下流解析のための凍結げっ歯類の脳領域の収集

要約

この手順は、安価で一般的に入手可能なツールを使用して高品質のタンパク質およびRNAを得るために離散的な凍結脳領域のコレクションを記述する。

要約

神経生物学の理解が進むにつれて、分子分析は内側前頭前野(mPFC)や側坐核などの小さな脳領域でしばしば行われます。本研究の課題は、検討する微小環境を維持しながら、正しい領域を解剖することです。このホワイト ペーパーでは、ほとんどのラボですぐに利用できるリソースを使用した、シンプルで低コストの方法について説明します。この方法は、プロセス全体を通して組織を凍結させることによって核酸およびタンパク質を保存する。脳は、脳マトリックスを使用して0.5〜1.0mmのセクションに切断され、凍結ガラス板の上に配置されます。各セクション内のランドマークは、アレンマウス脳アトラスなどの参照と比較され、領域は冷たいメスや生検パンチを使用して解剖されます。その後、使用するまで組織を-80°Cで保存する。ラットとマウスのmPFCを通じて、側坐核、側側海馬および腹側海馬および他の領域は、qRT-PCRおよび西洋アッセイを用いて正常に分析された。この方法は、明確なランドマークによって識別することができる脳領域に限定されています。

概要

この研究は、アレンマウス脳アトラス¹などの参考文献を用いて、高品質の核酸またはタンパク質を抽出するための凍結脳領域の解剖をガイドとして示している。この技術では、脳はフラッシュ冷凍され、後で切断および解剖のために-80°Cで保存され、凍結状態で維持される。このプロセスは、研究者が1回のセッションで多数の脳を収穫し、後で複数の脳領域の正確なコレクションのためにそれらを解剖することを可能にする。

多くの場合、遺伝子やタンパク質発現に関する質問に答える際には、関心のある脳領域(ROI)の正確な収集が必要です。薬理学、電気生理学および光遺伝学は野生型または遺伝子組み換えげっ歯類に使用され、観察された行動を支える分子変化を解明するのに役立つ^{2,2、3、4、,4}トランスクリプトームおよびプロテオームの誘発変化の測定はこれらの知見を支持するためにしばしば使用される。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)、ウェスタンブロッティング、RNAseq 5、MAPSeq⁶およびHPLC⁵⁷などの技術は、堅牢で比較的低コストであり、多くの研究室が小さな脳領域内での分子変化を研究することを可能にする^{2、4、5、6。4,5,62}

^,脳領域^,,8,9,10,11,12から核酸やタンパク^8,9質を抽出して精製する方法はいくつかあります。¹⁰¹¹¹²多くの研究室は、収穫^時に氷の上で脳を冷やし、切断することによって脳領域を収穫します^9,13.このアプローチは、高品質の核酸およびタンパク質をもたらす可能性があるが、組織の微小環境内での分解がこれらの温度で起こり得るため、幾分時間制限がある。これは、一度に多数の動物やROIを解剖しようとするときに特に当てはまるかもしれません。サンプルを凍結しておくと、陰唇標的分子を維持するのに役立ち、比較的純粋なサンプルを収集するために、各セクションの両側のランドマークを慎重に比較する時間を研究者に提供します。レーザーキャプチャは、脳領域¹⁰からRNAまたはタンパク質分析のための組織を収集する別の方法です。この手順は、非常に小さく不規則な形状のROIを同定し、単離することができるという機械的解離よりも優れています。しかし、レーザー捕捉は高価な装置および試薬の使用によって制限され、時間がかかり、またサンプル分解の影響を受けやすい場合がある。

凍結組織のマイクロパンチ解剖は新しいものではありません。ミクロス・パルコヴィッツの初期の論文は、基本的なテクニックを詳細^14,15,15に詳述している。このプレゼンテーションは、効率を容易にし、必要な機器の費用を削減するためにいくつかの改善と、主に元の作業に従います。例えば、脳の切片は、クライオスタットではなく、凍結された脳ブロックで作られています。これにより、ROI サンプルの収集に必要なセクション数を削減する、より厚いセクションが生成されます。この方法はまた、絶縁箱内のドライアイスに座っている凍結ガラス板のサンプルを解剖する。これは、作業するベンチでサブ凍結段階を生成します。このように解剖されたセクションは操作が容易であり、研究者は目的のROI外の領域からの汚染を制限するために、各セクションの両側を参照と比較することができます。

このプロトコルの利点は、1)脳がプロセス全体を通して凍結状態に保たれ、タンパク質と核酸を保存するのに役立ち、研究者にROIを慎重に収穫する時間を与え、2)必要な試薬は安価であり、ほとんどの分子生物学研究室に見られることです。このプロセスでは、脳全体を脳のマトリックスで0.5~1.0mmに切り離し、氷で継続的に冷やされる凍ったガラス板の上に置きます。アレン・ブレイン・アトラス1または他の脳アトラス^16、17,17に見られるランドマークは、関心のある領域を識別するために使用され、冷たいパンチまたはメスのいずれかを使用して解剖されます。¹組織が解凍されることは決してないので、この方法で収穫された領域は、下流の分析のための高品質のRNAとタンパク質を提供します。

プロトコル

この研究で使用される動物は、インディアナ大学の制度的動物ケアおよび使用委員会(IACUC)および国立衛生研究所(NIH)ガイドラインによって定められた倫理的および人道的な方法で扱われた。

注:すべてのツールと表面は、任意の作業を開始する前にヌクレア^ーゼ18を除去するために適切な溶媒で洗浄する必要があります。

1. 脳の保存

1. 従来のアプローチ¹³を用いて約30gの体重を量る安楽死させた成体CD1野生型マウスから脳を素早く取り除き、液体窒素または乾氷で予冷したイコペンタンのいずれかで60秒間フラッシュフリーズする。
2. 使用するまでアルミ箔または円錐管に-80°Cで凍結した脳を保管してください。

2. 脳マトリックスの準備

1. 組織を解剖する24時間前に、解凍した冷凍庫パックの積み重ねの上にきれいな脳マトリックス(材料表を参照)を置きます。2つの冷凍パックの間にマトリックスの側面を挟んで、カミソリスロットの底部とゲルパックの上部の間に約0.5 cmを残すことを確認します(図1A)。冷却を支援するために端部にアルミホイルを置きます。
   注:脳マトリックスを購入する場合は、解剖される脳の全容を包むのに十分な大きさのものを購入してください。
2. 脳マトリックスと冷凍庫パックを含む箱を-20°Cの冷凍庫に入れ、一晩上のアジャールを入れます。

3. 冷凍ガラス板の設置

注:このセットアップの目的は、脳のセクションを解剖するために凍結表面を準備することです。

1. 上部から約5cmまで絶縁された箱に氷を入れます。その後、氷の上に2.5cmのドライアイス層を置き、黒いプラスチックシートで覆い、サンプルを視覚化するのに役立つ(図1B、図1C)。
2. プラスチックの上にガラス板(箱の開口部にちょうど収まるようにする必要があります)を置き、遠いコーナーのプレートの上にドライアイスを置きます(図1C)。
3. 冷凍庫から凍結した脳マトリックスを取り出し、皮質側を切断するために脳を挿入します。箱の中の温度を10分間平衡に保ちます。
4. 冷間鉗子でマトリックス内の脳の位置を調整して、矢状正弦と横方向の正弦がブロックの垂直溝と一致するようにします(図1D)。これは、解剖を容易にするために対称セクションを確保するのに役立ちます。脳を調整する前に冷やすために氷を短時間乾燥させる鉗子のタッチチップ。
5. 脳が所定の位置に入ったら、中央近くに冷やしたカミソリの刃を置き、約1mmの刃を組織に押し込みます。冷却されたブレードをロストラルと尾翼の端に追加して、脳を所定の位置に保持するのに役立ちます(図2Aおよび図2B)。
6. ロストラルの端から、ブレードを1つずつ追加し、スロットに入れ、約1mmの組織にそっと押し込みます(図2B)。尾突端に向かって作業を1mm間隔でブレードを追加し続けます。
7. この間、脳がずれないようにしてください。水平および垂直にブレードを並べ(図2B)。セクションを0.5mm幅にカットするために、ロープロファイルのミクロトームブレード(材料表を参照)を使用することができます。大きなカミソリの刃の間にこれらを置く(図2C)。
8. ブレードが配置されたら、グループの上に指、手のひら、または他の平らな面を押し下げます(図2C、図2D)。ブレードのグループを左右にゆっくりと揺らし、組織を通してそれらを移動します。
   注:これは時間がかかる場合があります(1〜2分)、忍耐が必要です。組織を通過するブレードに対する耐性があるはずです。簡単なエントリは、脳が解凍されていることを意味し、ブロックはドライアイスで冷却する必要があります。
9. すべてのブレードがスロットの底に達したら、ブレードのグループの両側をつかみ、前後に揺らすことによってマトリックスの自由に働きます。
   注:ブレードの鋭いエッジで自分自身を切断しないように注意してください。
10. グループが空きになったら、グラスプレートの上に、スタックのrostral側を上に置きます(図2E)。スタックの隣や上にドライアイスを置き、分離を容易にするためにサンプルをさらに凍結します。
11. ガラス板の上に鋭いエッジを持つスタックを置き、親指と指の間でスタックをシフトしてブレードを分離します。ブレードは、セクションが取り付けられた状態で互いに分離する必要があります。
12. ガラス板の上に、rostralからコーダルまでのセクションを並べます(図2F)。
13. 指の間で刃を曲げるか、第二の冷たいカミソリで分離することによって、ブレードから組織を分離します(図2G、2H、2I)。

4. セクションの解剖

1. アレンマウスの脳アトラスまたは別の参照を開き、関心のある地域を識別するために必要なランドマークを見つけます。いくつかの明白なランドマークには、前部コミュニケール、コーパス梁、側心室、海馬が含まれます(図3)。
2. チルド鉗子で切断するセクションを反転し、収集しようとしている領域がセクション全体で一貫していることを確認します。収穫の間に、正しいROIが得られることを確認するために頻繁に参照地図帳を参照してください。
   注:拡大鏡や顕微鏡の解剖は、多くの場合、このプロセスで役立ちます。良い照明も不可欠です。低ワット数のLEDランプまたはクールなランプ(材料表を参照)は、この目的のために使用することができます。
3. きれいなメスやパンチで、セクションに切り込みます(図4)。切削する前に、乾氷に短時間触って各工具をプレチルします。刃を優しくしっかりとティッシュに押し込み、前後に揺らし、切り傷を作ります。強く押しすぎないように、または組織が骨折します。
   注: ツールは時間の経過とともに暖かくなります。少し温めた刃はきれいな切口を作るのに役立ち、破砕を制限することができますが、ティッシュの解凍を避けるように注意してください。ドライアイスの上で定期的に冷やすツール。
4. ROIが収穫されたら、ラベル付けされた1.5 mLチューブに入れられます。必要になるまで-80°Cで組織を収穫した保管。
5. 冷たいRIPAバッファー(50 mMトリス、この方法で収集された凍結組織を処理 pH 8.0,150 mM NaCl,1%トリトンX-100,0.1%SDS,0.5%CHAPSおよびタンパク質阻害剤カクテル(材料表を参照))、または凍結サンプルへのRNA抽出のためのグアニジウム含有溶媒(材料表を参照)、ガラスDounceまたはメホモナイザーを使用してすぐに均質化する(材料の材料を参照)。このように、プロテアーゼおよびヌクレアーゼ阻害剤は、サンプルがタンパク質および核酸を分解から保護するために温かく配置されます。

結果

この方法を検証するために、成体CD1野生型雄マウスおよびRNAおよびタンパク質から内側前頭前野を採取し、抽出し、特徴付けた。RNAを毛細管電気泳動法で解析した。分解されたRNAは、28Sおよび18Sリボソームバンドの強度の損失を示し、また25〜200ヌクレオチド間のスミアとして分解産物を示す(図5A、サンプル1)。高品質のRNAは、低分子量領域においてシグナルがほとんど...

ディスカッション

この研究は、核酸およびタンパク質の分解を制限しながら、脳の小さな特定の領域を分離する技術を記述する。脳組織への損傷は、生物が死ぬとすぐに起こります。これは部分的に細胞外グルタミン酸の急速な蓄積と²¹が発生する結果として生じる興奮毒性によるものです。メッセンジャーRNAは、特に分解^2222、2323に対して脆弱で?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 505C	Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 705C	Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes	Dot Scientific	229443	For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage gel	Invitrogen	NPO323BOX	protein gradient gel
Bioanalyzer System	Agilent	2100	RNA analysis system
Dounce tissue grinder	Millipore Sigma	D8938	Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	Cool lamp
Glass plates	LabRepCo	11074010
HALT	ThermoFisher	78440	protease inhibitor cocktail
Low profile blades	Sakura Finetek USA Inc.	4689
mouse anti-actin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	JLA20	Antibody
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade	Surgical Design Inc	17467673
Odyssey Blocking buffer	LiCor Biosciences	927-40000	Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125	VWR	10046-866	Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody	Cell Signaling Technology	94725S	Antibody
RNA Plus Micro Kit	Qiagen	73034	Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Scalpel handle	Excelta Corp.	16050103
Standard razor blades	American Line	66-0362
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Used to extract RNA from tissue