啮齿类动物胎盘的体外灌注

摘要

这里提出了一个体内母婴血管灌注的方案, 使测试文章能够给母亲的血管, 并评估胎盘转移的异生物粒子或药理剂, 除了改变胎盘生理学。

摘要

胎盘是怀孕期间的一个关键器官, 是胎儿异生物暴露的屏障, 并促进营养物质的交换废物。本文介绍了一种方法, 以灌注一个孤立的大鼠胎盘, 并评估母婴转位的外周生物。此外, 这种方法可以对生理过程进行评估, 如液体流向胎儿和胎盘代谢。该技术适用于评价候选药物或环境污染物的母胎到胎儿的动力学。与目前的替代方法不同的是, 这种方法允许评估孤立的母胎血管, 消除全身神经或免疫参与, 允许任何观察到的生理功能变化可归因于孤立组织内的局部因素。

引言

通过维持形态结构和生理反应能力, 器官灌注已成为一种公认的系统或组织为基础的代谢功能分析方法。这些灌注技术允许对各种药理和机械刺激的完整组织反应进行体外检查。人类胎盘灌注最初描述在 1958年, 以确定激素对柠檬酸循环的代谢活动的影响;在组织同质化中已经确定, 特伦和戈登认识到有必要使用一种新的生理方法1来澄清内分泌活动^.在同一时代, 在大型^2、3和^{小型 4}种动物模型中描述了单灌注 (母婴对胎儿或胎儿对产妇) 策略, 以了解糖、盐和解比林药物的胎盘转移。在体内和体内双灌注 (协调母美和胎儿灌注) 技术被描述为进一步表征胎盘转移使用体内5和体内 ^{6,7, 8的}方法.透射和扫描电子显微镜技术的进步使研究人员能够在灌注⁹后验证胎盘组织的结构和功能完整性。

虽然人类胎盘组织和个体子叶的灌注是最相关的, 但药理制剂和环境污染物的迅速发展需要使用动物灌注模型对异生物进行早期筛选通过胎盘屏障转移。这种胎盘灌注方法允许评估通过胎盘屏障的转移使用更容易达到和生理相关的大鼠胎盘。此外, 暴露后一段时间内通过胎盘屏障的液体流动可以通过测量来自脐动脉的吸血体积来评估。通过允许胎盘灌注从母亲和胎儿的循环, 这种双流全器官的方法可以是有利的电流在体外和体内的方法。这种方法允许通过母体方面给药异种生物, 可以通过通过脐静脉出现在胎盘上的吸乳, 反之亦然。这里介绍的协议将描述20纳米聚苯乙烯 (一种用于食品和医疗产品的常见纳米塑料) 从母亲子宫动脉转移到胎儿隔间, 以及胎盘上液体流动的相关减少, 以说明在多种生理、药理和毒理学环境中使用这种方法来评估影响产妇和胎儿流动的胎盘转移、代谢和生理改变。

研究方案

所有实验程序都得到了罗格斯大学动物护理和使用机构委员会的批准。

1. 实验前的准备工作

注: 这些步骤可能会在实验前几天内执行。

1. 修改容器室。
   注:图 1a, b显示了改进后的单容器腔。
   1. 将热敏电阻传感器从夹子下方移动并弯曲, 使其在灌注槽中自由悬挂 (图 1 b)。
   2. 安装两个4英寸的钝尖不锈钢针与标准的 luer 连接集线器, 一个 25 G 和一个 23 G 固定在热敏电阻夹下, 并添加一个三通塞子, 以允许插管的脐血管 (图 1 b)。
      注: 不同尺寸的 luer 连接采用彩色编码。这便于在实验期间和之后识别船只。
2. 安装两个70-100μm 玻璃微移液器。关于这些程序的进一步资料, 请查阅以下参考资料^10、11。
   注: 这些实验中常用的尖端直径在70-100μm 的范围内, 大于此范围的尖端直径可能会给插管过程增加难度, 而小于60微米的尖端直径可能会在插管过程中刺穿血管壁。
3. 准备从无菌尼龙缝合线 (适用于子宫动脉的近端和远端) 和黑色编织丝非无菌缝合线 (为脐带血管) 的连接。如前面^所述, 通过循环缝合来启动一个正方形的结或系鞋带, 使单打。
   注: 单一领带通常是制作和保存在培养皿充满了一小层硅橡胶, 以帮助工作在粘性背景。
4. 制备含有2升生理盐溶液 (PSS), 在 mmol/L 中, 129.8 Ncl, 5.4 Kcl, 0.5 Nah2 po4, 0.83 mgso₄, 19 nahco 3, 1.8 ccl₂和5.5 葡萄糖.通过在溶液中缓慢加入几滴酸 (1M 盐酸) 或碱 (1 N 氢氧化钠), 将 pH 值调整到 7.40±0.02, 并等待至少20秒后再阅读调整后的 pH 值测量值。储存 PSS, 直到准备在冰箱中使用, 以减少污染, 但不储存超过2周。
5. 标签微型离心管收集 "产妇" 和 "胎儿" 废水在每个时间点, 即, "M基线, M10, M20,..."最长180分钟的时间点。为胎儿排出物准备相同的东西 (F基线、M10、M20...)。
6. 校准系统中使用的所有设备, 包括与维持子宫 (80 毫米汞柱) 和脐带 (50 毫米汞柱) 灌注压力相关的循环浴温和血压监测仪。
7. 通过填充硅橡胶层 (< 0.25 "), 准备解剖室 (直径为 4" x 1 "深) 或循环加热器盘。这种修改必须提前进行, 因为橡胶干燥需要12-24小时。
   注: 建议新手外科医生使用循环热冷却盘, 因为该盘不会移动, 组织将保持一致的温度。

2. 手术站的准备和设备的平衡

1. 打开所有支持灌注系统的设备, 以检查是否有正确的功能。从制冷设备中取出 PSS, 并将其加热至室温。PSS 将被用作一个香水和一个超级体。
2. 放置一个小冒泡的石头, 将气体混合物输送到上部储集层。常用混合物包括 21% o2、8%_O2、3% o2 和 0% o2.打开气体, 为排气液提供小气泡。调整气体的输送, 避免飞溅。
3. 通过检查麻醉、安排手术设备和准备缝合纽带来安排动物解剖站。通过收集解剖销, 打开冷水机组 (或回收冰), 并在解剖室 (内衬橡胶硅胶) 填充冷 PSS, 准备解剖室。
4. 用加热的 PSS 轻轻填充所有的腔室、针头、玻璃微管、油管和储罐, 用精细的尖端转移移液器将气泡吸出来, 从而仔细观察和消除气泡。打开所有三通的塞子, "关闭" 面对移液器的方向, 以固定移液器内的液体。
5. 在为子宫插管准备的两个玻璃微管和两个指定用于脐插管的钝尖针头上放置一条领带。固定与移液器和钝尖针头的连接, 以防止在室内运动过程中丢失 (图 1c)。

3. 胎盘收获

1. 在妊娠第20天用5% 异氟醚对怀孕的雌性大鼠进行约4分钟的麻醉, 或直到动物呼吸困难。将动物转移到鼻锥, 并给药 2.5%-3% 异氟醚, 以保持麻醉。确认无意识的缺乏脚趾捏反射。
   注: 本协议介绍了在妊娠第20天使用大鼠的情况。然而, 如果实验条件要求在怀孕初期进行胎盘评估, 则协议保持不变。
2. 识别和隔离所选择的子宫角 (右或左), 通过抬出和传播出长期的方式外的大鼠尸体。使用编织丝缝合线, 绑在子宫动脉的卵巢末端和阴道端的角。包括与子宫角的缝合内的卵巢。
3. 使用手术剪刀, 切除子宫角, 使切除的近端的卵巢领带和远端侧的阴道领带, 留下子宫角绑与缝合线两端。将子宫角放入用硅橡胶衬里的解剖盘中, 并填充冷 (4°C) PSS。无论选择的是右喇叭还是右角, 在每个实验中都要保持同一侧的选择, 以保持一致性。
   注: 对于胎儿麻醉, 幼崽被保存在冰凉的 PSS 中。因此, 解剖室内的 PSS 温度是通过冷循环浴来维持的, 也应该在冰上保持解剖室。
   注: 此时麻醉大坝可根据实验室 IACUC 协议的批准进行安乐死。在这种情况下, 安乐死是通过气胸 (通过切割横隔膜) 和切除母亲的心脏。
4. 轻轻地将解剖销穿过子宫角推入硅橡胶, 将卵巢一侧向左推向右侧, 将阴道一侧向右推至右侧, 以显示子宫血管。这将稳定子宫, 防止在解剖胎儿隔间的过程中组织的运动。选择一个母亲胎盘-胎儿单位的中心角和结扎子宫动脉和静脉与手术剪刀。切子宫肌肉近端和远端的选定胎盘和胎儿。子宫肌肉可以通过拉到一边收回;重要的是要保持它的完整, 但拉它远离覆盖胎儿小狗。
   注: 母婴单位的选择应基于弧形动脉两侧子宫动脉段的长度。较长的段将允许更成功的插管。
5. 使用精细的钳子和剪刀, 从胎盘的胎儿表面取出羊膜, 注意避免脐带。
6. 解开脐带, 将胎儿幼崽分开。
7. 识别脐动脉 (较厚的血管) 和静脉 (较薄的血管)。标记脐带静脉, 以便于识别, 方法是将其切割得比脐动脉稍短。
8. 轻轻地将脐动脉和静脉彼此分开。
9. 整个胎盘单位, 包括子宫血管, 子宫肌肉, 胎盘, 脐带, 可以被切断和删除。

4. 胎盘灌注

1. 保持解剖血流保持子宫动脉远端至近端方向, 将胎盘单位 (由子宫血管、子宫肌肉、胎盘和脐带组成) 放入经修改的隔离血管室与温暖的, 含氧的 PSS。
2. 每只手使用一对细钳, 将子宫动脉的近端和远端插管到玻璃微移液器上。
3. 使用先前固定在微移液器上的无菌尼龙缝合系带, 紧固子宫动脉。
   注: 可能需要两个连接环 (结);但是, 单个平局循环允许更大的调整。
4. 将脐动脉 (胎儿到产妇的血液流动) 固定在 23 G (较大) 的针头上, 并用黑色编织的丝绸缝合线固定在上面。
5. 将脐静脉 (母婴血流) 固定在 25 G (较小) 钝针上, 用黑色编织的丝绸缝合线固定在上面。
6. 移动到胎盘灌注站, 并回填所有的塞子和管, 以防止气泡。根据图 2连接所有管。
7. 将小型称重船放置在母亲子宫动脉远端插管和胎儿脐静脉的针状插管下, 以捕捉手术过程中出现的污水。
8. 打开蠕动泵、压力控制器和压力监测仪, 打开塞子, 允许流体通过油管流向压力传感器, 但尚未流向胎盘。慢慢将压力增加到80毫米汞。
9. 慢慢地把塞子转向胎盘打开, 观察房间内和领带周围的泄漏。
   注: 如果蠕动泵以高速运行, 请重新评估近端子宫插管和液体泄漏的连接。如果发现, 必须纠正泄漏。另请注意, 虽然平均子宫动脉压力将保持不变 (设置为80毫米汞柱), 流体流量可能是可变的, 这取决于血管和胎盘的生理反应。流体流动的定量可以被确定为一个针对异生物暴露的实验变量。
10. 转动塞子, 允许液体流入脐动脉。将压力设置为约50毫米汞柱, 可使用蠕动泵 (图 3) 或静压柱来实现。
11. 在整个实验过程中, 填充所有储层 (子宫、脐带和叠加) 以保持流体体积。
    注: 一旦灌注已开始, 实验正在进行中, 麻醉后的幼崽留在解剖盘可能会评估是否可行, 通过触摸幼崽与钳子, 以引起神经反应。小狗的抽血将通过子宫角子宫切除术发生;进一步的安乐死可以通过经批准的 IACUC 协议来完成。在这种情况下, 打开羊膜囊在寒冷的 PSS 和创建一个气胸通过切割肋骨。

5. 模拟实验

1. 插管和 PSS 灌注启动后, 让组织平衡 30分钟, 使血管适应新的流体流动。用移液器吸干废水, 并将其保存在相应的标记的微离心管中。
2. 平衡后, 通过在微离心管中收集两艘称重船的污水 10分钟, 并测量通过子宫动脉和脐静脉出现的液体体积, 建立基线灌注。
3. 通过收集子宫远端动脉和脐静脉的排出物, 每隔10分钟开始采集样本。例如, 在0.01% 表面活性剂中悬浮在使用子宫动脉的线上, 以确定异生物的时间过程纳米颗粒穿过胎盘屏障。
   注: 这些出水样本将允许测量液体 (异生物、药理学或代谢物) 内的污染物, 并提供流体通过子宫动脉或穿过胎盘进入胎儿隔间的速度 (图 4)。
4. 输注丸后, 每10分钟从子宫远端动脉和胎儿脐静脉出水中采集一次样本, 输液后总共180分钟。

6. 设备清洁

1. 每次实验后, 从移液器中取出胎盘单元。所有缝合线都可以保存, 以便在今后的实验中重复使用。胎盘组织可以保存为额外的组织学或机械研究。
2. 用70% 乙醇清洗输液系统的所有管和插管, 然后进行蒸馏水和真空干燥。
   注: 如果管管或移液器开始变色或出现损坏, 请在下一次实验之前更换。此外, 在实验队列完成后 (例如, 与单一污染物有关的所有研究), 更换室内所有管, 以防止交叉污染。

结果

图 5显示了使用 evan 蓝色染料的原理验证实验, 使我们能够测试系统, 并可视化适当的流体和胎盘屏障功能, 并防止安全转移到胎儿隔间。埃文的蓝色染料到达并注入了这个系统内的胎盘组织 (图 5a)。经进一步调查, 埃文的蓝色染料显然没有进入胎儿脐静脉 (图 5b), 预计埃文的蓝色染料必然会进入白蛋白。

图 6显示了本协议中描述的模拟实验的数据。在每10分钟段测量子宫动脉远端和胎儿脐静脉的出水样本, 以评估在将静脉剂量输送到母亲子宫动脉后, 随着时间的推移, 液体流动情况 (图 6)。聚苯乙烯输液后10分钟内减少液体转移到胎儿隔间。为了量化聚苯乙烯在发生时的时间过程中转移到胎儿隔间的数量, 从每个时间点到的混合液被放置在96井板中, 重复测量样品荧光。用荧光微板读取器在 546/575 nm (ex/em) 时通过光谱读数测定了荧光。聚苯乙烯转移到胎儿隔间发生在10分钟内, 在20分钟时达到高峰, 持续 90分钟 (图 6b)。

保存了一个完美胎盘组织的子集, 用于组织病理学和形态学评估。组织被福尔马林固定, 血红素和 eosin 染色, 并由董事会认证的兽医病理学家进行审查。这些专家没有发现仅由 PSS 或 pss 与罗丹标记聚苯乙烯的螺栓剂量的胎盘结构异常。

图 1: 改进后的单容器腔.(A) 改进后的室的概述。(B) 固定在容器腔内的钝尖针的特写图像。红色箭头表示已被修改以固定针头进行脐带插管的热敏电阻夹。(C) 为组织插管准备的四管的代表性图像。红色箭头指向四个插管中的每一个。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 胎盘灌注室的近景.(A) 这表示连接到压力传感器并插管的近端产妇子宫动脉, 或 "流入"。按照文献的定义, 压力被设置为80毫米汞柱。(B) 这表示灌注过程中胎盘组织周围的室排水口。(C) 这表示在灌注过程中, 用温暖的 pss 沐浴胎盘的室流入。(D) 这是产妇子宫口, 可在那里收集子宫灌注产生的废水。(E) 这代表温度端口, 容器室可以连接到温度计和加热器上, 以便在整个实验过程中保持一致的温度。(F) 这代表脐动脉插管。脐动脉被加压到50毫米汞柱, 以便在胎盘水平上产生逆流。(G) 这是指收集脐静脉污水。在灌注过程中流向胎儿隔间的液体将在这里收集。(H) 这是灌注系统的中心 , 胎盘在整个灌注过程中管和维持。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 胎盘灌注系统的视图.(A和b) 用于通过子宫动脉监测和维护80毫米汞柱的压力控制系统。(C) 这代表了灌注室的热调节。(D) 显微镜。(E) 灌注室。(F) 重力喂养的脐动脉灌注设置为50毫米汞柱。(G) 用于填充和排出胎盘上的排气体 pss 的蠕动泵。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 胎盘灌注系统原理图.请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: 使用埃文蓝色染料进行原理验证实验的代表性图像.(A和b) 证明埃文的蓝色将灌注子宫血管, 子宫肌肉和胎盘, 但不会跨越胎盘屏障, 由于白蛋白结合。绿色箭头表示蓝色静脉引流从胎盘回到产妇循环。红色箭头表示向胎儿隔间的脐静脉排出。注意缺乏蓝色染料。(C) 收集从脐静脉排出的污水的代表性图像。红色箭头表示收集前的下降形成。请点击这里查看此图的较大版本.

图 6: 从模拟实验中获得的数据.通过收集 (a) 子宫动脉和 (b) 胎儿脐静脉排出物, 对罗丹明标记的聚苯乙烯纳米材料进行荧光测量, 归一化为基线荧光。均归一化为基线荧光±标准误差 (SE)。*: p < 0.05 和 T:p < 0.1 通过方差分析 (ANOVA)。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

这种灌注方法可以快速评估胎盘屏障和子宫血管和滋养细胞层的生理功能。对母亲子宫动脉远端近端的插管和灌注模拟了母亲血液通过这个负责向发育中的胎儿输送血液的主要血管的血液流动的生理。该方法允许对孤立的产妇、胎盘和脐血管进行生理评估, 因此生理变化可被确定为血管病理;免疫和神经神经支配在体外程序中被切除。因此, 为了确保适当的评估, 必须小心地将这些容器插管, 以免在容器壁上产生任何眼泪或刺破, 并消除气泡。气体栓塞可能会对血管内皮层造成损害或阻塞血管。通过在解剖过程中保持子宫、胎盘和胎儿之间的血管连接, 可以观察到对液体和胎儿移位的评估。通过异生物的管理, 在这种情况下20纳米聚苯乙烯, 动力学到子宫动脉的远端, 并通过胎盘到胎儿隔间可以通过分析废水在180分钟的时间过程中进行评估。

虽然描述了双灌注模型, 并监测了颗粒和液体从母亲的转移到胎儿隔间, 评估也可以从胎儿到母亲隔间反向。这里描述的方法的一个局限性是, 子宫远端静脉没有插管或取样。在未来的研究中, 特别是那些集中在胎儿对产妇转移的研究中, 对远端子宫血管进行插管和取样将是很重要的。利用模拟实验中提取的废水来评估异生物的转移;然而, 广泛的评估有关内分泌和分子胎盘功能或胎儿营养可能会进行。

这一协议的优点远远超过其微小的局限性。该制剂保持整个器官的生理结构和完整性, 以评估实验条件。体外胎盘灌注是从细胞体外的一个科学发展到整个动物接触, 以适当确定生殖风险评估。这可被认为是评估胎盘药理药物配置、药代动力学、毒理学、生理学和母婴医学的一项有价值的研究技术。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile	Surgical Specialties Look	AACO805
Fine forceps	FST by Dumont Switzerland	11252-20
Fine scissors	FST by Dumont Switzerland	14060-10
Glass cannula pack	Living Systems Instrumentation (LSI)	GCP-75-100
Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED	Fisherbrand	02-681-299
Non-serrated fine curved micro serrefine clamps	InterFocus	18052-03
Perfusate pump	ISMATEC	ISM795C
Pressure monitor	Living Systems Instrumentation (LSI)	Mode PM-4
Self-heating single vessel chamber	Living Systems Instrumentation (LSI)	CH-1
Servo Pump	Living Systems Instrumentation (LSI)	ModelPS-200-P
Stainless steel blunt needle 23 gauge	Component Supply Co.	04651-01
Stainless steel blunt needle 25 gauge	Component Supply Co.	07116-01
STERILE Nylon Suture	AROSurgical Instruments Corporation	T04A00N07-13
Stopcock	Sedation Resource	6-205-04
Temperature Controller	Living Systems Instrumentation (LSI)	Model TC-09S