Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

Özet

Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar.

Özet

Nörobiyoloji anlayışımız ilerledikçe, moleküler analizler genellikle medial prefrontal korteks (mPFC) veya nükleus accumbens gibi küçük beyin bölgelerinde yapılır. Bu çalışmada sorun incelenecek mikroortamı korurken doğru alanı incelemektir. Bu yazıda, çoğu laboratuvarda kolayca bulunan kaynakları kullanarak basit, düşük maliyetli bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, işlem boyunca doku dondurulmuş tutarak nükleik asit ve proteinleri korur. Beyinler bir beyin matrisi kullanılarak 0.5-1.0 mm kesitler halinde kesilir ve donmuş cam plaka üzerine yerleştirilir. Her bölümdeki yerler Allen Mouse Beyin Atlası gibi bir referansla karşılaştırılır ve bölgeler soğuk neşter veya biyopsi yumruğu kullanılarak kesilir. Doku daha sonra kullanıma kadar -80 °C'de saklanır. Bu işlem sayesinde sıçan ve fare mPFC, nucleus accumbens, dorsal ve ventral hipokampus ve diğer bölgelerde başarıyla qRT-PCR ve Batı tahlilleri kullanılarak analiz edilmiştir. Bu yöntem açık yerler tarafından tespit edilebilir beyin bölgeleri ile sınırlıdır.

Giriş

Bu çalışma, bir rehber olarak Allen Mouse Beyin Atlası¹gibi bir referans kullanarak yüksek kaliteli nükleik asit veya protein çıkarılması için dondurulmuş beyin bölgelerinin diseksiyon göstermektedir. Bu teknikte beyinler flaş dondurulmuş ve dondurulmuş bir durumda muhafaza edilirken daha sonra kesit ve diseksiyon için -80 °C'de saklanır. Bu süreç araştırmacı bir oturumda beyin çok sayıda hasat ve daha sonra birden fazla beyin bölgeleri doğru bir koleksiyon için onları incelemek için izin verir.

Gen ve protein ekspresyonu ile ilgili soruları yanıtlarken genellikle beyin bölgelerinin (ROI) doğru toplanması gereklidir. Farmakoloji, elektrofizyoloji ve optogenetik yabani tip veya genetiği değiştirilmiş kemirgenler üzerinde gözlenen davranışları destekleyen moleküler değişikliklerin aydınlatılmasına yardımcı olmak için kullanılabilir iken^2,3,4, transkripsiyon ve proteomlarda indüklenen değişikliklerin ölçümü genellikle bu bulguları desteklemek için kullanılır. Nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR), batı lekeleme, RNAseq^5,MAPSeq⁶ ve HPLC⁷ gibi teknikler sağlam ve nispeten düşük maliyet, birçok laboratuvarküçük beyin bölgeleri içinde indüklenen moleküler değişiklikleri incelemek için izin^2,4,5,6.

Beyin bölgelerinden nükleik asit veya protein ayıklamak ve arındırmak için çeşitli yollar vardır^8,9,10,11,12. Birçok laboratuvarlar hasat sırasında buz üzerinde beyinleri dondurup keserek beyin bölgelerini hasat eder^9,13. Bu yaklaşım yüksek kaliteli nükleik asit ve proteine yol açsa da, bu sıcaklıklarda dokunun mikro ortamında bozulma olabileceğinden biraz zaman sınırlıdır. Bu özellikle bir oturuşta çok sayıda hayvanı veya ROI'yi incelemeye çalışırken doğru olabilir. Numuneleri dondurulmuş tutmak, araştırmacıya nispeten saf numuneler toplama çabasında her bölümün her iki tarafındaki simgeleri dikkatle karşılaştırması için zaman sağlarken, labile hedef moleküllerinin korunmasına yardımcı olur. Lazer yakalama beyin bölgelerinden RNA veya protein analizi için doku toplamak için başka bir yoldur¹⁰. Bu işlem, çok küçük ve düzensiz şekilli ROI'ların tespit edilip izole edilebildiği mekanik diseksiyondan daha üstündür. Ancak, lazer yakalama pahalı ekipman ve reaktiflerin kullanımı ile sınırlıdır, zaman alıcı ve aynı zamanda örnek bozulmasına daha duyarlı olabilir.

Dondurulmuş dokularda mikropunch diseksiyonu yeni değildir. Miklos Palkovits ve diğerleri tarafından erken kağıtları ayrıntılı olarak temel teknikleri açıklamak^14,15. Bu sunum büyük ölçüde verimliliği kolaylaştırmak ve gerekli ekipman giderini azaltmak için bazı iyileştirmeler ile, orijinal çalışma izler. Örneğin, beyin bölümleri dondurulmuş beyin bloğu yerine bir kriyostat yapılır. Bu, yatırım getirisi örnekleri toplamak için gereken kesit sayısını azaltan daha kalın bölümler üretir. Bu yöntem aynı zamanda yalıtılmış bir kutu içinde kuru buz üzerinde oturur dondurulmuş cam plaka üzerinde örnekleri inceler. Bu, üzerinde çalışmak için tezgah bir alt donma aşaması üretir. Bu şekilde incelenen bölümler kolayca manipüle edilebilir, böylece araştırmacı her bölümün her iki tarafını da istenilen Yatırım Getirisi dışındaki bölgelerden gelen kontaminasyonu sınırlamak için bir referansla karşılaştırmak için.

Bu protokolün avantajları 1) beyin protein ve nükleik asit korunmasına yardımcı olur ve dikkatle ROI hasat için araştırmacı zaman verir ve 2) gerekli reaktifler ucuz ve en moleküler biyoloji laboratuarlarında bulunan süreç boyunca dondurulmuş bir durumda tutulur. Bu süreçte, tüm beyinler bir beyin matris0.5-1.0 mm kesitli ve sürekli kuru buz ile soğutulmuş bir dondurulmuş cam plaka üzerine yerleştirilir. Allen Beyin^{Atlası bulunan} Yerler 1 veya diğer beyin atlasları^16,17 ilgi bölgelerini tanımlamak için kullanılır, hangi sonra soğuk bir yumruk veya neşter kullanılarak kesilir. Doku asla çözülmemedığından, bu şekilde hasat edilen bölgeler, downstream analizleri için yüksek kaliteli RNA ve protein sağlar.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergeleri tarafından belirlenen etik ve insancıl bir şekilde ele alındı.

NOT: Tüm aletler ve yüzeyler, herhangi bir işe başlamadan önce¹⁸ nükleazları çıkarmak için uygun bir çözücü ile yıkanmalıdır.

1. Beyinlerin depolanması

1. Geleneksel bir yaklaşım¹³ kullanarak yaklaşık 30 g ağırlığındaki ötenazi yetişkin CD1 wildtype farelerin beyinlerini hızlı bir şekilde çıkarın ve kuru buzla önceden soğutulmuş isopentane 60 saniye boyunca flaş dondurun.
2. Dondurulmuş beyinleri -80 °C'de alüminyum folyo veya konik tüplerde kullanıma kadar saklayın.

2. Beyin matrisinin hazırlanması

1. Doku ları incelemeden 24 saat önce, erimiş dondurucu paketleri yığınına temiz bir beyin matrisi (Bkz. Malzemeler Tablosu)yerleştirin. Sandviç iki dondurucu paketleri arasında matris kenarları jilet yuvalarının alt ve jel paketlerinin üst arasında yaklaşık 0,5 cm bırakmak emin olun(Şekil 1A). Soğutma yardımcı olmak için uçları alüminyum folyo yerleştirin.
   NOT: Bir beyin matrisi satın alırken, kesilecek beynin tüm hacmini kaplayacak kadar büyük bir tane satın alın.
2. Beyin matrisi ve dondurucu paketlerini içeren kutuyu -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.

3. Dondurulmuş cam plaka kurma

NOT: Bu kurulumun amacı, beyin kesitlerini incelemek için donmuş bir yüzey hazırlamaktır.

1. Üstten yaklaşık 5 cm kadar yalıtılmış bir kutuya buz yerleştirin. Daha sonra buzun üzerine 2,5 cm'lik kuru buz tabakası yerleştirin ve numunenin görselleştirilmesine yardımcı olmak için siyah plastik kaplama ile örtün(Şekil 1B, Şekil 1C).
2. Plastik üzerine cam bir tabak (sadece kutunun açılmasına sığmalıdır) yerleştirin ve uzak köşelerde plakanın üstüne kuru buz yerleştirin(Şekil 1C).
3. Dondurucudan donmuş beyin matrisini alın ve beyni korteks tarafına doğru kesecek şekilde yerleştirin. Kutudaki sıcaklığı 10 dakika boyunca dengelemesine izin verin.
4. Beynin matristeki pozisyonunu soğuk çözgülerle ayarlayın, böylece sagittal sinüs ve enine sinüs bloğun dik oluklarıyla hizaya getirin(Şekil 1D). Bu daha kolay diseksiyon için simetrik bölümlerin sağlanmasına yardımcı olacaktır. Beyni ayarlamadan önce soğumak için buzun kuruması için püre uçlarıdokunun.
5. Beyin yerleştirildikten sonra, merkezine yakın bir soğutulmuş jilet yerleştirin ve bıçağı dokuya yaklaşık 1 mm bastırın. Beynin yerinde tutmasına yardımcı olmak için rostral ve kaudal uçlara soğutulmuş bıçaklar ekleyin(Şekil 2A ve Şekil 2B).
6. Rostral ucundan başlayarak, bıçakları birer birer birer ekleyerek yuvalara yerleştirip yavaşça dokuya bastırarak yaklaşık 1 mm(Şekil 2B)ekleyin. Kaudal uçlara doğru çalışan 1 mm aralıklarla bıçak eklemeye devam edin.
7. Bu süre içinde beynin kaymadığından emin olun. Bıçakları yatay ve dikey olarak hizala (Şekil 2B). Kesitleri 0,5 mm genişlikte kesmek için düşük profilli mikrotom bıçakları (bkz. Malzeme Tablosu)kullanılabilir. Bunları daha büyük jiletlerin arasına yerleştirin (Şekil 2C).
8. Bıçaklar yerleştirildikten sonra, parmakları, avuç içi veya başka bir düz yüzeyle grubun üstüne bastırın(Şekil 2C, Şekil 2D). Bıçak grubunu yavaşça bir taraftan diğer yana sallayarak dokuda hareket ettirin.
   NOT: Bu biraz zaman alabilir (1-2 dk) ve sabır gerektirir. Dokuda hareket eden bıçaklara karşı direnç olmalı. Kolay giriş beyin erime ve blok kuru buz ile soğutulması gerektiği anlamına gelir.
9. Tüm bıçaklar yuvaların altına ulaştığında, bıçak grubunun her iki tarafını da tutun ve ileri geri sallayarak matristen uzak çalışın.
   NOT: Bıçakların keskin kenarlarında kendini kesmemek için dikkatli olun.
10. Grup serbest kaldıktan sonra, desteyi, rostral tarafını yukarı, cam plakanın üzerine yerleştirin (Şekil 2E). Daha kolay ayrıştırmak için numuneleri daha fazla dondurmak için kuru buzu yığının yanına ve/veya üzerine yerleştirin.
11. Desteyi keskin kenarları olan desteyi cam plakaya ve ayrı bıçaklara yerleştirerek desteyi başparmaklar ve parmaklar arasında kaydırın. Bıçaklar birbirine bağlı bölümlerle ayrılmalıdır.
12. Rostral'dan kaudal'a kadar cam plaka üzerindeki bölümleri sıralayın (Şekil 2F).
13. Bıçakları parmaklar arasında esneterek veya ikinci bir soğuk jiletle ayırarak bıçaklardan ayrı doku(Şekil 2G,2H,2I).

4. Kesitlerin kesilmesi

1. Allen Mouse Beyin Atlası'nı veya başka bir referansı açın ve ilgi çekici bölgeleri belirlemek için gerekli olan simge seli bulun. Bazı belirgin yerler anterior komissür, korpus callosum, lateral ventriküller ve hipokampus içerir (Şekil 3).
2. Soğutulmuş çömeçlerle kesilecek bölümü çevirin ve toplanacak bölgenin bölüm boyunca tutarlı olduğundan emin olun. Hasat sırasında, doğru yatırım getirisielde olduğundan emin olmak için genellikle referans atlası danışın.
   NOT: Büyüteç veya diseksiyon mikroskobu genellikle bu süreçte yararlıdır. İyi aydınlatma da gereklidir. Düşük watt LED lambalar veya serin bir lamba (Malzeme Tablosubakınız) bu amaç için kullanılabilir.
3. Temiz bir neşter veya yumruk ile, bölüm(Şekil 4)içine kesilmiş. Her aleti kısa bir süre donatarak buzun kuruması için kesmeden önce önceden soğutun. Bıçağı hafifçe ama sıkıca dokuya doğru itin, keserek ileri geri sallayın. Çok sert itme yoksa doku kırılacaktır.
   NOT: Araçlar zamanla ısınır. Hafif ısınmış bıçaklar temiz kesim yapımında yararlı olabilir ve kırılma sınırlayabilir, ancak doku erimeönlemek için dikkatli olun. Periyodik olarak kuru buz üzerinde aletleri chill.
4. Bir yatırım getirisi hasat edildikten sonra, etiketli, önceden soğutulmuş 1,5 mL tüpler içine yerleştirin. Hasat edilen dokuları -80 °C'de ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
5. Soğuk RIPA tamponu (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% CHAPS ve protein inhibitörü kokteyl (Malzemeler Tablosubakınız ) protein ekstraksiyon için, ya da guanidinium içeren çözücü (Malzemeler Tablosubakınız) dondurulmuş örnek rna çıkarma ve hemen bir cam Dounce veya mekanik geni homozer kullanarak homojenleştirmek (Malzemeler Tablosubakınız). Bu şekilde, proteaz ve nükleaz inhibitörleri, protein ve nükleik asitleri bozulmadan korumak için ısıtındıkça yerinde olurlar.

Sonuçlar

Bu yöntemi doğrulamak için medial prefrontal korteks erişkin CD1 wildtype erkek farelerden toplanmış ve RNA ve protein elde edilmiştir. RNA kapiller elektroforez ile analiz edildi. Bozulmuş RNA, 28S ve 18S ribozomal bantların yoğunluğunda bir kayıp gösterir ve ayrıca 25 ile 200 nükleotit arasında yayma olarak bozunma ürünlerini gösterir(Şekil 5A, örnek 1). Yüksek kaliteli RNA, düşük molekül ağırlıklı bölgede çok az veya hiç sinyal olmayan belirgin ribozomal b...

Tartışmalar

Bu çalışma, nükleik asit ve protein ingradasyonunu sınırlandırırken beynin küçük, belirli bölgelerini izole etme tekniğini tanımlar. Bir organizma öldüğünde beyin dokularına zarar hemen gerçekleşir. Bu kısmen ekstrasellüler glutamat hızlı birikme ve²¹oluşur sonucu eksitotoksisite kaynaklanmaktadır. Messenger RNA özellikle bozulmaya karşı savunmasız^{dır 22,23}. Protein ve nükleik asit dökümü büyük ölçü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 505C	Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 705C	Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes	Dot Scientific	229443	For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage gel	Invitrogen	NPO323BOX	protein gradient gel
Bioanalyzer System	Agilent	2100	RNA analysis system
Dounce tissue grinder	Millipore Sigma	D8938	Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	Cool lamp
Glass plates	LabRepCo	11074010
HALT	ThermoFisher	78440	protease inhibitor cocktail
Low profile blades	Sakura Finetek USA Inc.	4689
mouse anti-actin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	JLA20	Antibody
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade	Surgical Design Inc	17467673
Odyssey Blocking buffer	LiCor Biosciences	927-40000	Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125	VWR	10046-866	Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody	Cell Signaling Technology	94725S	Antibody
RNA Plus Micro Kit	Qiagen	73034	Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Scalpel handle	Excelta Corp.	16050103
Standard razor blades	American Line	66-0362
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Used to extract RNA from tissue