制备活化的富血小板血浆，用于培养人脂肪来源的干细胞

摘要

在本报告中，我们描述了一种制备活化的富血小板血浆 （PRP） 的双离心方法。使用自体凝血酶，培养人脂肪来源的干细胞 （hASCs）。活化的 PRP 被证明可促进 hASCs 的增殖。

摘要

通过离心从全血制备的活化富血小板血浆 （PRP） 在几种培养细胞中显示出增殖刺激作用，这意味着可能用于再生医学。在这里，使用双自旋方法从全血制备 PRP。PRP 被自体凝血酶进一步激活。测量活化的 PRP 中的血小板计数，并检查人脂肪来源干细胞 （hASCs） 中的增殖刺激作用。PRP 中的血小板计数是全血血浆的 11.5 倍。与 1% PRP 孵育后，hASCs 的增殖显著增强。所描述的方法可用于可重复地制备具有高浓度血小板的 PRP。通过该方法制备的 PRP 显着促进 hASCs 的增殖。

引言

活化的富血小板血浆 （PRP） 是通过离心全血制备的，显示血小板含量远高于基线水平¹。自体 RPP 已广泛用于手术治疗，包括伤口愈合²、骨损伤³ 和美容手术 ^4,5。在 PRP 中激活血小板后，血小板中存在的α颗粒会释放几种生长因子，例如血小板衍生生长因子 （PDGF）、表皮生长因子 （EGF）、胰岛素样生长因子 （IGF）、转化生长因子 β （TGF-β）、血管内皮生长因子 （VEGF） 等 ^1,6,7。这些生长因子在细胞增殖⁸ 、迁移⁹ 和分化⁹ 中起重要作用。

迄今为止，多项研究报道了 PRP 在不同种类细胞中的增殖刺激作用^{10、11、12、13、14、15、16}。其中一种细胞类型是人脂肪来源的干细胞 （hASCs）;hASC 存在于人体脂肪组织中，很容易大量收集。hASCs 的再生作用进一步表明了在临床应用中的潜在用途⁸。我们之前的研究报告称，与未激活的 PRP 相比，激活的 PRP 对 hASCs 和人真皮成纤维细胞 （hDFs） 具有显著的增殖作用⁸。此外，我们报道了 PRP 通过 ERK1/2 信号通路促进 hDFs 的增殖¹⁷。最近，我们还报道了 PRP 通过 ERK1/2、JNK 和 Akt 信号通路促进 hASCs 的增殖¹⁸。在 hASC 中，PRP 作为促进增殖的补充剂起着重要作用。了解 PRP 对 hASCs 的影响将有助于大规模培养方法的开发，并有助于进一步研究 hASCs 的增殖机制。

在本报告中，我们介绍并描述了一种使用离心法从全血制备 PRP 的方法。该方法使用双自旋方法轻松制备稳定的 PRP 样品。为了评估 PRP 的生物学功能，我们测量了浓缩血小板计数和几种增殖因子的浓度。我们还通过使用制备的 PRP 培养 hASCs 证实了生长刺激作用。

研究方案

该研究由关西医科大学伦理审查委员会根据 1975 年赫尔辛基宣言的伦理准则批准。所有标本均在捐献者的知情同意下收集和使用。

1. 准备工作

1. 获得知情同意后，从健康的成年献血者那里采集血液。在这里，从四名年龄在 28-38 岁之间的男性献血者那里采集血液。
   1. 建议捐献者在采血前 500 小时喝 6 mL 水。
      注：瓦杰帕伊¹⁹ 描述了健康成人血红蛋白 （Hb）、红细胞 （RBC） 计数和血小板 （PL） 浓度的参考范围。为了适合献血，献血者的血液分析必须在这些范围内。

2. 采血

1. 让献血者在手术过程中坐着。
2. 戴手套。在捐献者的拳头时，将止血带系在捐献者的上臂上。
3. 找到合适的静脉后，用 70% 酒精对皮肤消毒两次，然后插入针头。
4. 使用 21 G 注射器采集血液。抽血时不要松开止血带。
   1. 使用 8.5 mL 采血管采集血液。观察管中血液的状态，一旦血流减慢，就立即更换新管。
   2. 采集足够量的血液来制备 PRP。收集四管总体积为 34 mL 的抗凝血。将试管倒置 10 次，使血液与抗凝剂混合。
   3. 使用不含抗凝剂的 10 mL 血清采血管（参见 材料表）采集血液以制造激活剂（参见第 4 步）。收集 10 mL 非抗凝血。

3. 双旋法制备 PRP

1. 取 40 μL 抗凝全血进行血小板计数。使用带滤芯的移液器吸头保护移液器免受血液污染。
2. 将抗凝全血在 450 x g 和室温下离心 7 分钟。这是获得分层血液样本的第一次旋转。上层是血浆成分，中间层是薄的血沉棕黄船，最底层由红细胞组成。
3. 使用记号笔在血沉棕黄层下方 2 毫米处画一条线。
4. 使用带有长套管的 20 mL 注射器将血浆收集至血沉棕黄层下方 2 mm 标记处。带有血沉棕黄层的黄色血浆包含血小板、白细胞和一些红细胞。将来自两个试管的血浆收集到血清采血管中。将 4 个试管的内容物合并为 2 个试管，收集的血浆总体积为 16 mL。
5. 将带有血沉棕黄层的血浆在 1,600 x g 和室温下离心 5 分钟。这是第二次旋转。分层血样的上清液是贫血小板血浆 （PPP）。
6. 作为测量，使用带有长套管的 20 mL 注射器将 PPP 转移到含有 1 mL 液体的 50 mL 血清采血管中。在剩余 1 mL 血浆中血小板沉淀中积累的血小板用作 PRP。收集的 PRP 总体积为 2 mL。
7. 涡旋每管中的 PRP，然后汇集到一个管中（总共 2 mL）。
8. 取 400 μL PRP 进行血小板计数。
9. 将 PRP 分装到几个 1.5 mL 试管中，每个试管中含有约 400 μL。总共有四根管子。建议每管约 500 μL PRP。

4. 准备活化剂

1. 让血清采血管中不含抗凝剂的 10 mL 血液（步骤 2.3.3）在室温下静置 30 分钟。
2. 在实验室离心机中以 2,015 x g 和室温将不含抗凝剂的血液样品离心 8 分钟。
3. 收集上清液作为自体凝血酶。
4. 将 0.5 M CaCl₂ 和自体凝血酶以 1：1 （v/v） 的比例混合作为激活剂。例如，将 500 μL CaCl₂ 与 500 μL 自体凝血酶混合。使活化剂的总体积为 1 mL。

5. PRP 激活

1. 以 10：1 （v/v） 的比例混合 PRP 和活化剂。在每个 1.5 mL 试管中混合 400 μL PRP 和 40 μL 活化剂，然后在室温下孵育 10 分钟。这是以凝固形式激活的 PRP。

6. PRP 的储存

1. 在 4 °C 实验室离心机中以 9,000 x g 离心活化的 PRP 10 分钟。
2. 通过移液管将上清液收集到适当体积的注射器中。
3. 通过 0.22 μm 膜过滤上清液。
4. 将最终的 PRP 储存在 -80 °C 直至使用。

7. 血小板浓度和生长因子水平的测量

1. 使用自动血液学系统计算全血浆和 PRP 中的血小板数量（参见 材料表）。
2. 使用市售的 ELISA 试剂盒分析全血浆和活化 PRP 中 PDGF-BB、IGF 和 EGF 水平的浓度（参见 材料表）。

8. 细胞增殖检测

1. 使用先前描述的方法分离 hASC¹⁸。
   1. 在 24 孔培养板中以 1.0 x 10⁴ 个细胞/孔的密度接种 hASC，并在含有 10% FBS 和抗生素的 DMEM 中于 37 °C 孵育过夜。 在实验中使用来自第 7-9 代的 hASCs。
2. 用无血清 DMEM 替换细胞培养基。6 小时后，加入指定浓度的 PRP，并在 37 °C 下进一步孵育 48 小时。
3. 与 WST-8 溶液（参见 材料表）在 37 °C 下孵育 1 小时。 使用多孔板读数仪读取 450 nm 处的吸光度。
4. 构建标准曲线：在含有 10% FBS 的 DMEM 中以 0、6,250、12,500、25,000、50,000 和 100,000 个细胞/孔的密度在 24 孔板中接种 hASC 3 小时。在 37 °C 下与 WST-8 溶液孵育 1 小时后，读取 450 nm 处的吸光度
   1. 通过绘制细胞数量与 A_{450 nm} 的关系来绘制标准曲线。
5. 根据标准曲线从吸光度估计 hASC 的数量。

结果

PRP 中血小板和 PDGF-BB 的富集浓度
PRP 中血小板和 PDGF-BB 的浓度分别增加了 11.5 倍和 25.9 倍，与全血浆中的浓度一样高。然而，PRP 中 EGF 的浓度没有改变，IGF 仅为全血浆浓度的 70%（表 1）。通过双自旋方法重复实验四次。

PRP 刺激增强 hASCs 的增殖
用 0.2% PRP 处理后细胞增殖增加 （P < 0.05 vs 对照），1% PRP 处理在...

讨论

PRP 激活后，PDGF、EGF、IGF、TGF-β 和 VEGF 等几种生长因子 ^1,6,7 会“激活”伤口的细胞和组织，促进伤口愈合^20,21。在美容重建手术的情况下，活化的细胞已被证明可以诱导愈合并改善美观^22,23。或者，人类脂肪来源?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 mL Syringe, Terumo syringe lock type	Terumo, Tokyo, Japan.	SS-20LZP
50 mL Tube, Polypropylene Conical Tube	Corning, NY, USA.	352070
Automated Hematology System	Sysmex Corp., Tokyo, Japan	XE-2100
Blood Collection Needle, SafeTouch PSV set with luer adapter, 21 G x 3/4”	Nipro, Osaka, Japan.	32-384
Blood Collection Tube, ACD Solution A Blood Collection Tube, 8.5 mL	BD Vacutainer, NJ, USA.	364606
Blood Collection Tube, Serum Blood Collection Tube/monovette, 10 mL	BD Vacutainer, NJ, USA.	366430
Calcium Chloride, 1 mEq/ mL,	Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan.	3215400A1061
Cannula, BS non-bevel needle, 18 G (1.2 mm) x 75 mm	BS Medical, Tokyo, Japan.	BS-81007	Not for sale
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan	CK04
Centrifuge	Kokusan, Tokyo, Japan.	H-19F
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany.	5415R
EnSpire 2300 Multilabel Reader	PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
Filter Unit	Merck Millipore, Co. Cork, Ireland.	SLGP033RS
Human EGF Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DEG00
Human IGF-I Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DG100
Human PDGF-BB Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DBB00
Pipette Tip, ART 1000 Reach Barrier Tip	Thermo Scientific, MA, USA.	2079-05-HR
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μL	Nichiryo, Saitama, Japan.	00-NPX2-1000
Sterling Nitrile Power-Free Exam Gloves	Kimberly-Clark	50707
Yamazen Alcohol for Disinfection	Yamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan.	A7L07