Sammlung von gefrorenen Nagetier-Hirnregionen für Downstream-Analysen

Zusammenfassung

Dieses Verfahren beschreibt die Sammlung diskreter gefrorener Hirnregionen, um hochwertiges Protein und RNA mit kostengünstigen und allgemein verfügbaren Werkzeugen zu erhalten.

Zusammenfassung

Im Verlauf unseres Verständnisses der Neurobiologie werden molekulare Analysen häufig an kleinen Hirnbereichen wie dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) oder Nucleus accumbens durchgeführt. Die Herausforderung bei dieser Arbeit besteht darin, den richtigen Bereich zu sezieren und gleichzeitig die zu untersuchende Mikroumgebung zu erhalten. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache, kostengünstige Methode, bei der Ressourcen verwendet werden, die in den meisten Labors leicht verfügbar sind. Diese Methode bewahrt Nukleinsäure und Proteine, indem das Gewebe während des gesamten Prozesses eingefroren bleibt. Gehirne werden mit einer Hirnmatrix in 0,5-1,0 mm-Abschnitte geschnitten und auf einer gefrorenen Glasplatte angeordnet. Landmarken innerhalb jedes Abschnitts werden mit einer Referenz verglichen, z. B. der Allen Mouse Brain Atlas, und Regionen werden mit einem kalten Skalpell oder Biopsie-Punch seziert. Gewebe wird dann bei -80 °C bis zur Verwendung gelagert. Durch diesen Prozess wurden Ratten- und Maus-mPFC, Nucleus accumbens, dorsaler und ventraler Hippocampus und andere Regionen erfolgreich mit qRT-PCR und Western Assays analysiert. Diese Methode ist auf Hirnregionen beschränkt, die durch klare Landmarken identifiziert werden können.

Einleitung

Diese Arbeit veranschaulicht die Zerlegung von gefrorenen Hirnregionen zur Extraktion von hochwertiger Nukleinsäure oder Protein unter Verwendung eines Verweises, wie z. B. des Allen Mouse Brain Atlas¹, als Leitfaden. Bei dieser Technik werden Gehirne blitzgefroren und bei -80 °C für spätere Schnitte und Sezieren gelagert, während sie in einem gefrorenen Zustand gehalten werden. Dieser Prozess ermöglicht es dem Forscher, eine große Anzahl von Gehirnen in einer Sitzung zu ernten und sie später für eine genaue Sammlung mehrerer Hirnregionen zu sezieren.

Die genaue Erfassung von Hirnregionen von Interesse (ROIs) ist oft erforderlich, wenn Fragen im Zusammenhang mit Gen- und Proteinexpression beantwortet werden. Während Pharmakologie, Elektrophysiologie und Optogenetik an Wildtypen oder genetisch veränderten Nagetieren verwendet werden können, um molekulare Veränderungen aufzuklären, die den beobachteten Verhaltensweisen^2,3,4zugrunde liegen, wird die Messung induzierter Veränderungen in Transkriptomen und Proteomen häufig verwendet, um diese Befunde zu unterstützen. Techniken wie quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR), Western Blotting, RNAseq⁵, MAPSeq⁶ und HPLC⁷ sind robust und relativ kostengünstig, so dass viele Labore induzierte molekulare Veränderungen innerhalb kleiner^Hirnregionen2^,4,5,6untersuchen können.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, Nukleinsäure oder Protein aus Hirnregionen^8,9,10,11,12zu extrahieren und zu reinigen. Viele Labore ernten Hirnregionen, indem sie gehirnzum Zeitpunkt der Ernte^9,,13auf Eis kühlen und schneiden. Während dieser Ansatz zu hochwertiger Nukleinsäure und Protein führen kann, ist er etwas zeitlich begrenzt, da bei diesen Temperaturen ein Abbau innerhalb der Mikroumgebung des Gewebes stattfinden kann. Dies kann insbesondere dann der Fall sein, wenn versucht wird, eine große Anzahl von Tieren oder ROIs in einer Sitzung zu sezieren. Das Einfrieren von Proben hilft dabei, labile Zielmoleküle zu erhalten und bietet dem Forscher Zeit, um Die Sehenswürdigkeiten auf beiden Seiten jedes Abschnitts sorgfältig zu vergleichen, um relativ reine Proben zu sammeln. Laser-Capture ist eine weitere Möglichkeit, Gewebe für RNA- oder Proteinanalyse aus Hirnbereichen zu sammeln¹⁰. Dieses Verfahren ist der mechanischen Zerlegung überlegen, da sehr kleine und unregelmäßig geformte ROIs identifiziert und isoliert werden können. Die Lasererfassung wird jedoch durch den Einsatz teurer Geräte und Reagenzien eingeschränkt, ist zeitaufwändig und kann auch anfälliger für Probendegradation sein.

Micropunch-Sektion auf gefrorenen Geweben ist nicht neu. Frühe Arbeiten von Miklos Palkovits und anderen beschreiben die Grundtechniken im Detail^14,15. Diese Präsentation folgt weitgehend der ursprünglichen Arbeit, mit einigen Verbesserungen, um die Effizienz zu erleichtern und die Kosten für die benötigte Ausrüstung zu verringern. Zum Beispiel werden Gehirnabschnitte in einem gefrorenen Hirnblock und nicht auf einem Kryostat hergestellt. Dadurch entstehen dickere Abschnitte, wodurch die Anzahl der Abschnitte reduziert wird, die zum Sammeln von ROI-Proben benötigt werden. Diese Methode seziert auch Proben auf einer gefrorenen Glasplatte, die auf Trockeneis in einer isolierten Box sitzt. Dadurch entsteht eine Untergefrierstufe an der Bank, auf der gearbeitet werden kann. Abschnitte, die auf diese Weise seziert werden, sind leicht manipulierbar, so dass der Forscher beide Seiten jedes Abschnitts mit einer Referenz vergleichen kann, um die Kontamination aus Regionen außerhalb des gewünschten ROI zu begrenzen.

Vorteile dieses Protokolls sind, dass 1) das Gehirn während des gesamten Prozesses in einem gefrorenen Zustand gehalten wird, was hilft, Protein und Nukleinsäure zu erhalten und dem Forscher Zeit gibt, ROIs sorgfältig zu ernten, und 2) die erforderlichen Reagenzien sind kostengünstig und finden sich in den meisten molekularbiologischen Labors. Dabei werden ganze Gehirne in einer Hirnmatrix auf 0,5–1,0 mm geschnitten und auf eine gefrorene Glasplatte gelegt, die kontinuierlich mit Trockeneis gekühlt wird. Landmarken, die im Allen Brain Atlas¹ oder anderen Hirnatlanten^16,17 gefunden werden, werden verwendet, um Interessengebiete zu identifizieren, die dann entweder mit einem kalten Schlag oder Skalpell seziert werden. Da das Gewebe nie aufgetaut wird, bieten auf diese Weise geerntete Regionen hochwertige RNA und Proteine für nachgelagerte Analysen.

Protokoll

Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden in einer ethischen und humanen Weise behandelt, wie sie von den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und der National Institutes of Health (NIH) der Indiana University dargelegt wurden.

HINWEIS: Alle Werkzeuge und Oberflächen sollten mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen werden, um Nukleasen zu entfernen^18, bevor Sie mit den Arbeiten beginnen.

1. Speichern von Gehirnen

1. Entfernen Sie schnell die Gehirne von eingeschläferten erwachsenen CD1-Wildtypmäusen mit einem Gewicht von ca. 30 g mit einem konventionellen Ansatz¹³ und Blitzeinfrieren für 60 Sekunden entweder in flüssigem Stickstoff oder ist opentane mit Trockeneis vorgekühlt.
2. Gefrorene Gehirne bei -80 °C in Aluminiumfolie oder konischen Rohren lagern, bis sie verwendet werden.

2. Vorbereitung der Hirnmatrix

1. 24 Stunden vor der Gewebezerse eine saubere Gehirnmatrix (siehe Materialtabelle)auf einen Stapel aufgetauter Gefrierpackungen. Sandwich die Seiten der Matrix zwischen zwei Gefrierpackungen, die sicherstellen, dass ca. 0,5 cm zwischen der Unterseite der Rasierschlitze und der Oberseite der Gelpackungen(Abbildung 1A). Legen Sie Aluminiumfolie auf die Enden, um bei der Kühlung zu helfen.
   HINWEIS: Wenn Sie eine Gehirnmatrix kaufen, kaufen Sie eine, die groß genug ist, um das gesamte Volumen des Gehirns einzuschließen, um seziert zu werden.
2. Legen Sie die Box mit der Hirnmatrix und Gefrierpackungen in einen -20 °C-Gefrierschrank mit dem oberen Ajar über Nacht.

3. Aufstellen einer gefrorenen Glasplatte

HINWEIS: Der Zweck dieses Setups ist es, eine gefrorene Oberfläche vorzubereiten, auf der Gehirnabschnitte seziert werden können.

1. Eis in eine isolierte Box bis ca. 5 cm von oben legen. Legen Sie dann eine 2,5 cm Schicht Trockeneis auf das Eis und Decken mit schwarzen Kunststoffplatten, um die Probe zu visualisieren (Abbildung 1B, Abbildung 1C).
2. Legen Sie eine Glasplatte (sollte nur in die Öffnung der Box passen) auf die Oberseite des Kunststoffs und legen Sie Trockeneis auf der Platte in den entfernten Ecken(Abbildung 1C).
3. Nehmen Sie die eingefrorene Gehirnmatrix aus dem Gefrierschrank und legen Sie das Gehirn ein, um Cortex-Seite nach oben geschnitten zu werden. Lassen Sie es auf die Temperatur in der Box für 10 min ausdemieren. Halten Sie den Deckel auf der Box während dieser Zeit.
4. Passen Sie die Position des Gehirns in der Matrix mit kalten Zangen so an, dass sich die sagittale Sinus und die Quersinus mit den senkrechten Nuten des Blocks anstellen (Abbildung 1D). Dadurch wird sichergestellt, dass symmetrische Abschnitte für eine einfachere Zerlegung gewährleistet werden. Berühren Sie Spitzen der Zange, um Eis kurz zu trocknen, um zu kühlen, bevor Sie das Gehirn anpassen.
5. Sobald das Gehirn in Position ist, legen Sie eine gekühlte Rasierklinge in der Nähe ihrer Mitte und drücken Sie die Klinge etwa 1 mm in das Gewebe. Fügen Sie gekühlte Klingen zu den rostralen und kaudalen Enden hinzu, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 2A und Abbildung 2B).
6. Beginnend mit dem rostralen Ende, fügen Sie Klingen nacheinander, legen Sie sie in die Schlitze und drücken Sie sie sanft nach unten in das Gewebe etwa 1 mm (Abbildung 2B). Fügen Sie die Klingen in 1 mm Intervallen in Richtung des kaudalen Endes hinzu.
7. Stellen Sie sicher, dass sich das Gehirn während dieser Zeit nicht verschiebt. Line-up-Blades horizontal und vertikal(Abbildung 2B). Um Schnitte in 0,5 mm Breite zu schneiden, können Mikrotomklingen mit niedrigem Profil (siehe Materialtabelle)verwendet werden. Platzieren Sie diese zwischen den größeren Rasierklingen (Abbildung 2C).
8. Sobald die Klingen an Ort und Stelle sind, drücken Sie mit Denfingern, Handfläche oder einer anderen flachen Oberfläche auf die Gruppe (Abbildung 2C, Abbildung 2D). Schaukeln Sie die Gruppe der Klingen langsam von Seite zu Seite, um sie durch das Gewebe zu bewegen.
   HINWEIS: Dies kann einige Zeit in Anspruch nehmen (1–2 min) und erfordert Geduld. Es sollte eine Resistenz gegen die Klingen, die sich durch das Gewebe bewegen, bestehen. Einfacher Einstieg bedeutet, dass das Gehirn auftaut und der Block mit Trockeneis gekühlt werden sollte.
9. Wenn alle Klingen den Boden der Schlitze erreicht haben, greifen Sie jede Seite der Gruppe von Klingen und arbeiten Frei von der Matrix, indem Sie hin und her schaukeln.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, sich an den scharfen Kanten der Klingen zu schneiden.
10. Sobald die Gruppe frei ist, legen Sie den Stapel, rostralseite nach oben, auf die Glasplatte (Abbildung 2E). Legen Sie Trockeneis neben und/oder auf den Stapel, um die Proben weiter einzufrieren, um die Trennung zu erleichtern.
11. Legen Sie den Stapel mit scharfen Kanten nach unten auf die Glasplatte und trennen Sie die Klingen, indem Sie den Stapel zwischen Daumen und Fingern verschieben. Die Klingen sollten sich mit befestigten Abschnitten voneinander trennen.
12. Aufderlegen Abschnitte auf der Glasplatte von rostral bis kaudal (Abbildung 2F).
13. Trennen Sie Gewebe von den Klingen, indem Sie die Klingen zwischen den Fingern biegen oder durch Trennen mit einem zweiten kalten Rasiermesser(Abbildungen 2G,2H,2I).

4. Abschnitte sezieren

1. Öffnen Sie den Allen Mouse Brain Atlas oder eine andere Referenz und finden Sie Sehenswürdigkeiten, die notwendig sind, um Interessengebiete zu identifizieren. Einige offensichtliche Sehenswürdigkeiten sind die vordere Kommissure, das Corpus callosum, die seitlichen Ventrikel und der Hippocampus (Abbildung 3).
2. Drehen Sie den Abschnitt, der mit gekühlten Zangen geschnitten werden soll, und stellen Sie sicher, dass die Region, die gesammelt werden soll, während des gesamten Abschnitts konsistent ist. Konsultieren Sie während der Ernte häufig den Referenzatlas, um sicherzustellen, dass der richtige ROI erzielt wird.
   HINWEIS: Ein Lupen- oder Sezierendes Mikroskop ist dabei oft hilfreich. Eine gute Beleuchtung ist ebenfalls unerlässlich. Led-Lampen mit niedriger Wattzahl oder eine kühle Lampe (siehe Materialtabelle)können hierfür verwendet werden.
3. Mit einem sauberen Skalpell oder Schlag, in den Abschnitt schneiden (Abbildung 4). Prechill jedes Werkzeug vor dem Schneiden, indem Sie es kurz zu Trockeneis zu berühren. Drücken Sie die Klinge sanft, aber fest in das Gewebe und schaukeln Sie sie hin und her, um den Schnitt zu machen. Drücken Sie nicht zu hart oder das Gewebe wird brechen.
   HINWEIS: Werkzeuge werden sich im Laufe der Zeit erwärmen. Leicht erwärmte Klingen können bei der Herstellung sauberer Schnitte hilfreich sein und das Frakturieren begrenzen, aber seien Sie vorsichtig, um das Auftauen von Gewebe zu vermeiden. Regelmäßig Werkzeuge auf Trockeneis kühlen.
4. Sobald ein ROI geerntet ist, legen Sie ihn in beschriftete, vorgekühlte 1,5 ml Rohre. Geerntetes Gewebe bei -80 °C lagern, bis es benötigt wird.
5. Auf diese Weise gesammeltes gefrorenes Gewebe durch Zugabe von kaltem RIPA-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS und Proteininhibitor-Cocktail (siehe Materialtabelle)) zur Proteinextraktion oder ein Guanidinium-haltiges Lösungsmittel (siehe Tabelle der Materialien)zur RNA-Extraktion in die gefrorene Probe und sofort homogenisieren deiner Glas-Dounce oder eines mechanischen Homogenisators (siehe Tabelle). Auf diese Weise sind Protease- und Nuklease-Inhibitoren vorhanden, da sich die Probe erwärmt, um Protein- und Nukleinsäuren vor Dementi zu schützen.

Ergebnisse

Um diese Methode zu validieren, wurde der mediale präfrontale Kortex von erwachsenen CD1-Wildtyp-Männchenmäusen gesammelt und RNA und Protein extrahiert und charakterisiert. RNA wurde durch kapillare Elektrophorese analysiert. Degradierte RNA zeigt einen Verlust an Intensität der 28S und 18S ribosomalen Bänder und zeigt auch Abbauprodukte als Abstrich zwischen 25 und 200 Nukleotiden(Abbildung 5A, Probe 1). Hochwertige RNA zeigt ausgeprägte ribosomale Bänder mit wenig bis gar keinem Si...

Diskussion

Diese Arbeit beschreibt eine Technik, um kleine, spezifische Regionen des Gehirns zu isolieren und gleichzeitig den Abbau von Nukleinsäure und Protein zu begrenzen. Schäden am Hirngewebe passieren schnell, sobald ein Organismus stirbt. Dies ist teilweise auf eine schnelle Anhäufung von extrazellulärem Glutamat und die daraus resultierende Exzitotoxizität zurückzuführen, die²¹auftritt. Messenger RNA ist besonders anfällig für Degradation^22,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 505C	Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 705C	Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes	Dot Scientific	229443	For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage gel	Invitrogen	NPO323BOX	protein gradient gel
Bioanalyzer System	Agilent	2100	RNA analysis system
Dounce tissue grinder	Millipore Sigma	D8938	Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	Cool lamp
Glass plates	LabRepCo	11074010
HALT	ThermoFisher	78440	protease inhibitor cocktail
Low profile blades	Sakura Finetek USA Inc.	4689
mouse anti-actin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	JLA20	Antibody
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade	Surgical Design Inc	17467673
Odyssey Blocking buffer	LiCor Biosciences	927-40000	Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125	VWR	10046-866	Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody	Cell Signaling Technology	94725S	Antibody
RNA Plus Micro Kit	Qiagen	73034	Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Scalpel handle	Excelta Corp.	16050103
Standard razor blades	American Line	66-0362
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Used to extract RNA from tissue