Raccolta di regioni cerebrali del roditore congelato per analisi a valle

Riepilogo

Questa procedura descrive la raccolta di regioni cerebrali congelate discrete per ottenere proteine e RNA di alta qualità utilizzando strumenti economici e comunemente disponibili.

Abstract

Man mano che la nostra comprensione della neurobiologia è progredita, le analisi molecolari vengono spesso eseguite su piccole aree cerebrali come la corteccia prefrontale mediale (mPFC) o il nucleo accumbens. La sfida di questo lavoro consiste nel sezionare l'area corretta preservando il microambiente da esaminare. In questo articolo viene descritto un metodo semplice e a basso costo utilizzando risorse prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori. Questo metodo mantiene l'acido nucleico e le proteine mantenendo il tessuto congelato durante tutto il processo. I cervelli sono tagliati in sezioni da 0,5 a 1,0 mm utilizzando una matrice cerebrale e disposti su una piastra di vetro congelato. I punti di riferimento all'interno di ogni sezione vengono confrontati con un riferimento, ad esempio l'atlante del cervello del mouse di Allen, e le regioni vengono sezionate usando un punzone a base di bisturi freddo o di biopsia. Il tessuto viene poi immagazzinato a -80 gradi centigradi fino all'uso. Attraverso questo processo ratto e topo mPFC, nucleo accumbens, ippocampo ventrale e altre regioni sono stati analizzati con successo utilizzando qRT-PCR e assaggi occidentali. Questo metodo è limitato alle regioni cerebrali che possono essere identificate da punti di riferimento chiari.

Introduzione

Questo lavoro illustra la dissezione delle regioni cerebrali congelate per l'estrazione di acido nucleico o proteina di alta qualità utilizzando un riferimento, come l'Atlante del cervello del mouse Allen¹, come guida. In questa tecnica, i cervelli sono congelati da flash e vengono conservati a -80 gradi centigradi per la sezionamento e la dissezione successivi, pur essendo mantenuti in condizioni congelate. Questo processo permette al ricercatore di raccogliere un gran numero di cervelli in una sessione e successivamente sezionarli per una raccolta accurata di più regioni del cervello.

La raccolta accurata di regioni di interesse cerebrali (ROI) è spesso necessaria quando si risponde a domande relative all'espressione genica e proteica. Mentre farmacologia, elettrofisiologia e optogenetica possono essere utilizzate su roditori selvatici o geneticamente modificati per aiutare a chiarire i cambiamenti molecolari alla base dei comportamenti osservati^2,3,4, la misurazione dei cambiamenti indotti nei trascrittomi e nei proteomi è spesso utilizzata per sostenere questi risultati. Tecniche come la narrazione quantitativa inversa della polimerasi di trascrizione inversa (RT-qPCR), il gonfiore occidentale, RNAseq⁵, MAPSeq⁶ e HPLC⁷ sono robuste e relativamente basse in termini di costi, consentendo a molti laboratori di studiare cambiamenti molecolari indotti all'interno di piccole regioni cerebrali^2,4,5,6.

Ci sono diversi modi per estrarre e purificare l'acido nucleico o la proteina dalle regioni cerebrali^8,9,10,11,12. Molti laboratori raccolgono le regioni del cervello raffreddando e tagliando i cervelli sul ghiaccio al momento del raccolto^9,13. Anche se questo approccio può portare ad acido nucleico e proteine di alta qualità, è un po 'limitato nel tempo in quanto la degradazione all'interno del microambiente del tessuto può avvenire a queste temperature. Ciò può essere particolarmente vero quando si tenta di sezionare un gran numero di animali o ROI in una sola seduta. Mantenere i campioni congelati aiuta a mantenere molecole bersaglio labili, fornendo al ricercatore il tempo per confrontare attentamente i punti di riferimento su entrambi i lati di ogni sezione nello sforzo di raccogliere campioni relativamente puri. La cattura laser è un altro modo per raccogliere tessuti per l'analisi dell'RNA o delle proteine dalle aree cerebrali¹⁰. Questa procedura è superiore alla dissezione meccanica in quanto i ROI molto piccoli e di forma irregolare possono essere identificati e isolati. Tuttavia, la cattura laser è limitata dall'uso di costose attrezzature e reagenti, richiede molto tempo e può anche essere più suscettibile alla degradazione del campione.

La dissezione di micropunch sui tessuti congelati non è nuova. I primi documenti di Miklos Palkovits e altri descrivono le tecniche di base nel dettaglio^14,15. Questa presentazione segue in gran parte il lavoro originale, con alcuni miglioramenti per facilitare l'efficienza e ridurre i costi delle attrezzature necessarie. Per esempio, le sezioni cerebrali sono fatte in un blocco cerebrale congelato piuttosto che su un criostato. Questo produce sezioni più spesse che riduce il numero di sezioni necessarie per raccogliere campioni di ROI. Questo metodo seziona anche i campioni su una piastra di vetro congelato che si trova sul ghiaccio secco all'interno di una scatola isolata. Questo produce una fase di subcongelamento sul banco su cui lavorare. Le sezioni sezionate in questo modo sono facilmente manipolabili, consentendo al ricercatore di confrontare entrambi i lati di ogni sezione con un riferimento al fine di limitare la contaminazione da regioni al di fuori del ROI desiderato.

I vantaggi di questo protocollo sono che 1) il cervello è mantenuto in una condizione congelata durante tutto il processo, che aiuta a preservare le proteine e l'acido nucleico e dà al ricercatore il tempo di raccogliere con attenzione i ROI, e 2) i reagenti necessari sono poco costosi e si trovano nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare. In questo processo, interi cervelli sono sezionato a 0,5–1,0 mm in una matrice cerebrale e collocati su una piastra di vetro congelato che viene continuamente raffreddata con ghiaccio secco. Punti di riferimento trovati nell'Atlante del cervello di Allen¹ o in altri atlanti cerebrali^16,17 vengono utilizzati per identificare le regioni di interesse, che vengono poi sezionati utilizzando un pugno a freddo o bisturi. Poiché il tessuto non viene mai scongelato, le regioni raccolte in questo modo forniscono RNA e proteine di alta qualità per le analisi a valle.

Protocollo

Gli animali utilizzati in questo studio sono stati trattati in modo etico e umano come stabilito dalle linee guida Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Indiana University e National Institutes of Health (NIH).

NOTA: Tutti gli utensili e le superfici devono essere lavati con un solvente appropriato per rimuovere le nucleasi¹⁸ prima di iniziare qualsiasi lavoro.

1. Memorizzazione del cervello

1. Rimuovere rapidamente i cervelli dai topi selvatici adulti monottana CD1 del peso di circa 30 g utilizzando un approccio convenzionale¹³ e flash-freeze per 60 secondi in azoto liquido o isopentane pre-raffreddati con ghiaccio secco.
2. Conservare cervelli congelati a -80 gradi centigradi in un foglio di alluminio o in tubi conici fino all'uso.

2. Preparazione della matrice cerebrale

1. Ventiquattro ore prima di sezionare il tessuto, posizionare una matrice cerebrale pulita (vedi Tabella dei materiali)su una pila di confezioni di congelatori scongelati. Sandwich i lati della matrice tra due confezioni congelatore assicurandosi di lasciare circa 0,5 cm tra la parte inferiore degli slot del rasoio e la parte superiore dei pacchetti di gel (Figura 1A). Posizionare un foglio di alluminio alle estremità per facilitare il raffreddamento.
   NOTA: Quando si acquista una matrice del cervello, acquistare uno che è abbastanza grande per racchiudere l'intero volume del cervello da sezionare.
2. Posizionare la scatola contenente la matrice cerebrale e le confezioni del congelatore in un congelatore -20 gradi con il sojar superiore durante la notte.

3. Impostazione di una lastra di vetro congelata

NOTA: Lo scopo di questa configurazione è quello di preparare una superficie congelata su cui sezionare le sezioni cerebrali.

1. Mettere il ghiaccio in una scatola isolata fino a circa 5 cm dall'alto. Posizionare quindi uno strato di ghiaccio secco di 2,5 cm sopra il ghiaccio e coprire con lastre di plastica nera per facilitare la visualizzazione del campione (Figura 1B, Figura 1C).
2. Posizionare una lastra di vetro (dovrebbe solo adattarsi all'apertura della scatola) sulla parte superiore della plastica e posizionare il ghiaccio secco sulla parte superiore della piastra negli angoli lontani (Figura 1C).
3. Prendi la matrice cerebrale congelata dal freezer e inserisci il cervello da tagliare la corteccia verso l'alto. Lasciare ed eseguire l'ancognimento alla temperatura nella scatola per 10 min.
4. Regolare la posizione del cervello nella matrice con pinze fredde in modo che il seno sagittale e il seno trasversale si allineano con le scanalature perpendicolari del blocco (Figura 1D). Ciò contribuirà a garantire sezioni simmetriche per una più facile dissezione. Punte di tocco di pinze per asciugare il ghiaccio brevemente per raffreddare prima di regolare il cervello.
5. Una volta che il cervello è in posizione, posizionare una lama fredda del rasoio vicino al suo centro e premere la lama di circa 1 mm nel tessuto. Aggiungere lame refrigerate alle estremità rostrale e caudale per aiutare a mantenere il cervello in posizione (Figura 2A e Figura 2B).
6. Partendo dall'estremità rostrale, aggiungere le lame una alla volta, posizionandole negli slot e premendole delicatamente verso il basso nel tessuto di circa 1 mm (Figura 2B). Continuare ad aggiungere lame a intervalli di 1 mm lavorando verso l'estremità caudale.
7. Assicurarsi che il cervello non si sposta durante questo periodo. Allineare le lame orizzontalmente e verticalmente (Figura 2B). Per tagliare le sezioni in larghezze di 0,5 mm, possono essere utilizzate lame a microtomi a basso profilo (vedere Tabella dei materiali). Posizionarli tra le lame del rasoio più grandi (Figura 2C).
8. Una volta che le lame sono in posizione, premere verso il basso in cima al gruppo con le dita, palmo o qualche altra superficie piana (Figura 2C, Figura 2D). Rocciare il gruppo di lame lentamente da un lato all'altro per spostarli attraverso il tessuto.
   NOTA: Questa operazione potrebbe richiedere del tempo (1-2 min) e richiede pazienza. Ci dovrebbe essere resistenza alle lame che si muovono attraverso il tessuto. Facile ingresso significa che il cervello si sta scongelando e il blocco deve essere raffreddato con ghiaccio secco.
9. Quando tutte le lame hanno raggiunto il fondo degli slot, afferrare ogni lato del gruppo di lame e lavorare libero dalla matrice dondolando avanti e indietro.
   NOTA: Prestare attenzione per evitare di tagliarsi sui bordi taglienti delle lame.
10. Una volta che il gruppo è libero, posizionare la pila, lato rostrale verso l'alto, sulla lastra di vetro (Figura 2E). Posizionare il ghiaccio secco accanto e/o sopra la pila per congelare ulteriormente i campioni per una separazione più facile.
11. Posizionare la pila con bordi taglienti verso il basso sulla lastra di vetro e lame separate spostando la pila tra pollici e dita. Le lame devono separarsi l'una dall'altra con le sezioni attaccate.
12. Allineare le sezioni sulla lastra di vetro da rostral a caudal (Figura 2F).
13. Separare il tessuto dalle lame flettendo le lame tra le dita o separandolo con un secondo rasoio freddo (Figure 2G,2H,2I).

4. Sezioni di dissecting

1. Apri l'Atlante del cervello del topo di Allen o un altro riferimento e trova i punti di riferimento necessari per identificare le regioni di interesse. Alcuni punti di riferimento ovvi includono il commissure anteriore, il corpo calloso, i ventricoli laterali e l'ippocampo (Figura 3).
2. Capovolgere la sezione da tagliare con pinze refrigerate e assicurarsi che la regione che sta per essere raccolta sia coerente in tutta la sezione. Durante la raccolta, consultare spesso l'atlante di riferimento per assicurarsi che si ottenga il ROI corretto.
   NOTA: Una lente di ingrandimento o un microscopio di sezionato è spesso utile in questo processo. Una buona illuminazione è anche essenziale. Lampade a LED a basso wattaggio o una lampada fredda (vedi Tabella dei materiali) possono essere utilizzati a questo scopo.
3. Con un bisturi pulito o un punzone, tagliare nella sezione (Figura 4). Prechill ogni utensile prima di tagliare toccandolo brevemente per asciugare il ghiaccio. Spingere delicatamente la lama ma saldamente nel tessuto, dondolandola avanti e indietro per fare il taglio. Non spingere troppo forte o il tessuto si frattura.
   NOTA: gli utensili si riscaldano nel tempo. Le lame leggermente riscaldate possono essere utili per fare tagli puliti e possono limitare la fratturazione, ma fai attenzione a evitare lo scongelamento dei tessuti. Raffreddare periodicamente gli utensili sul ghiaccio secco.
4. Una volta raccolto un ROI, metterlo in tubi etichettati da 1,5 mL presondati. Conservare i tessuti raccolti a -80 gradi centigradi fino a quando necessario.
5. Elaborare il tessuto congelato raccolto in questo modo aggiungendo buffer RIPA freddo (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS e cocktail inibitori proteici (vedi Tabella dei materiali))per l'estrazione di proteine, o un solvente contenente guanidinium (vedi Tabella dei materiali ) per l'estrazione dell'RNA sul campione congelato e immediatamente omogeneizzare utilizzando un dounce di vetro o un omogenizzatore meccanico (vedi Tabella dei materiali). Table of Materials In questo modo, gli inibitori della proteasi e della nuclea sono in atto quando il campione si riscalda per proteggere le proteine e gli acidi nucleici dalla degradazione.

Risultati

Per convalidare questo metodo, la corteccia prefrontale mediale è stata raccolta da topi maschi di tipo selvatico CD1 adulti e l'RNA e la proteina sono stati estratti e caratterizzati. L'RNA è stato analizzato dall'elettroforesi capillare. L'RNA degradato mostra una perdita nell'intensità delle bande ribosomale 28S e 18S e mostra anche i prodotti di degradazione come uno striscio tra 25 e 200 nucleotidi (Figura 5A, campione 1). L'RNA di alta qualità mostra bande ribosomiche distinte con ...

Discussione

Questo lavoro descrive una tecnica per isolare piccole regioni specifiche del cervello limitando la degradazione dell'acido nucleico e delle proteine. Il danno ai tessuti cerebrali avviene rapidamente una volta che un organismo muore. Ciò è in parte dovuto a un rapido accumulo di glutammato extracellulare e alla conseguente eccitotossicità che si verifica²¹. L'RNA messaggero è particolarmente vulnerabile alla degradazione^22,23. La ripa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 505C	Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 705C	Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes	Dot Scientific	229443	For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage gel	Invitrogen	NPO323BOX	protein gradient gel
Bioanalyzer System	Agilent	2100	RNA analysis system
Dounce tissue grinder	Millipore Sigma	D8938	Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	Cool lamp
Glass plates	LabRepCo	11074010
HALT	ThermoFisher	78440	protease inhibitor cocktail
Low profile blades	Sakura Finetek USA Inc.	4689
mouse anti-actin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	JLA20	Antibody
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade	Surgical Design Inc	17467673
Odyssey Blocking buffer	LiCor Biosciences	927-40000	Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125	VWR	10046-866	Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody	Cell Signaling Technology	94725S	Antibody
RNA Plus Micro Kit	Qiagen	73034	Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Scalpel handle	Excelta Corp.	16050103
Standard razor blades	American Line	66-0362
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Used to extract RNA from tissue