Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval

Résumé

Cette procédure décrit la collecte de régions cérébrales congelées discrètes pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles.

Résumé

Au fur et à mesure que notre compréhension de la neurobiologie a progressé, des analyses moléculaires sont souvent effectuées sur de petites zones cérébrales telles que le cortex préfrontal médial (MPFC) ou le noyau accumbens. Le défi dans ce travail est de disséquer la zone correcte tout en préservant le microenvironnement à examiner. Dans cet article, nous décrivons une méthode simple et peu coûteuse utilisant des ressources facilement disponibles dans la plupart des laboratoires. Cette méthode préserve l’acide nucléique et les protéines en gardant le tissu congelé tout au long du processus. Les cerveaux sont coupés en sections de 0,5 à 1,0 mm à l’aide d’une matrice cérébrale et disposés sur une plaque de verre congelée. Les repères de chaque section sont comparés à une référence, comme l’Atlas du cerveau Allen Mouse, et les régions sont disséquées à l’aide d’un scalpel froid ou d’un poinçon de biopsie. Le tissu est ensuite stocké à -80 oC jusqu’à l’utilisation. Grâce à ce processus rat et souris mPFC, noyau accumbens, hippocampe dorsale et ventral et d’autres régions ont été analysés avec succès à l’aide de qRT-PCR et d’essais occidentaux. Cette méthode est limitée aux régions du cerveau qui peuvent être identifiées par des repères clairs.

Introduction

Ce travail illustre la dissection des régions du cerveau congelées pour l’extraction de l’acide ou des protéines nucléiques de haute qualité à l’aide d’une référence, comme l’Allen Mouse Brain Atlas¹, comme guide. Dans cette technique, les cerveaux sont surgelés et stockés à -80 oC pour la section et la dissection ultérieures tout en étant maintenus dans un état gelé. Ce processus permet au chercheur de récolter un grand nombre de cerveaux en une seule séance et de les disséquer plus tard pour une collecte précise de multiples régions du cerveau.

La collecte précise des régions d’intérêt du cerveau (ROIs) est souvent nécessaire lorsqu’il répond à des questions liées à l’expression des gènes et des protéines. Tandis que la pharmacologie, l’électrophysiologie et l’optogénétique peuvent être employées sur le type sauvage ou les rongeurs génétiquement modifiés pour aider à élucider les changements moléculaires qui sous-tendent les comportements observés^2,,3,^4,la mesure des changements induits dans les transcriptomes et les protéomes est souvent employée pour soutenir ces résultats.^, Des techniques telles que la réaction quantitative en chaîne de polymérase inverse (RT-qPCR), le ballonnement occidental, le RNAseq⁵, le MAPSeq⁶ et le HPLC⁷ sont robustes et relativement faibles en coût, ce qui permet à de nombreux laboratoires d’étudier les changements moléculaires induits dans les petites régions du cerveau^2,,4,5,6.

Il existe plusieurs façons d’extraire et de purifier l’acide nuléique ou des protéines des régions du cerveau^8,9,10,11,12. De nombreux laboratoires récoltent les régions du cerveau en refroidissant et en coupant les cerveaux sur la glace au moment de la récolte^9,13. Bien que cette approche puisse entraîner de l’acide nucléique de haute qualité et des protéines, elle est quelque peu limitée dans le temps, car la dégradation dans le microenvironnement du tissu peut avoir lieu à ces températures. Cela peut être particulièrement vrai lorsque vous tentez de disséquer un grand nombre d’animaux ou d’IRM en une seule séance. Garder les échantillons congelés aide à maintenir les molécules cibles labiles tout en donnant au chercheur le temps de comparer soigneusement les repères des deux côtés de chaque section dans l’effort de recueillir des échantillons relativement purs. La capture au laser est une autre façon de recueillir des tissus pour l’analyse de l’ARN ou des protéines dans les zones cérébrales¹⁰. Cette procédure est supérieure à la dissection mécanique dans ce ROIs de forme très petite et irrégulièrement peut être identifiée et isolée. Cependant, la capture au laser est limitée par l’utilisation d’équipements et de réactifs coûteux, prend beaucoup de temps et peut également être plus sensible à la dégradation de l’échantillon.

La dissection de micropunch sur les tissus congelés n’est pas nouvelle. Les premiers papiers de Miklos Palkovits et d’autres décrivent les techniques de base en détail^14,15. Cette présentation suit en grande partie le travail initial, avec quelques améliorations pour faciliter l’efficacité et réduire les dépenses de l’équipement nécessaire. Par exemple, les sections cérébrales sont faites dans un bloc cérébral gelé plutôt que sur un cryostat. Cela produit des sections plus épaisses qui réduisent le nombre de sections nécessaires pour recueillir des échantillons de retour sur investissement. Cette méthode disséque également des échantillons sur une plaque de verre congelée qui repose sur de la glace sèche dans une boîte isolée. Cela produit une étape de sous-gel au banc sur lequel travailler. Les sections disséquées de cette façon sont facilement manipulatibles, ce qui permet au chercheur de comparer les deux côtés de chaque section avec une référence afin de limiter la contamination des régions en dehors du retour sur investissement souhaité.

Les avantages de ce protocole sont que 1) le cerveau est maintenu dans un état gelé tout au long du processus, qui aide à préserver les protéines et l’acide nucléique et donne au chercheur le temps de récolter soigneusement les IA, et 2) les réactifs requis sont peu coûteux et se trouvent dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire. Dans ce processus, les cerveaux entiers sont sectionnés à 0,5-1,0 mm dans une matrice de cerveau et placés sur une plaque de verre congelée qui est continuellement refroidie avec de la glace sèche. Les repères trouvés dans l’Atlas du cerveau Allen¹ ou d’autres atlas cérébraux^16,17 sont utilisés pour identifier les régions d’intérêt, qui sont ensuite disséquées à l’aide d’un poinçon froid ou d’un scalpel. Parce que le tissu n’est jamais décongelé, les régions récoltées de cette manière fournissent l’ARN et les protéines de haute qualité pour les analyses en aval.

Protocole

Les animaux utilisés dans cette étude ont été traités d’une manière éthique et humaine, comme l’ont indiqué le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de l’Indiana et les lignes directrices des National Institutes of Health (NIH).

REMARQUE : Tous les outils et surfaces doivent être lavés avec un solvant approprié pour enlever les nucléases¹⁸ avant de commencer tout travail.

1. Stockage des cerveaux

1. Retirez rapidement le cerveau des souris à papier sauvage CD1 adultes euthanasiés pesant environ 30 g à l’aide d’une approche conventionnelle¹³ et gèlez le flash pendant 60 secondes dans l’azote liquide ou l’isopentane pré-réfrigéré avec de la glace sèche.
2. Conserver les cerveaux congelés à -80 oC dans du papier d’aluminium ou des tubes coniques jusqu’à leur utilisation.

2. Préparation de la matrice du cerveau

1. Vingt-quatre heures avant de disséquer les tissus, placez une matrice propre du cerveau (voir tableau des matériaux)sur une pile d’emballages de congélation décongelés. Sandwich les côtés de la matrice entre deux emballages de congélation en veillant à laisser environ 0,5 cm entre le bas des fentes de rasoir et le dessus des paquets de gel (figure 1A). Déposer le papier d’aluminium sur les extrémités pour faciliter le refroidissement.
   REMARQUE : Lors de l’achat d’une matrice de cerveau, achetez-en une qui est assez grande pour envelopper le volume entier du cerveau pour être disséqué.
2. Placer la boîte contenant la matrice du cerveau et les emballages de congélation dans un congélateur de -20 oC avec le dessus entrouverte pendant la nuit.

3. Mise en place d’une plaque de verre congelée

REMARQUE : Le but de cette configuration est de préparer une surface gelée sur laquelle disséquer les sections cérébrales.

1. Placer la glace dans une boîte isolée jusqu’à environ 5 cm du haut. Placez ensuite une couche de glace sèche de 2,5 cm sur le dessus de la glace et recouvrez de bâches en plastique noir pour aider à visualiser l’échantillon(figure 1B, figure 1C).
2. Placer une plaque de verre (devrait juste tenir dans l’ouverture de la boîte) sur le dessus du plastique et placer la glace sèche sur le dessus de la plaque dans les coins éloignés(figure 1C).
3. Prenez la matrice du cerveau congelée du congélateur et insérez le cerveau pour être coupé cortex-côté vers le haut. Laissez-le équilibrer à la température dans la boîte pendant 10 min. Gardez le couvercle sur la boîte pendant ce temps.
4. Ajuster la position du cerveau dans la matrice avec des forceps froids de sorte que le sinus sagittal et le sinus transversal s’alignent avec les rainures perpendiculaires du bloc (figure 1D). Cela permettra d’assurer des sections symétriques pour une dissection plus facile. Touchez les pointes des forceps pour sécher brièvement la glace pour refroidir avant d’ajuster le cerveau.
5. Une fois que le cerveau est en position, placez une lame de rasoir réfrigérée près de son centre et appuyez sur la lame d’environ 1 mm dans le tissu. Ajouter les lames réfrigérées aux extrémités rostrales et caudales pour aider à maintenir le cerveau en place (figure 2A et figure 2B).
6. À partir de l’extrémité rostrale, ajouter les lames une à la fois, les placer dans les fentes et les presser doucement vers le bas dans le tissu d’environ 1 mm (figure 2B). Continuer à ajouter des lames à intervalles de 1 mm en travaillant vers l’extrémité caudale.
7. Assurez-vous que le cerveau ne se déplace pas pendant cette période. Alignez les lames horizontalement et verticalement(figure 2B). Afin de couper des sections en largeurs de 0,5 mm, des lames microtomes de profil bas (voir tableau des matériaux) peuvent être utilisées. Placez-les entre les plus grandes lames de rasoir(figure 2C).
8. Une fois que les lames sont en place, appuyez sur le groupe avec les doigts, la paume ou une autre surface plane(figure 2C, figure 2D). Rock le groupe de lames lentement d’un côté à l’autre pour les déplacer à travers le tissu.
   REMARQUE : Cela peut prendre un certain temps (1 à 2 min) et nécessite de la patience. Il devrait y avoir une résistance aux lames qui se déplacent à travers le tissu. L’entrée facile signifie que le cerveau décongeler et le bloc doit être refroidi avec de la glace sèche.
9. Lorsque toutes les lames ont atteint le fond des fentes, saisissez chaque côté du groupe de lames et ne marchez pas sur la matrice en se balançant d’avant en arrière.
   REMARQUE : Faites preuve de prudence pour éviter de se couper sur les bords tranchants des lames.
10. Une fois que le groupe est libre, placez la pile, côté rostral vers le haut, sur la plaque de verre(figure 2E). Placer la glace sèche à côté et/ou sur le dessus de la pile pour congeler davantage les échantillons pour faciliter la séparation.
11. Placez la pile avec des bords pointus vers le bas sur la plaque de verre et séparer les lames en déplaçant la pile entre les pouces et les doigts. Les lames doivent se séparer les unes des autres avec des sections attachées.
12. Alignez les sections sur la plaque de verre du rostral au caudal(figure 2F).
13. Séparer le tissu des lames en fléchissant les lames entre les doigts, ou en se séparant d’un deuxième rasoir froid(figures 2G,2H,2I).

4. Sections de dissection

1. Ouvrez l’Atlas du cerveau Allen Mouse ou une autre référence et trouvez les repères nécessaires pour identifier les régions d’intérêt. Parmi les points de repère évidents, mentionnons la commissaire antérieure, le corpus callosum, les ventricules latéraux et l’hippocampe(figure 3).
2. Retourner la section à couper avec des forceps réfrigérés et assurez-vous que la région sur le point d’être recueillie est cohérente tout au long de la section. Pendant la récolte, consultez souvent l’atlas de référence pour vous assurer que le bon retour sur investissement est obtenu.
   REMARQUE : Une loupe ou un microscope disséquant est souvent utile dans ce processus. Un bon éclairage est également essentiel. Des lampes LED à faible puissance ou une lampe fraîche (voir tableau des matériaux)peuvent être utilisées à cette fin.
3. Avec un scalpel propre ou un poinçon, couper dans la section(figure 4). Préchill chaque outil avant de couper en le touchant brièvement à la glace sèche. Poussez la lame doucement mais fermement dans le tissu, en la berçant d’avant en arrière pour faire la coupe. Ne poussez pas trop fort ou le tissu se fracturera.
   REMARQUE : Les outils se réchaufferont avec le temps. Les lames légèrement réchauffées peuvent être utiles pour faire des coupes propres et peuvent limiter la fracturation, mais attention à éviter le dégel des tissus. Refroidir périodiquement les outils sur la glace sèche.
4. Une fois qu’un retour sur investissement est récolté, placez-le dans des tubes étiquetés et précillés de 1,5 mL. Conserver les tissus récoltés à -80 oC jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires.
5. Traiter les tissus congelés recueillis de cette manière en ajoutant le tampon RIPA froid (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS et cocktail inhibiteur des protéines (voir tableau des matériaux))pour l’extraction des protéines, ou un solvant contenant du guanidinium (voir tableau des matériaux) pour l’extraction de l’ARN à l’échantillon congelé et immédiatement homogénéiser à l’aide d’un dounce en verre ou d’homogéniste mécanique (voir tableau des matériaux). De cette façon, des inhibiteurs de la protéase et de la nucléase sont en place à mesure que l’échantillon se réchauffe pour protéger les protéines et les acides nucléiques contre la dégradation.

Résultats

Afin de valider cette méthode, le cortex préfrontal médial a été recueilli à partir de souris mâles CD1 adultes et l’ARN et la protéine ont été extraits et caractérisés. L’ARN a été analysé par électrophoresis capillaire. L’ARN dégradé affiche une perte dans l’intensité des bandes ribosomal 28S et 18S et montre également des produits de dégradation comme un frottis entre 25 et 200 nucléotides(figure 5A, échantillon 1). L’ARN de haute qualité montre des bande...

Discussion

Ces travaux décrivent une technique pour isoler de petites régions spécifiques du cerveau tout en limitant la dégradation de l’acide nucléique et des protéines. Les dommages aux tissus cérébraux se produisent rapidement une fois qu’un organisme meurt. Ceci est dû en partie à une accumulation rapide de glutamate extracellulaire et l’excitotoxicité résultante qui se produit²¹. L’ARN Messenger est particulièrement vulnérable à la dégradation^22,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 505C	Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 705C	Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes	Dot Scientific	229443	For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage gel	Invitrogen	NPO323BOX	protein gradient gel
Bioanalyzer System	Agilent	2100	RNA analysis system
Dounce tissue grinder	Millipore Sigma	D8938	Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	Cool lamp
Glass plates	LabRepCo	11074010
HALT	ThermoFisher	78440	protease inhibitor cocktail
Low profile blades	Sakura Finetek USA Inc.	4689
mouse anti-actin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	JLA20	Antibody
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade	Surgical Design Inc	17467673
Odyssey Blocking buffer	LiCor Biosciences	927-40000	Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125	VWR	10046-866	Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody	Cell Signaling Technology	94725S	Antibody
RNA Plus Micro Kit	Qiagen	73034	Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Scalpel handle	Excelta Corp.	16050103
Standard razor blades	American Line	66-0362
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Used to extract RNA from tissue