentation (LSI)	CH-1
Servo Pump	Living Systems Instrumentation (LSI)	ModelPS-200-P
Stainless steel blunt needle 23 gauge	Component Supply Co.	04651-01
Stainless steel blunt needle 25 gauge	Component Supply Co.	07116-01
STERILE Nylon Suture	AROSurgical Instruments Corporation	T04A00N07-13
Stopcock	Sedation Resource	6-205-04
Temperature Controller	Living Systems Instrumentation (LSI)	Model TC-09S