Preparazione di plasma ricco di piastrine attivato per la coltura di cellule staminali umane di derivazione adiposa

Riepilogo

In questo rapporto, descriviamo un metodo a doppia rotazione per la preparazione del plasma ricco di piastrine attivato (PRP). Utilizzando trombina autologa, sono state coltivate cellule staminali umane di derivazione adiposa (hASC). È stato dimostrato che il PRP attivato promuove la proliferazione delle hASC.

Abstract

Il plasma ricco di piastrine attivato (PRP) preparato da sangue intero tramite centrifugazione ha dimostrato un effetto stimolante della proliferazione in diversi tipi di cellule in coltura, implicando un possibile utilizzo nella medicina rigenerativa. Qui, è stato utilizzato un metodo a doppia rotazione per preparare il PRP da sangue intero. Il PRP è stato ulteriormente attivato dalla trombina autologa. La conta piastrinica è stata misurata nel PRP attivato ed è stato esaminato l'effetto stimolante della proliferazione nelle cellule staminali umane di derivazione adiposa (hASC). La conta piastrinica risultante era 11,5 volte superiore nel PRP rispetto al plasma sanguigno intero. La proliferazione di hASC è stata notevolmente aumentata dall'incubazione con PRP all'1%. Il metodo descritto può essere utilizzato per preparare in modo riproducibile il PRP con un'alta concentrazione di piastrine. Il PRP preparato con questo metodo promuove notevolmente la proliferazione di hASC.

Introduzione

Il plasma ricco di piastrine attivato (PRP) viene preparato mediante centrifugazione di sangue intero e ha dimostrato di contenere piastrine ben al di sopra dei livelli basali¹. L'RPP autologa è stata ampiamente utilizzata nel trattamento chirurgico, tra cui la guarigione delle ferite², le lesioni ossee³ e gli interventi di chirurgia estetica ^4,5. Dopo l'attivazione delle piastrine nel PRP, i granuli α presenti nelle piastrine rilasciano diversi fattori di crescita, come il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), il fattore di crescita epidermico (EGF), i fattori di crescita insulino-simili (IGF), il fattore di crescita trasformante beta (TGF-β), il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e altri ^1,6,7. Questi fattori di crescita svolgono un ruolo importante nella proliferazione cellulare⁸, nella migrazione⁹ e nella differenziazione⁹.

Ad oggi, diversi studi hanno riportato l'effetto stimolante della proliferazione del PRP in diversi tipi di cellule 10,11,12,13,14,15,16. Uno di questi tipi di cellule sono le cellule staminali umane di derivazione adiposa (hASC); Le hASC esistono nel tessuto adiposo umano e possono essere facilmente raccolte in gran numero. L'effetto rigenerativo delle hASC suggerisce inoltre un potenziale utilizzo in applicazioni cliniche⁸. I nostri studi precedenti hanno riportato che, rispetto al PRP non attivato, il PRP attivato ha avuto un marcato effetto proliferativo sulle hASC e sui fibroblasti dermici umani (hDF)⁸. Inoltre, abbiamo riportato che il PRP promuove la proliferazione di hDF attraverso una via di segnalazione ERK1/2¹⁷. Recentemente, abbiamo anche riportato che il PRP promuove la proliferazione di hASC attraverso le vie di segnalazione ERK1/2, JNK e Akt¹⁸. Nelle hASC, il PRP svolge un ruolo importante come integratore che promuove la proliferazione. La conoscenza dell'effetto del PRP sulle hASC aiuterà lo sviluppo di metodi di coltura su larga scala e consentirà ulteriori studi sul meccanismo di proliferazione nelle hASC.

In questo rapporto, introduciamo e descriviamo un metodo per preparare il PRP da sangue intero utilizzando la centrifugazione. Questo metodo utilizza il metodo a doppia rotazione per preparare facilmente un campione stabile di PRP. Per valutare la funzione biologica del PRP, abbiamo misurato la conta piastrinica concentrata e la concentrazione di diversi fattori di proliferazione. Abbiamo anche confermato l'effetto stimolante della crescita utilizzando il PRP preparato per la coltura di hASC.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dall'Ethics Review Board della Kansai Medical University in conformità con le linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki del 1975. Tutti i campioni sono stati raccolti e utilizzati con il consenso informato dei donatori.

1. Preparazione

1. Dopo aver ottenuto il consenso informato, prelevare il sangue da donatori adulti sani. Qui è stato raccolto il sangue da quattro donatori di sangue maschi di età compresa tra i 28 e i 38 anni.
   1. Raccomandare ai donatori di bere 500 ml di acqua 6 ore prima del prelievo del sangue.
      NOTA: Gli intervalli di riferimento per l'emoglobina (Hb), la conta dei globuli rossi (RBC) e la concentrazione di piastrine (PL) negli adulti sani sono descritti da Vajpayee¹⁹. Per essere idoneo alla donazione di sangue, l'analisi del sangue del donatore deve rientrare in questi intervalli.

2. Prelievo di sangue

1. Fai sedere i donatori di sangue durante la procedura.
2. Indossare i guanti. Fissare un laccio emostatico sulla parte superiore del braccio del donatore mentre il donatore stringe un pugno.
3. Una volta trovata una vena adatta, sterilizzare la pelle due volte con alcol al 70% e inserire l'ago.
4. Utilizzare una siringa da 21 G per raccogliere il sangue. Non allentare il laccio emostatico durante il prelievo di sangue.
   1. Utilizzare una provetta per la raccolta del sangue da 8,5 ml per raccogliere il sangue. Osservare lo stato del sangue nella provetta e passare a una nuova provetta non appena il flusso sanguigno rallenta.
   2. Raccogli una quantità sufficiente di sangue per fare il PRP. Raccogliere quattro provette di sangue anticoagulato con un volume totale di 34 ml. Capovolgere le provette 10 volte per mescolare il sangue con l'anticoagulante.
   3. Utilizzare una provetta per la raccolta del sangue del siero da 10 ml (vedere la Tabella dei materiali) senza anticoagulante per raccogliere il sangue per la produzione dell'attivatore (vedere la fase 4). Raccogliere 10 ml di sangue non anticoagulante.

3. Metodo a doppia rotazione per fare il PRP

1. Prelevare 40 μL di sangue intero anticoagulato per la conta piastrinica. Utilizzare puntali per pipette filtrati per proteggere la pipetta dalla contaminazione del sangue.
2. Centrifugare il sangue intero anticoagulato per 7 minuti a 450 x g e temperatura ambiente. Questa è la prima centrifuga per ottenere campioni di sangue stratificati. Lo strato superiore è la frazione plasmatica, lo strato intermedio è la sottile buffy boat e lo strato più basso è costituito da globuli rossi.
3. Usa un pennarello per tracciare una linea a 2 mm sotto il buffy coat.
4. Utilizzare una siringa da 20 ml con una lunga cannula per raccogliere il plasma fino al segno di 2 mm sotto il buffy coat. Il plasma giallo con buffy coat contiene piastrine, leucociti e alcuni eritrociti. Raccogliere il plasma da due provette in una provetta per la raccolta del sangue del siero. Combinare il contenuto di 4 provette in 2 provette per un volume totale di 16 mL di plasma raccolto.
5. Centrifugare il plasma con il buffy coat per 5 minuti a 1.600 x g e temperatura ambiente. Questo è il secondo giro. Il surnatante dei campioni di sangue stratificati è il plasma povero di piastrine (PPP).
6. Utilizzare una siringa da 20 ml con una cannula lunga per trasferire il PPP in una provetta per la raccolta del sangue del siero da 50 ml contenente 1 ml di liquido come dosaggio. Le piastrine che si accumulavano nel pellet di trombociti nel restante 1 mL di plasma sono state utilizzate come PRP. Il volume totale di PRP raccolto è stato di 2 mL.
7. Agitare il PRP in ciascuna provetta e poi raggrupparlo in una provetta (totale 2 ml).
8. Prelevare 400 μL di PRP per una conta piastrinica.
9. Aliquotare il PRP in diverse provette da 1,5 mL, contenenti circa 400 μl in ciascuna provetta. C'è un totale di quattro tubi. Si consigliano circa 500 μl di PRP per provetta.

4. Preparare l'attivatore

1. Lasciare riposare i 10 ml di sangue senza anticoagulante in una provetta per la raccolta del siero (passaggio 2.3.3) per 30 minuti a temperatura ambiente.
2. Centrifugare il campione di sangue senza anticoagulante per 8 minuti a 2.015 x g e temperatura ambiente in una centrifuga da laboratorio.
3. Raccogliere il surnatante come trombina autologa.
4. Miscelare 0,5 M di CaCl₂ e trombina autologa in un rapporto 1:1 (v/v) come attivatore. Ad esempio, 500 μL di CaCl₂ sono stati miscelati con 500 μL di trombina autologa. Produrre un volume totale di 1 ml dell'attivatore.

5. Attivazione del PRP

1. Miscelare il PRP e l'attivatore in un rapporto 10:1 (v/v). Miscelare 400 μl di PRP con 40 μl di attivatore in ciascuna provetta da 1,5 mL, quindi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Questo è PRP attivato in forma coagulata.

6. Conservazione del PRP

1. Centrifuga attiva PRP a 9.000 x g per 10 minuti in una centrifuga da laboratorio a 4 °C.
2. Raccogliere il surnatante tramite pipetta in una siringa di volume adeguato.
3. Filtrare il surnatante attraverso una membrana da 0,22 μm.
4. Conservare il PRP finale a -80 °C fino al momento dell'uso.

7. Misurazione delle concentrazioni piastriniche e dei livelli dei fattori di crescita

1. Contare il numero di piastrine nel plasma intero e nel PRP utilizzando un sistema ematologico automatizzato ( Tabella dei materiali).
2. Analizzare le concentrazioni dei livelli di PDGF-BB, IGF ed EGF nel plasma intero e nel PRP attivato utilizzando i kit ELISA disponibili in commercio (vedere la Tabella dei materiali).

8. Saggio di proliferazione cellulare

1. Isolare gli hASC utilizzando un metodo precedentemente descritto¹⁸.
   1. Seminare hASC a una densità di 1,0 x 10⁴ cellule/pozzetto in piastre di coltura a 24 pozzetti e incubare in DMEM contenente il 10% di FBS e antibiotici per una notte a 37 °C. Usa gli hASC dai passaggi 7-9 negli esperimenti.
2. Sostituire i terreni cellulari con DMEM privo di siero. Dopo 6 ore, aggiungere PRP alle concentrazioni designate e incubare ulteriormente per 48 ore a 37 °C.
3. Incubare con la soluzione WST-8 (vedi Tabella dei materiali) per 1 ora a 37 °C. Lettura dell'assorbanza a 450 nm con un lettore di piastre multipozzetto.
4. Costruire una curva standard: seminare hASC a densità di 0, 6.250, 12.500, 25.000, 50.000 e 100.000 cellule/pozzetto in piastre a 24 pozzetti in DMEM con il 10% di FBS per 3 ore. Leggere l'assorbanza a 450 nm dopo l'incubazione con la soluzione WST-8 per 1 ora a 37 °C
   1. Disegna la curva standard tracciando il numero di celle rispetto alla A_{450 nm}.
5. Stimare il numero di hASC dall'assorbanza in base alla curva standard.

Risultati

Concentrazioni arricchite di piastrine e PDGF-BB nel PRP
Le concentrazioni di piastrine e PDGF-BB nel PRP sono aumentate rispettivamente di 11,5 e 25,9 volte, rispetto a quelle nel plasma intero. Tuttavia, le concentrazioni di EGF nel PRP non sono state modificate e l'IGF era solo il 70% di quello del plasma intero (Tabella 1). Gli esperimenti sono stati replicati quattro volte con il metodo del doppio spin.

Aumento...

Discussione

Dopo l'attivazione del PRP, diversi fattori di crescita, come PDGF, EGF, IGF, TGF-β e VEGF ^1,6,7 "attivano" le cellule e i tessuti delle ferite promuovendo la guarigione delle ferite^20,21. Nel caso della chirurgia ricostruttiva estetica, è stato dimostrato che le cellule attivate inducono la guarigione e migliorano l'estetica

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 mL Syringe, Terumo syringe lock type	Terumo, Tokyo, Japan.	SS-20LZP
50 mL Tube, Polypropylene Conical Tube	Corning, NY, USA.	352070
Automated Hematology System	Sysmex Corp., Tokyo, Japan	XE-2100
Blood Collection Needle, SafeTouch PSV set with luer adapter, 21 G x 3/4”	Nipro, Osaka, Japan.	32-384
Blood Collection Tube, ACD Solution A Blood Collection Tube, 8.5 mL	BD Vacutainer, NJ, USA.	364606
Blood Collection Tube, Serum Blood Collection Tube/monovette, 10 mL	BD Vacutainer, NJ, USA.	366430
Calcium Chloride, 1 mEq/ mL,	Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan.	3215400A1061
Cannula, BS non-bevel needle, 18 G (1.2 mm) x 75 mm	BS Medical, Tokyo, Japan.	BS-81007	Not for sale
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan	CK04
Centrifuge	Kokusan, Tokyo, Japan.	H-19F
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany.	5415R
EnSpire 2300 Multilabel Reader	PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
Filter Unit	Merck Millipore, Co. Cork, Ireland.	SLGP033RS
Human EGF Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DEG00
Human IGF-I Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DG100
Human PDGF-BB Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DBB00
Pipette Tip, ART 1000 Reach Barrier Tip	Thermo Scientific, MA, USA.	2079-05-HR
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μL	Nichiryo, Saitama, Japan.	00-NPX2-1000
Sterling Nitrile Power-Free Exam Gloves	Kimberly-Clark	50707
Yamazen Alcohol for Disinfection	Yamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan.	A7L07