Perfusão ex vivo da placenta de roedores

Resumo

Aqui é apresentado um protocolo de perfusão vascular materno-fetal ex vivo para possibilitar a administração de um artigo de teste na vasculatura materna e avaliar a transferência placentária de partículas xenobióticas ou agentes farmacológicos, além de alterações na Fisiologia placentária.

Resumo

A placenta é um órgão chave durante a gravidez que serve como uma barreira à exposição xenobióticos fetal e Medeia a troca de nutrientes para o desperdício. Um ensaio é descrito aqui para perfuse uma placenta isolada do rato e avalie o translocação materno-à-fetal de xenobióticos ex vivo. Além disso, a avaliação de processos fisiológicos como o fluxo de fluidos para o feto e o metabolismo placentário pode ser realizada com essa metodologia. Esta técnica é adequada para avaliar a cinética materno-fetal de candidatos farmacêuticos ou contaminantes ambientais. Em contraste com as abordagens alternativas atuais, esta metodologia permite a avaliação da vasculatura materna-fetal isolada, com o comprometimento neural ou imune sistêmico removido, permitindo que quaisquer alterações observadas na função fisiológica sejam atribuíveis a factores locais dentro do tecido isolado.

Introdução

Ao manter a estrutura morfológica e a responsividade fisiológica, a perfusão de órgãos tem sido uma abordagem aceita baseada em sistema ou tecido para análise da função metabólica. Estas técnicas da perfusão permitem o exame ex vivo de respostas intactas do tecido a uma variedade de estímulos farmacológicos e mecânicos. A perfusão da placenta humana foi descrita inicialmente em 1958 para identificar os efeitos hormonais na atividade metabólica do ciclo do ácido cítrico; previamente identificados em homogeneatos teciduais, Troen e Gordon reconheceram a necessidade de esclarecer a atividade endócrina usando uma nova abordagem fisiológica¹. Na mesma época, as estratégias de perfusão única (materno-fetal ou fetal-materna) foram descritas em grandes modelos animais^2,3 e pequenos⁴ para compreender a transferência placentária de açúcares, sais e antipirinos. Técnicas in vivo e ex vivo de perfusão dupla (perfusão materna e fetal coordenada) foram descritas para caracterizar ainda mais a transferência placentária utilizando metodologias in vivo⁵ e ex vivo^6, 7,8. Os avanços tecnológicos na microscopia eletrônica de transmissão e varredura permitiram aos pesquisadores verificar a integridade estrutural e funcional dos tecidos placentários humanos após a perfusão⁹.

Enquanto a perfusão de tecidos placentários humanos e cotiledôneas individuais é mais relevante, o rápido desenvolvimento de agentes farmacológicos e contaminantes ambientais requer o uso de um modelo de perfusão animal para a triagem precoce de xenobióticos transferência através da barreira placentária. Este método placentária da perfusão permite a avaliação da transferência através da barreira placentária usando a placenta mais facilmente atingível e fisiologicamente relevante do rato. Além, o fluxo fluido através da barreira placentária durante um período de tempo depois que uma exposição pode ser avaliada medindo o volume de perfusato que vem da artéria do cordão umbilical. Em virtude de permitir a perfusão placentária das circulações maternas e fetal, esta aproximação do órgão do duplo-fluxo pode ser vantajosa comparada às aproximações in vitro e in vivo atuais. Este método permite a administração de um xenobiótico através do aspecto materno a ser medido a partir de perfusato que emerge através da placenta através da veia umbilical, ou vice-versa. O protocolo aqui apresentado descreverá a transferência de poliestireno de 20 nm (um nanoplástico comum usado em alimentos e produtos médicos) da artéria uterina materna para o compartimento fetal e uma diminuição associada no fluxo de fluido através da placenta para ilustrar o uso desse método em múltiplos ajustes fisiológicos, farmacológicos e toxicológicos para avaliar a transferência placentária, o metabolismo e as alterações fisiológicas que afetam o fluxo materno e/ou fetal.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Rutgers.

1. preparação antes do experimento

Observação: essas etapas podem ser executadas dentro de dias/semanas antes do experimento.

1. Modifique a câmara do vaso.
   Nota: a Figura 1a, B mostra a câmara de vaso único modificada.
   1. Mova o sensor de termistor de baixo do clipe e dobre-o para que ele pendure livremente no banho de perfusão (Figura 1b).
   2. Instale duas agulhas de aço inoxidável Blunt-Tip de 4 polegadas com os cubos padrão da conexão do luer, 1 25 g e 1 23 g fixados abaixo do grampo do termistor e adicione um torneira de 3 vias para permitir o canulação da vasculatura do cordão umbilical (Figura 1b).
      Nota: as conexões do luer de tamanhos diferentes do calibre são cor codificadas. Isso facilita a fácil identificação dos vasos durante e após o experimento.
2. Instale dois micropipettes de vidro de 70 − 100 μm. Para obter mais informações sobre esses procedimentos, revise as seguintes referências^10,11.
   Nota: o diâmetro da ponta comumente utilizado nestes experimentos está na faixa de 70 − 100 μm. os diâmetros da ponta maiores do que esta escala podem adicionar a dificuldade ao processo do canulação quando os diâmetros da ponta menores do que 60 μm podem perfurar a parede vascular durante o canulação.
3. Prepare laços da sutura de nylon estéril (para extremidades proximal e longe do ponto de origem da artéria uterine) e da sutura não-estéril de seda trançada preta (para os vasos do cordão umbilical). Faça laços únicos por sutura looping como para iniciar um nó quadrado ou amarrar um sapato, como descrito anteriormente¹¹.
   Nota: as únicas gravatas são feitas geralmente e mantidas em uma placa de Petri enchida com uma camada pequena de borracha de silicone para ajudar a trabalhar em um fundo pegajoso.
4. Preparar 2 L de solução salina fisiológica (PSS) contendo, em mmol/L, 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH₂po₄, 0,83 MgSO₄, 19 NaHCO₃, 1,8 CAcl₂e 5,5 glicose. Ajuste o pH para 7,40 ± 0, 2 Adicionando lentamente algumas gotas de ácido (1 M de ácido clorídrico) ou base (1 N hidróxido de sódio) à solução e aguarde pelo menos 20 s antes de ler a medição de pH ajustada. Armazene o PSS até estar pronto para uso na geladeira para reduzir a contaminação, mas não armazene por mais de 2 semanas.
5. Tubos de microcentrífuga de etiquetas para coleta de efluentes "maternos" e "fetais" em cada ponto de tempo, ou seja, "MBaseline, M10, M20,..." até o ponto de tempo de 180 min. Prepare o mesmo para efluentes fetais (FBaseline, M10, M20,....).
6. Calibrar todos os equipamentos utilizados no sistema, incluindo a temperatura do banho circulante e os monitores de pressão arterial associados à manutenção das pressões uterinas (80 mmHg) e do cordão umbilical (50 mmHg).
7. Prepare uma câmara de dissecção (4 "de diâmetro x 1" de profundidade) ou um prato aquecedor circulante preenchendo uma camada (< 0,25 ") de borracha de silicone. Esta modificação deve ser feita adiantado e como tomará 12 − 24 h para que a borracha seque.
   Nota: o uso de um aquecedor de recirculação/prato de refrigeração é recomendado para cirurgiões novatos, como o prato não se moverá e o tecido manterá uma temperatura consistente.

2. preparação da estação cirúrgica e equilibração do equipamento

1. Ligue todos os equipamentos que suportam o sistema de perfusão para verificar a função adequada. Retire o PSS da refrigeração e aqueça à temperatura ambiente. O PSS será usado como um perfusato e um superfusate.
2. Coloc uma pedra borbulhando pequena para entregar uma mistura do gás no reservatório do superfusate. As misturas comumente usadas incluem 21% O_2,3% o 2,3% o₂e 0% o₂. Ligue o gás para fornecer pequenas bolhas para a solução superfusate. Ajuste a entrega do gás para evitar espirrar.
3. Organize a estação de dissecação de animais, verificando o anestésico, organizando equipamentos cirúrgicos e preparando laços de sutura. Prepare a câmara de dissecação coletando os pinos de dissecação, girando sobre o refrigerador (ou recuperando o gelo), e enchendo a câmara de dissecação (alinhada com o silicone de borracha) com PSS frio.
4. Encha delicadamente todas as câmaras, agulhas, micropipettes de vidro, tubulação, e reservatórios com o PSS aquecido, observando com cuidado para e eliminando bolhas de ar aspiração os para fora com uma pipeta fina da transferência da ponta. Gire todos os stopcocks de 3 vias com "off" voltado para a direção da pipeta para fixar o fluido dentro da pipeta.
5. Coloque um único empate em cada uma das duas Micropipetas de vidro preparadas para canulação uterina e nas duas agulhas de pontas sem corte designadas para canulação umbilical. Fixe os laços com as pipetas e as agulhas de pontas sem corte para evitar perdas durante os movimentos das câmaras (Figura 1C).

3. colheita placental

1. Anestesiam um rato fêmea grávido no dia gestational 20 com o isoflurano de 5% por aproximadamente 4 minutos ou até que o animal apresente a respiração trabalhada. Mova o animal para o cone do nariz e administre 2,5% − 3% de isoflurano para manter a anestesia. Confirme a inconsciência por uma falta de reflexo de pitada de dedo do pé.
   Nota: o uso de um rato no dia gestacional 20 é apresentado neste protocolo. No entanto, o protocolo permanece o mesmo se as condições experimentais exigirem que a avaliação placentária ocorra precocemente na gestação.
2. Identifique e isole o chifre uterine (direito ou esquerdo) da escolha levantando para fora e espalhando para fora longo-maneiras fora da carcaça do rato. Usando uma sutura de seda trançada, amarre a artéria uterina na extremidade do ovário e na extremidade vaginal do chifre. Inclua o ovário dentro da sutura com o chifre uterine.
3. Usando tesouras cirúrgicas, extirpar afastado o chifre uterine fazendo cortes no lado proximal do laço do ovário e do lado longe do ponto de origem do laço vaginal, deixando o chifre uterine amarrado fora com as suturas em ambas as extremidades. Transfira o chifre uterine no prato de dissecação alinhado com a borracha de silicone e enchido com o PSS frio (de 4 ° c). Independentemente de se escolher a buzina direita ou esquerda, mantenha esse mesmo lado para seleção em cada experimento para consistência.
   Nota: para a anestesia fetal, filhotes são mantidos em gelo-frio PSS. Conseqüentemente, a temperatura de PSS dentro da câmara de dissecação é mantida pelo banho de circulação refrigerados ou a câmara de dissecação deve ser mantida no gelo.
   Nota: neste ponto a represa anestesiada pode ser eutanalizada por aprovação do protocolo IACUC de laboratório. Neste caso, a eutanásia ocorre através de pneumotórax (cortando o diafragma) e remoção do coração materno.
4. Empurre delicadamente um pino de dissecação através do chifre uterine na borracha de silicone, com o lado do ovário à esquerda e ao lado vaginal à direita para visualizar o vasculature uterine. Isso estabilizará o útero e evitará o movimento do tecido durante a dissecção do compartimento fetal. Selecione uma unidade materno-placenta-fetal central ao chifre e ligadura a artéria e a veia uterine com tesouras cirúrgicas. Corte o músculo uterino proximal e distal à placenta e ao feto selecionados. O músculo uterino pode ser retraído puxando-o para o lado; é importante deixá-lo intacto, mas afastá-lo de cobrir o filhote fetal.
   Nota: a seleção da unidade materno-placenta-fetal deve basear-se no comprimento do segmento da artéria uterina em ambos os lados da artéria arcubada. Segmentos mais longos permitirão canulação mais bem-sucedida.
5. Usando pinças finas e tesouras, retire a membrana amniótica da superfície fetal da placenta, tendo o cuidado de evitar o cordão umbilical.
6. Desvendar e ligadura o cordão umbilical para separar o filhote fetal.
7. Identifique a artéria umbilical (vaso mais espesso) e a veia (vaso mais fino). Marque a veia umbilical para fácil identificação cortando-a ligeiramente mais curta do que a artéria umbilical.
8. Separe suavemente a artéria umbilical e a veia um do outro.
9. Toda a unidade placentária, incluindo a vasculatura uterina, o músculo uterino, a placenta e o cordão umbilical, podem ser cortadas e removidas.

4. perfusão placentária

1. Manter a circulação sanguínea anatômica que retém a orientação distal-à-proximal correta da artéria uterine, coloc a unidade placentária (compor do vasculature uterine, do músculo uterine, da placenta, e do cabo de cordão umbilical) na câmara isolada modificada do vaso enchida com PSS quente e oxigenado.
2. Usando um par de fórceps fino em cada mão, canular as extremidades proximal e longe do ponto de origem da artéria uterine nas micropipettes de vidro.
3. Fixe firmemente a artéria uterine usando o laço de sutura de nylon estéril fixado previamente na micropipeta.
   Nota: os laços do dois-laço (nó) podem ser necessários; Entretanto, um único laço do laço permite um ajuste mais grande.
4. Cannulate a artéria do cordão umbilical (fluxo fetal-à-materno do sangue) na agulha de 23 G (maior) e prenda-a com a sutura de seda trançada preta.
5. Cannulate a veia do cordão umbilical (fluxo de sangue materno-à-fetal) na agulha Blunt de 25 G (menor) e prenda-a com a sutura de seda trançada preta.
6. Mova-se para a estação de perfusão placentária e preencha todos os stopcocks e Tubings para evitar bolhas de ar. Conecte todos os Tubings de acordo com a Figura 2.
7. Coloc os barcos de peso pequenos o canulação longe do ponto de origem da artéria uterine materna e a canulação da agulha da veia de cordão umbilical fetal para travar o efluente que emergirá durante o procedimento.
8. Gire sobre a bomba peristáltica, o controlador de pressão, e o monitor da pressão e abra o torneira para permitir o fluxo fluido através da tubulação para o transdutor de pressão, mas não ainda à placenta. Aumente lentamente a pressão para 80 mm Hg.
9. Gire lentamente o torneira à placenta para abrir e prestar atenção para fugas dentro da câmara e em torno dos laços.
   Nota: se a bomba peristáltica estiver a funcionar a alta velocidade, reavalie a canulação uterina proximal e os laços para fugas de fluido. Se identificado, os vazamentos devem ser remediados. Observe também, enquanto a pressão média da artéria uterina permanecerá constante (definida para 80 mmHg), a vazão do fluido pode ser variável dependendo das respostas fisiológicas vasculares e placentárias. A quantificação do fluxo de fluido pode ser identificada como uma variável experimental em resposta à exposição xenobiótica.
10. Gire o torneira para permitir o fluxo fluido na artéria do cordão umbilical. Definir a pressão para aproximadamente 50 mmHg, que pode ser implementado com uma bomba peristáltica (Figura 3) ou uma coluna hidrostática.
11. Reabasteça todos os reservatórios (uterino, umbilical e superfusato) para manter o volume de fluido durante todo o experimento.
    Nota: uma vez iniciada a perfusão e o experimento está em andamento, os filhotes anestesiados que permanecem no prato de dissecação podem ser avaliados quanto à viabilidade, tocando os filhotes com fórceps para provocar uma resposta neurológica. A exsanguação dos filhotes ocorrerá por meio da histerectomia do chifre uterino; a eutanásia mais adicional pode ser terminada através dos protocolos aprovados de IACUC. Neste caso, abrindo o saco amniótico no PSS frio e criando um pneumotórax cortando as costelas.

5. experimento simulado

1. Após a canulação e a iniciação da perfusão de PSS, deixe os tecidos equilibram por 30 minutos para permitir que o vasculatura ajuste ao fluxo fluido novo. Sucção até o efluente por uma pipeta e salvá-lo em um tubo de microcentrífuga correspondentemente rotulado.
2. Após a equilibração, estabelecer a perfusão basal através da coleta de efluentes por 10 min de ambos os barcos de pesagem em tubos de microcentrífuga e medindo o volume de fluido que emerge através da artéria uterina e da veia umbilical.
3. Iniciar a coleta da amostra em intervalos de 10 minutos coletando-se os efluentes da artéria uterina distal e da veia umbilical. Por exemplo, administrar uma dose de 900 μL de bolus de 20 nm de nanopartículas de poliestireno com rótulo de rhodamina (8 x 10¹⁴ partículas/ml) suspenso em 0, 1% surfactante para a linha perfusing a artéria uterina para identificar a passagem do curso de tempo de xenobiótico nanopartículas através da barreira placentária.
   Nota: estas amostras de efluente permitirão a medição de contaminantes dentro do fluido (tanto xenobiótico, farmacológico ou metabólito) e fornecer a taxa de fluxo de fluido através da artéria uterina ou através da placenta e para o compartimento fetal ( Figura 4).
4. Após a infusão de bolus, coletar amostras da artéria uterina distal e efluente da veia umbilical fetal a cada 10 min para um total de 180 min após a infusão.

6. limpeza do equipamento

1. Após cada experimento, retire a unidade placentária das pipetas. Todas as suturas podem ser salvas para serem reutilizadas em experimentos futuros. O tecido placentário pode ser guardado para estudos histológicos ou mecanísticos adicionais.
2. Limpe todos os Tubings e cânulas do sistema de perfusão com 70% de etanol seguido de água destilada e vácuo seco.
   Nota: se Tubings ou pipetas começarem a descolorir ou aparecerem danificados, substitua antes do próximo experimento. Além disso, após a conclusão de uma coorte experimental (por exemplo, todos os estudos pertencentes a um único contaminante), substitua todos os Tubings dentro da câmara para evitar a contaminação cruzada.

Resultados

A Figura 5 mostra os experimentos de prova de princípio usando o corante azul de Evan, o que nos permite testar o sistema e visualizar a função de barreira fluida e placentária apropriada e evitar a transferência de contenção para o compartimento fetal. O corante azul de Evan atingiu e perfundidos o tecido da placenta dentro deste sistema (Figura 5a). Após a investigação, é evidente que o corante azul de Evan não entra na veia umbilical fetal (Figura 5b), o que é esperado como corante azul de Evan está ligado à albumina.

A Figura 6 mostra os dados para o experimento simulado descrito neste protocolo. Amostras de efluente da extremidade distal da artéria uterina e da veia umbilical fetal foram mensuradas em cada segmento de 10 minutos para avaliar o fluxo de fluido ao longo do tempo após a administração da dose de bolus na artéria uterina materna (Figura 6). Transferência fluida reduzida ao compartimento fetal dentro de 10 minutos depois que a infusão do poliestireno foi identificada. Para quantificar a transferência de poliestireno para o compartimento fetal durante o tempo de curso, quando ocorre, 25 μL do fluido perfundidos de cada ponto de tempo foi colocado em uma placa de 96 poços em duplicado para medir a fluorescência da amostra. A fluorescência foi determinada por leitura espectroscópica a 546/575 nm (ex/em) usando um leitor de microplacas fluorescentes. A transferência de poliestireno para o compartimento fetal ocorreu dentro de 10 minutos e atingiu o pico em 20 minutos e continuou por 90 minutos (Figura 6B).

Um subconjunto de tecidos placentária perfundidos foi conservado para A histopatologia e as avaliações morfológicas. Os tecidos eram formalin-fixos e hematoxilina e eosina manchados e revistos por um patologista veterinário certificado placa. Estes peritos não identificaram nenhuma anomalia estrutural nas placentas perfundidos por somente PSS, ou PSS com a dose do bolus do poliestireno RHODAMINE-etiquetado.

Figura 1: a câmara de vaso único modificada. (A) uma visão geral da câmara modificada. (B) uma imagem do close-up das agulhas Blunt-Tip fixadas dentro da câmara do vaso. A seta vermelha indica o grampo do termistor que foi alterado para prender as agulhas no lugar para o cannulation do cordão umbilical. (C) uma imagem representativa das quatro cânulas preparadas para a canulação tecidual. As setas vermelhas apontam para cada uma das quatro cânulas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: uma visão mais próxima da câmara de perfusão placentária. (A) isto representa a tubulação acoplada ao transdutor de pressão e canulados a artéria uterine materna proximal, ou o "Inflow". A pressão é ajustada a uma constante 80 mmHg como definido pela literatura. (B) isto representa a porta de dreno da câmara do superfusate que circunda o tecido placentária durante a perfusão. (C) isto representa o entrada da câmara do superfusate para banhar a placenta com o PSS aquecido durante a perfusão. (D) isto representa o porto uterine materno longe do ponto de origem onde o efluente da perfusão uterine pode ser coletado. (E) isto representa o porto da temperatura, onde a câmara do vaso pode ser unida a um termômetro e a um calefator para manter uma temperatura consistente durante todo o experimento. (F) isto representa o cannulation da artéria do cordão umbilical. A artéria umbilical é pressurizada a 50 mmHg para permitir o fluxo da contratual ao nível da placenta. (G) isso representa a coleta de efluente da veia umbilical. O fluido que flui em direção ao compartimento fetal durante a perfusão será coletado aqui. (H) este é o centro do sistema de perfusão, onde a placenta é canulada e mantida ao longo da perfusão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: uma visão do sistema de perfusão placentária. ( A e B) o sistema de controle de pressão utilizado para monitorar e manter 80 mmHg de perfusato através da artéria uterina. (C) isso representa a termoregulação da câmara de perfusão. (D) microscópio. E) câmara de perfusão. (F) perfusão de artéria umbilical alimentada por gravidade definida em 50 mmHg. (G) uma bomba peristáltica usada para encher e drenar o superfusate placentária PSS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: esquema do sistema de perfusão placentária. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: imagens representativas de experimentos de prova de princípio usando o corante azul de Evan. (A e B) prova-de-princípio que o azul de Evan perfuse o vasculature uterine, o músculo uterine, e a placenta mas não atravessará a barreira placentária devido à ligação da albumina. A seta verde indica a drenagem venosa azul da placenta de volta à circulação materna. A seta vermelha indica o efluente da veia umbilical em direção ao compartimento fetal. Observe a falta de corante azul. (C) uma imagem representativa de coleta de efluente drenante da veia umbilical. A seta vermelha indica a formação de queda antes da coleta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: dados derivados do experimento simulado. Medições de fluorescência de nanomateriais de poliestireno rotulados com rodamina, normalizadas para fluorescência basal, através da coleta de (a) artéria uterina e (B) efluentes da veia umbilical fetal. Média normalizada para fluorescência basal ± erro padrão (SE). *: p < 0, 5 e T: p < 0,1 via análise de variância (ANOVA). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este método da perfusão permite a avaliação rápida da barreira placentária e da função physiological da camada uterine do vasculatura e do trofoblasto. A canulação e a perfusão das extremidades proximal a distal da artéria uterina materna simulam a fisiologia do fluxo sanguíneo materno através desta grande embarcação responsável pelo envio de sangue para o feto em desenvolvimento. Esta metodologia permite a avaliação fisiológica da vasculatura materna, placentária e umbilical isolada e, portanto, alterações na fisiologia podem ser identificadas como patologia vascular; as inervação imunológica e neural são removidas no procedimento ex vivo. Para garantir uma avaliação adequada, é, portanto, fundamental canular estes vasos cuidadosamente para não criar quaisquer lágrimas ou perfurações nas paredes dos vasos, e para remover as bolhas de ar. Os êmbolos de gás podem causar danos à camada endotelial da vasculatura ou obstruir os vasos sanguíneos. Mantendo as conexões vasculares entre o útero, a placenta e o feto durante a dissecção, a avaliação do líquido e do translocação ao feto pode ser observada. Com a administração de um xenobiótico, neste caso o poliestireno de 20 nanômetro, a cinética à extremidade longe do ponto de origem da artéria uterine e através da placenta ao compartimento fetal podem ser avaliados pela análise dos efluentes sobre um curso do tempo de 180 minutos.

Quando um modelo da duplo-perfusão foi descrito e a transferência das partículas e do líquido do compartimento materno ao fetal foi monitorada neste artigo, as avaliações podem igualmente ser feitas no reverso do fetal ao compartimento materno. Uma limitação do método descrito aqui é que a veia uterina distal não foi canulada ou amostrado. Em estudos futuros, especialmente aqueles focados na transferência fetal-para-materna, será importante canular e amostra do vaso uterino distal. Os efluentes retirados deste experimento simulado foram utilizados para avaliar a transferência xenobiótica; no entanto, pode ser realizada uma ampla gama de avaliações relativas a funções endócrinas e placentárias moleculares ou nutrição fetal.

Os pontos fortes deste protocolo superam muito as suas limitações menores. A preparação mantém a estrutura fisiológica e a integridade de um órgão inteiro para avaliar as condições experimentais. A perfusão placentária ex vivo é uma progressão científica da exposição de animais in vitro à base celular para determinar adequadamente a avaliação do risco reprodutivo. Isso pode ser considerado uma técnica valiosa para estudos avaliando a disposição farmacológica da medicina placentária, a farmacocinética, a toxicologia, a fisiologia e a medicina materno-fetal.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile	Surgical Specialties Look	AACO805
Fine forceps	FST by Dumont Switzerland	11252-20
Fine scissors	FST by Dumont Switzerland	14060-10
Glass cannula pack	Living Systems Instrumentation (LSI)	GCP-75-100
Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED	Fisherbrand	02-681-299
Non-serrated fine curved micro serrefine clamps	InterFocus	18052-03
Perfusate pump	ISMATEC	ISM795C
Pressure monitor	Living Systems Instrumentation (LSI)	Mode PM-4
Self-heating single vessel chamber	Living Systems Instrumentation (LSI)	CH-1
Servo Pump	Living Systems Instrumentation (LSI)	ModelPS-200-P
Stainless steel blunt needle 23 gauge	Component Supply Co.	04651-01
Stainless steel blunt needle 25 gauge	Component Supply Co.	07116-01
STERILE Nylon Suture	AROSurgical Instruments Corporation	T04A00N07-13
Stopcock	Sedation Resource	6-205-04
Temperature Controller	Living Systems Instrumentation (LSI)	Model TC-09S