ヒト脂肪由来幹細胞を培養するための活性化多血小板血漿の調製

要約

本報告では、活性化多血小板血漿(PRP)を調製するためのダブルスピン法について述べる。自家トロンビンを用いて、ヒト脂肪由来幹細胞(hASC)を培養しました。活性化されたPRPは、hASCの増殖を促進することが示されました。

要約

全血から遠心分離により調製した活性化多血小板血漿(PRP)は、数種類の培養細胞で増殖刺激効果を示しており、再生医療への応用が期待されています。ここでは、全血からPRPを調製するためにダブルスピン法を使用しました。PRPは自家トロンビンによってさらに活性化されました。活性化されたPRPで血小板数を測定し、ヒト脂肪由来幹細胞(hASC)の増殖刺激効果を調べました。結果として得られる血小板数は、PRPでは全血漿よりも11.5倍高かった。hASCの増殖は、1% PRPとのインキュベーションによって著しく増強されました。記載された方法は、高濃度の血小板でPRPを再現性よく調製するために用いることができる。この方法で調製したPRPは、hASCの増殖を著しく促進します。

概要

活性化多血小板血漿 (PRP) は、全血の遠心分離によって調製され、ベースライン レベル¹ をはるかに超える血小板が含まれていることが示されています。自家RPPは、創傷治癒²、骨損傷³、美容外科^4,5などの外科的治療に広く使用されています。PRPにおける血小板の活性化後、血小板中に存在するα顆粒は、血小板由来成長因子(PDGF)、上皮成長因子(EGF)、インスリン様成長因子(IGF)、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)など、いくつかの成長因子を放出する^1,6,7。これらの成長因子は、細胞増殖⁸、遊走⁹、分化⁹において重要な役割を果たす。

今日までに、いくつかの研究が、異なる種類の細胞^{10、11、12、13、14、15、16}におけるPRPの増殖刺激効果を報告している。これらの細胞タイプの1つは、ヒト脂肪由来幹細胞(hASC)です。hASCはヒトの脂肪組織に存在し、簡単に大量に収集できます。hASCの再生効果は、^{臨床応用8}への潜在的な使用をさらに示唆しています。私たちの以前の研究では、非活性化PRPと比較して、活性化PRPはhASCおよびヒト真皮線維芽細胞(hDF^{)に対して}顕著な増殖効果を示したことが報告されています8。また、PRPはERK1/2シグナル伝達経路を通じてhDFの増殖を促進することを報告した¹⁷。最近、PRPがERK1/2、JNK、Aktシグナル伝達経路を介してhASCの増殖を促進することも報告した¹⁸。hASCでは、PRPは増殖を促進するサプリメントとして重要な役割を果たしています。hASCに対するPRPの影響に関する知識は、大規模な培養法の開発に役立ち、hASCの増殖メカニズムに関するさらなる研究を可能にします。

本報告では、全血から遠心分離法を用いてPRPを調製する方法を紹介し、説明する。この方法では、ダブルスピン法を使用して、PRPの安定したサンプルを簡単に調製できます。PRPの生物学的機能を評価するために、集中血小板数といくつかの増殖因子の濃度を測定しました。また、調製したPRPを用いてhASCsを培養することで、成長促進効果を確認しました。

プロトコル

本研究は、1975年のヘルシンキ宣言の倫理指針に基づき、関西医科大学の倫理審査委員会によって承認されました。すべての検体は、ドナーからのインフォームドコンセントに基づいて収集および使用されました。

1. 事前準備

1. インフォームドコンセントを得た後、健康な成人ドナーから採血します。ここでは、28歳から38歳までの4人の男性献血者から採血されました。
   1. ドナーには、採血の6時間前に500mLの水を飲むことをお勧めします。
      注:健康な成人におけるヘモグロビン(Hb)、赤血球(RBC)数、および血小板(PL)濃度の参照範囲は、^Vajpayee19によって説明されています。献血に適したものであるためには、ドナーの血液分析がこれらの範囲内にある必要があります。

2.採血

1. 処置中は献血者に座ってもらいます。
2. 手袋を着用してください。ドナーが拳を作っている間、ドナーの上腕に止血帯を固定します。
3. 適切な静脈が見つかったら、70%アルコールで皮膚を2回滅菌し、針を挿入します。
4. 21Gの注射器を使用して採血します。採血中に止血帯を緩めないでください。
   1. 8.5mLの採血チューブを使用して採血します。チューブ内の血液の状態を観察し、血流が遅くなったらすぐに新しいチューブに交換します。
   2. PRPを作るのに十分な量の血液を採取します。抗凝固血液の4本のチューブを総量34mLで収集します。チューブを10回反転させて、血液を抗凝固剤と混合します。
   3. 抗凝固剤を含まない10 mLの血清採血チューブ( 材料の表を参照)を使用して、活性化剤を作成するための血液を採取します(ステップ4を参照)。.10mLの非抗凝固血液を採取します。.

3. PRPを作るためのダブルスピン法

1. 血小板数のために40μLの抗凝固全血を服用してください。フィルター付きのピペットチップを使用して、ピペットを血液汚染から保護します。
2. 抗凝固剤を添加した全血を450 x g および室温で7分間遠心分離します。これは、層状血液サンプルを取得する最初のスピンです。上層は血漿画分、中間層は細いバフィーボート、最下層は赤血球で構成されています。
3. マーカーを使用して、バフィーコートの2mm下に線を引きます。
4. 長いカニューレ付きの20 mLシリンジを使用して、バフィーコートのすぐ下の2 mmマークまで血漿を収集します。.バフィーコートの黄色い血漿には、血小板、白血球、および一部の赤血球が含まれています。2本のチューブから血漿を血清採血管に集めます。4本のチューブの内容物を2本のチューブに結合し、総量16mLの血漿を採取します。
5. バフィーコートを塗布したプラズマを1,600 x g 、室温で5分間遠心分離します。これが2回目のスピンです。層状血液サンプルの上清は血小板欠血漿(PPP)です。
6. 長いカニューレを備えた20 mLシリンジを使用して、PPPを1 mLの液体を含む50 mLの血清採血チューブに移します。残りの 1 mL 血漿中の血小板ペレットに蓄積した血小板を PRP として使用しました。収集されたPRPの総量は2mLでした。
7. 各チューブでPRPをボルテックスし、1つのチューブにプールします(合計2mL)。
8. 血小板数のためにPRPを400μL取ります。
9. PRPを、各チューブに約400 μLを含む数本の1.5 mLチューブに分注します。チューブは全部で4本あります。チューブあたり約500μLのPRPが推奨されます。

4.アクチベーターを準備します

1. 抗凝固剤を含まない10 mLの血液を血清採血管に入れ(ステップ2.3.3)、室温で30分間放置します。.
2. 抗凝固剤を含まない血液サンプルを、実験室用遠心分離機で2,015 x g および室温で8分間遠心分離します。
3. 上清を自家トロンビンとして収集します。
4. 0.5 M CaCl₂ と自家トロンビンを1:1(v/v)比で活性化剤として混合します。例えば、500μLのCaCl₂ を500μLの自家トロンビンと混合した。アクチベーターの総量を1mLにします。

5. PRPの活性化

1. PRPとアクチベーターを10:1(v / v)の比率で混合します。各1.5 mLチューブに400 μLのPRPと40 μLのアクチベーターを混合し、室温で10分間インキュベートします。これは凝固した形で活性化されたPRPです。

6. PRPの保管

1. 遠心分離機は、4°Cの実験室用遠心分離機でPRPを9,000 x g で10分間活性化しました。
2. 上清をピペットで適切な容量のシリンジに集めます。.
3. 0.22 μmのメンブレンを通して上清をろ過します。
4. 最終的なPRPは、使用するまで-80°Cで保存してください。

7. 血小板濃度と成長因子レベルの測定

1. 全血漿およびPRP中の血小板数を、自動血液学システムを用いてカウントします( 「材料の表」を参照)。
2. 市販のELISAキットを使用して、全血漿および活性化PRP中のPDGF-BB、IGF、およびEGFレベルの濃度を分析します( 材料の表を参照)。

8. 細胞増殖アッセイ

1. 前述の方法¹⁸を使用してhASCを分離します。
   1. 24ウェル培養プレートで1.0 x 10⁴ 細胞/ウェルの密度でhASCを播種し、10% FBSと抗生物質を含むDMEMで37°Cで一晩インキュベートします。 実験では、継ぎ目7〜9のhASCを使用します。
2. 細胞培地を無血清DMEMに置き換えてください。6時間後、指定濃度のPRPを添加し、さらに37°Cで48時間インキュベートします。
3. WST-8溶液( 材料表を参照)と37°Cで1時間インキュベートします。 マルチウェルプレートリーダーで450nmの吸光度を読み取ります。
4. 標準曲線を作成する:密度0、6,250、12,500、25,000、50,000、および100,000細胞/ウェルのhASCを、10% FBSを10% FBSで3時間DMEMの24ウェルプレートに播種します。WST-8溶液を37°Cで1時間インキュベートした後、450 nmで吸光度を読み取ります
   1. セル数と A_{450 nm} をプロットして、標準曲線を描画します。
5. 標準曲線に基づいて吸光度からhASCの数を推定します。

結果

PRP中の血小板およびPDGF-BBの濃縮濃度
PRP中の血小板とPDGF-BBの濃度は、全血漿の濃度よりもそれぞれ11.5倍と25.9倍に増加しました。しかし、PRP中のEGFの濃度は変化せず、IGFは全血漿の70%に過ぎませんでした(表1)。実験はダブルスピン法によって4回再現されました。

PRP刺激によるhASCの増殖促進
細胞増殖は?...

ディスカッション

PRPの活性化後、PDGF、EGF、IGF、TGF-β、およびVEGF1,6,7などのいくつかの成長因子は、創傷治癒を促進する創傷の細胞および組織を「活性化」する^20,21。美容再建手術の場合、活性化細胞は治癒を誘発し、審美性を向上させることが示されています

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 mL Syringe, Terumo syringe lock type	Terumo, Tokyo, Japan.	SS-20LZP
50 mL Tube, Polypropylene Conical Tube	Corning, NY, USA.	352070
Automated Hematology System	Sysmex Corp., Tokyo, Japan	XE-2100
Blood Collection Needle, SafeTouch PSV set with luer adapter, 21 G x 3/4”	Nipro, Osaka, Japan.	32-384
Blood Collection Tube, ACD Solution A Blood Collection Tube, 8.5 mL	BD Vacutainer, NJ, USA.	364606
Blood Collection Tube, Serum Blood Collection Tube/monovette, 10 mL	BD Vacutainer, NJ, USA.	366430
Calcium Chloride, 1 mEq/ mL,	Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan.	3215400A1061
Cannula, BS non-bevel needle, 18 G (1.2 mm) x 75 mm	BS Medical, Tokyo, Japan.	BS-81007	Not for sale
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan	CK04
Centrifuge	Kokusan, Tokyo, Japan.	H-19F
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany.	5415R
EnSpire 2300 Multilabel Reader	PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
Filter Unit	Merck Millipore, Co. Cork, Ireland.	SLGP033RS
Human EGF Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DEG00
Human IGF-I Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DG100
Human PDGF-BB Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DBB00
Pipette Tip, ART 1000 Reach Barrier Tip	Thermo Scientific, MA, USA.	2079-05-HR
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μL	Nichiryo, Saitama, Japan.	00-NPX2-1000
Sterling Nitrile Power-Free Exam Gloves	Kimberly-Clark	50707
Yamazen Alcohol for Disinfection	Yamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan.	A7L07