다운스트림 분석을 위한 냉동 설치류 뇌 영역 모음

요약

이 절차는 저렴하고 일반적으로 사용할 수있는 도구를 사용하여 고품질의 단백질과 RNA를 얻기 위해 이산 냉동 뇌 영역의 수집을 설명합니다.

초록

신경생물학에 대한 우리의 이해가 진행됨에 따라, 분자 분석은 종종 내측 전두엽 피질 (mPFC) 또는 핵 accumbens와 같은 작은 두뇌 지역에 실행됩니다. 이 작업의 과제는 검사할 미세 환경을 유지하면서 올바른 영역을 해부하는 것입니다. 이 백서에서는 대부분의 랩에서 쉽게 사용할 수 있는 리소스를 사용하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. 이 방법은 과정을 통해 동결 조직을 유지하여 핵산과 단백질을 보존합니다. 뇌는 뇌 매트릭스를 사용하여 0.5-1.0 mm 섹션으로 절단되고 냉동 유리 판에 배열됩니다. 각 섹션 내의 랜드마크는 알렌 마우스 브레인 아틀라스와 같은 참조와 비교되며, 지역은 차가운 메스 또는 생검 펀치를 사용하여 해부됩니다. 그런 다음 조직을 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 이 과정을 통해 쥐 및 마우스 mPFC, 핵 accumbens, 등쪽 및 복부 해마 및 그밖 지구는 qRT-PCR 및 서양 분석학을 사용하여 성공적으로 분석되었습니다. 이 방법은 명확한 랜드 마크에 의해 식별 될 수있는 뇌 영역으로 제한됩니다.

서문

이 연구는 알렌 마우스 브레인 아틀라스^1과같은 참조를 사용하여 고품질의 핵산 또는 단백질을 추출하기 위한 냉동 뇌 영역의 해부를 가이드로 보여줍니다. 이 기술에서, 뇌는 플래시 냉동 및 동결 된 상태에서 유지되는 동안 나중에 단면및 해부를 위해 -80 °C에서 저장됩니다. 이 과정을 통해 연구원은 한 세션에서 많은 수의 뇌를 수확하고 나중에 여러 뇌 영역의 정확한 수집을 위해 해부 할 수 있습니다.

유전자 및 단백질 발현과 관련된 질문에 답할 때 관심 있는 뇌 영역(ROI)의 정확한 수집이 종종 필요합니다. 약리학, 전기 생리학 및 광유전학은 관찰된 행동^2,,3,,4를뒷받침하는 분자 변화를 해명하는 것을 돕기 위하여 야생형 또는 유전자 변형 설치류에 사용될 수 있는 동안, 전사체 및 단백질에 있는 유도한 변경의 측정은 수시로 이 사실 인정을 지원하기 위하여 이용됩니다. 정량적 역전사 중합체 연쇄 반응(RT-qPCR), 서부 블로팅, RNAseq^5,MAPSeq⁶ 및 HPLC^7과 같은 기술은 견고하고 상대적으로 비용이 저렴하여 많은 실험실이 작은 뇌 영역^2,,4,,5,,6내에서 유도된 분자 변화를 연구할 수 있도록 합니다.

뇌 영역에서 핵산 또는 단백질을 추출하고 정제하는 방법에는 여러 가지가 있다^{8,,9,10,,911,,12.} 많은 실험실은 수확^9,,13의시간에 얼음에 뇌를 냉각하고 절단하여 뇌 영역을 수확 . 이러한 접근법은 고품질 의 핵산 및 단백질을 초래할 수 있지만, 조직의 미세 환경 내의 분해가 이들 온도에서 일어날 수 있기 때문에 다소 시간 제한적이다. 이것은 한 자리에 많은 수의 동물 이나 ROI를 해부 하려고 할 때 특히 사실 일 수 있습니다. 샘플을 동결상태로 유지하는 것은 비교적 순수한 샘플을 수집하기 위한 노력의 일환으로 각 섹션의 양쪽에 있는 랜드마크를 신중하게 비교할 수 있는 연구자의 시간을 제공하면서 비순한 표적 분자를 유지하는 데 도움이 됩니다. 레이저 포획은 뇌 영역에서 RNA 또는 단백질 분석을 위한 조직을 수집하는 또 다른 방법^10. 이 절차는 매우 작고 불규칙한 모양의 ROI가 식별되고 분리될 수 있다는 점에서 기계적 해부보다 우수하다. 그러나, 레이저 포획은 고가의 장비 및 시약의 사용에 의해 제한되며, 시간이 많이 소요되며 또한 시료 열화에 더 취약할 수 있다.

냉동 된 조직에 마이크로 펀치 해부는 새로운 것이 아닙니다. 미클로스 팔코비트와 다른 사람에 의해 초기 논문은 세부^{사항 14,,15의}기본 기술을 설명합니다 . 이 프레젠테이션은 주로 효율성을 용이하게하고 필요한 장비의 비용을 줄이기 위해 몇 가지 개선과 함께, 원래의 작업을 다음과 같습니다. 예를 들어, 뇌 섹션은 저온 저온 이기보다는 얼어 붙은 뇌 블록에서 만들어집니다. 이렇게 하면 ROI 샘플을 수집하는 데 필요한 섹션 수가 줄어듭니다. 이 방법은 또한 절연 된 상자 내에서 드라이 아이스에 앉아 냉동 유리 판에 샘플을 해부. 이것은 작동할 벤치에서 서브 동결 단계를 생성합니다. 이러한 방식으로 해부된 섹션은 쉽게 조작할 수 있으므로 연구원은 원하는 ROI 외부 영역의 오염을 제한하기 위해 각 섹션의 양쪽을 참조와 비교할 수 있습니다.

이 프로토콜의 장점은 1) 뇌가 과정 전반에 걸쳐 동결 된 상태로 유지되어 단백질과 핵산을 보존하고 연구원에게 ROI를 신중하게 수확할 시간을 주며 2) 필요한 시약이 저렴하고 대부분의 분자 생물학 실험실에서 발견된다는 것입니다. 이 과정에서 전체 뇌는 뇌 매트릭스에서 0.5-1.0 mm로 단면화되고 드라이 아이스로 지속적으로 냉각되는 냉동 유리 판에 놓입니다. 알렌 브레인 아틀라스에서 발견 된 랜드 마크¹ 또는 다른 뇌 지도판^16,,17 관심 영역을 식별하는 데 사용됩니다, 다음 차가운 펀치 또는 메스중 하나를 사용하여 해부되는. 조직이 결코 해동되지 않았기 때문에, 이러한 방식으로 수확된 부위는 다운스트림 분석을 위한 고품질 RNA 및 단백질을 제공한다.

프로토콜

이 연구에서 사용된 동물은 인디애나 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 국립 보건원 (NIH) 지침에 의해 명시된 대로 윤리적이고 인도적인 방식으로 취급되었습니다.

참고: 모든 공구와 표면은 작업을 시작하기 전에 뉴클레아제^18을 제거하기 위해 적절한 용매로 세척해야 합니다.

1. 뇌 저장

1. 안락사된 성인 CD1 야생형 마우스로부터 뇌를 빠르게 제거하고, 기존의 접근법^13을 이용하여 약 30 g의 무게를 가진 액체 질소 또는 드라이 아이스로 미리 냉각된 이소펜탄에서 60초 동안 플래시 동결한다.
2. 냉동 된 뇌를 알루미늄 호일 이나 원유관에 -80 °C에서 사용할 때까지 보관하십시오.

2. 뇌 매트릭스 준비

1. 조직을 해부하기 24 시간 전에 깨끗한 뇌 매트릭스 (재료 표참조)를 해동 된 냉동고 팩 위에 놓습니다. 두 개의 냉동고 팩 사이에 매트릭스의 측면을 끼워 면도기 슬롯의 바닥과 젤 팩의 상단 사이에 약 0.5 cm를 두십시오(그림 1A). 알루미늄 호일을 끝에 놓아 냉각을 돕습니다.
   참고 : 뇌 매트릭스를 구입할 때, 해부 될 뇌의 전체 볼륨을 감싸기에 충분히 큰 하나를 구입.
2. 뇌 매트릭스와 냉동고 팩이 들어 있는 상자를 -20°C 냉동실에 놓고 밤새 상단 ajar를 넣습니다.

3. 냉동 유리 판 설치

참고 :이 설정의 목적은 뇌 섹션을 해부하는 동결 표면을 준비하는 것입니다.

1. 얼음을 상단에서 약 5cm까지 절연 된 상자에 놓습니다. 그런 다음 2.5 cm 의 드라이 아이스 층을 얼음 위에 놓고 검은 색 플라스틱 시트로 덮어 샘플을 시각화하는 데 도움이됩니다(그림 1B, 그림 1C).
2. 플라스틱 위에 유리 판(상자 개구부에 꼭 맞아야 함)을 놓고 멀리 구석에 있는 판 위에 드라이 아이스를 놓습니다(그림1C).
3. 냉동고에서 얼어 붙은 뇌 매트릭스를 가지고 피질 쪽을 위로 절단할 뇌를 삽입합니다. 10 분 동안 상자의 온도에 평형을 유지하십시오.
4. 시상 부비동과 횡부비동이 블록의 수직 홈과 정렬되도록 차가운 집게로 매트릭스에서 뇌의 위치를 조정합니다(그림 1D). 이렇게 하면 대칭 섹션이 쉽게 해부를 할 수 있습니다. 뇌를 조정하기 전에 잠시 얼음을 건조 하는 집게의 터치 팁.
5. 뇌가 제자리에 있으면 차가운 면도날을 중앙 근처에 놓고 블레이드를 약 1mm 를 조직에 밀어 넣습니다. 로스트랄 과 꼬리 끝에 차가운 블레이드를 추가하여 뇌를 제자리에 고정시키세요(그림2A 및 그림 2B).
6. 로스트랄 끝에서 시작하여 블레이드를 한 번에 하나씩 추가하여 슬롯에 넣고 약 1mm(그림 2B)를조직으로 부드럽게 누릅니다. 1mm 간격으로 칼날을 계속 추가하여 꼬리 끝을 향해 작업합니다.
7. 이 시간 동안 뇌가 움직이지 않도록 하십시오. 블레이드를 수평 및 수직으로정렬합니다(그림 2B). 단면을 0.5mm 폭으로 자르기 위해 로우 프로파일 마이크로톤 블레이드(재료 표참조)를 사용할 수 있습니다. 더 큰 면도날 사이에놓습니다(그림 2C).
8. 블레이드가 제자리에 있으면 손가락, 손바닥 또는 다른 평평한 표면으로 그룹 상단을 누릅니다(그림 2C, 그림 2D). 블레이드 그룹을 좌우로 천천히 흔들어 조직을 통해 이동합니다.
   참고 : 이것은 약간의 시간이 걸릴 수 있습니다 (1-2 분) 인내심이 필요합니다. 조직을 통해 이동하는 블레이드에 대한 저항이 있어야합니다. 쉬운 항목은 뇌가 해동되고 블록을 드라이 아이스로 냉각해야한다는 것을 의미합니다.
9. 모든 블레이드가 슬롯의 바닥에 도달하면 블레이드 그룹의 각 측면을 잡고 앞뒤로 흔들어 매트릭스에서 자유롭게 작동합니다.
   참고: 칼날의 날카로운 모서리에 자르지 않도록 주의하십시오.
10. 그룹이 자유로워지면 스택, 로스트랄 측면을 유리 판 위에 놓습니다(그림2E). 드라이 아이스를 스택 옆 또는 위에 놓아 시료를 더 얼려서 쉽게 분리할 수 있습니다.
11. 유리 판에 날카로운 모서리가 있는 스택을 놓고 엄지손가락과 손가락 사이로 스택을 이동하여 블레이드를 분리합니다. 블레이드는 단면이 부착되어 서로 분리되어야 합니다.
12. 로스트랄에서 카우달까지 유리판에 섹션을정렬합니다(그림 2F).
13. 손가락 사이에 블레이드를 구부리거나 두 번째 차가운 면도기로 분리하여 블레이드에서 조직을 분리하십시오(그림 2G, 2H,2I).

4. 섹션 해부

1. 알렌 마우스 브레인 아틀라스 또는 다른 참조를 열고 관심 영역을 식별하는 데 필요한 랜드 마크를 찾을 수 있습니다. 몇몇 명백한 랜드마크는 전방 커미션, 코퍼스 callosum, 측심실 및 해마를 포함합니다(그림 3).
2. 차가운 집게로 절단할 섹션을 뒤집고 수집할 영역이 섹션 전체에서 일관되도록 합니다. 수확 하는 동안, 정확한 ROI를 얻을 수 있는지 확인 하려면 자주 참조 지도 서 를 참조 하십시오.
   참고: 돋보기 또는 해부 현미경은 종종이 과정에서 도움이됩니다. 좋은 조명도 필수적입니다. 낮은 와트 LED 램프 또는 시원한 램프 (재료 표참조)는이 목적을 위해 사용할 수 있습니다.
3. 깨끗한 메스 또는 펀치로 섹션으로 잘라냅니다(그림 4). 얼음을 건조하기 위해 짧게 터치하여 절단하기 전에 각 도구를 미리 냉각. 블레이드를 부드럽게 밀어 단단히 티슈에 밀어 넣고 앞뒤로 흔들어 잘라냅니다. 너무 세게 밀거나 조직이 골절되지 마십시오.
   참고: 도구는 시간이 지남에 따라 따뜻해집니다. 약간 따뜻하게 한 블레이드는 깨끗한 상처를 만드는 데 도움이 될 수 있으며 골절을 제한 할 수 있지만 조직의 해동을 피하십시오. 드라이 아이스에 정기적으로 도구를 식힙니다.
4. ROI가 수확되면, 라벨이 부착된 1.5mL 튜브에 넣습니다. 수확한 티슈를 필요할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
5. 이러한 방식으로 수집된 냉동 조직을 차가운 RIPA 버퍼(50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 0.5% CHAPS 및 단백질 억제제 칵테일(재료표 참조)) 단백질 추출을 위한, 또는 구니디늄 함유 용매(재료 Table of Materials 표참조)는 RNA 추출을 위한 동결된 시료로 추출하고 즉시 유리 Dounce 또는 기계적 호모겐 을 사용하여 균질화한다. Table of Materials 이런 식으로, 단백질및 뉴클레아제 억제제는 견본이 분해에서 단백질 과 핵산을 보호하기 위하여 온난으로 제자리에 있습니다.

결과

이 방법을 검증하기 위해, 내측 전두엽 피질을 성인 CD1 야생형 수컷 마우스 및 RNA로부터 수집하여 추출하고 특징화하였다. RNA는 모세관 전기동에 의해 분석되었다. 분해된 RNA는 28S 및 18S 리보좀 밴드의 강도에서 손실을 나타내고 또한 25 및 200 뉴클레오티드 사이의 얼룩으로서 분해 생성물을나타낸다(그림 5A,샘플 1). 고품질 RNA는 낮은 분자량 영역에서 신호가 거의 또는 전혀 ...

토론

이 작품은 핵산과 단백질의 분해를 제한하면서 뇌의 작은 특정 영역을 분리하는 기술을 설명합니다. 뇌 조직의 손상은 유기체가 죽으면 빠르게 발생합니다. 이것은 부분적으로 세포 외 글루타민산염의 급속한 축적과^{21발생하는}흥분독성에 기인한다. 메신저 RNA는 특히^{저하에 취약하다 22,,23.} 단백질과 핵산의 분해는^24년

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 505C	Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 705C	Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes	Dot Scientific	229443	For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage gel	Invitrogen	NPO323BOX	protein gradient gel
Bioanalyzer System	Agilent	2100	RNA analysis system
Dounce tissue grinder	Millipore Sigma	D8938	Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	Cool lamp
Glass plates	LabRepCo	11074010
HALT	ThermoFisher	78440	protease inhibitor cocktail
Low profile blades	Sakura Finetek USA Inc.	4689
mouse anti-actin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	JLA20	Antibody
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade	Surgical Design Inc	17467673
Odyssey Blocking buffer	LiCor Biosciences	927-40000	Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125	VWR	10046-866	Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody	Cell Signaling Technology	94725S	Antibody
RNA Plus Micro Kit	Qiagen	73034	Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Scalpel handle	Excelta Corp.	16050103
Standard razor blades	American Line	66-0362
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Used to extract RNA from tissue