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요약

이 보고서에서는 활성화된 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 준비하기 위한 이중 스핀 방법에 대해 설명합니다. 자가 트롬빈을 사용하여 인간 지방 유래 줄기세포(hASC)를 배양했습니다. 활성화된 PRP는 hASC의 증식을 촉진하는 것으로 나타났습니다.

초록

원심분리를 통해 전혈에서 제조한 활성 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 여러 종류의 배양 세포에서 증식 자극 효과를 입증하여 재생 의학에 사용할 수 있음을 시사했습니다. 여기에서는 전혈에서 PRP를 준비하기 위해 이중 스핀 방법을 사용했습니다. PRP는 자가 트롬빈에 의해 추가로 활성화되었습니다. 활성화된 PRP에서 혈소판 수를 측정하고 인간 지방 유래 줄기세포(hASC)의 증식 자극 효과를 조사했습니다. 그 결과 PRP에서 혈소판 수치가 전혈장보다 11.5배 더 높았습니다. hASC의 증식은 1% PRP를 사용한 배양에 의해 현저하게 향상되었습니다. 설명된 방법을 사용하여 고농도의 혈소판으로 PRP를 재현성 있게 준비할 수 있습니다. 이 방법으로 제조된 PRP는 hASC의 증식을 현저하게 촉진합니다.

서문

활성 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 전혈의 원심분리에 의해 준비되며 기준선 수준1보다 훨씬 높은 혈소판을 포함하는 것으로 나타났습니다. 자가 RPP는 상처 치유2, 뼈 손상3, 미용 수술 4,5 등 외과적 치료에 널리 사용되어 왔습니다. PRP에서 혈소판이 활성화된 후 혈소판에 존재하는 α-과립은 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 형질 성장 인자 베타(TGF-β), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 등과 같은 여러 성장 인자를 방출합니다 1,6,7. 이러한 성장 인자는 세포 증식(cell proliferation)8, 이동(migration)9, 분화(differentiation)9에 중요한 역할을 합니다.

현재까지 여러 연구에서 다양한 종류의 세포에서 PRP의 증식 자극 효과를보고했습니다 10,11,12,13,14,15,16. 이러한 세포 유형 중 하나는 인간 지방 유래 줄기 세포(hASC)입니다. hASC는 인간 지방 조직에 존재하며 많은 수로 쉽게 수집될 수 있습니다. hASC의 재생 효과는 임상 응용 분야에서의 잠재적 사용을 시사합니다8. 이전 연구에서는 비활성 PRP와 비교하여 활성 PRP가 hASC 및 인간 진피 섬유아세포(hDF)에 현저한 증식 효과를 나타낸다고 보고했습니다8. 또한, PRP가 ERK1/2 신호전달 경로를 통해 hDF의 증식을 촉진한다고 보고했다17. 최근에는 PRP가 ERK1/2, JNK 및 Akt 신호전달 경로를 통해 hASC의 증식을 촉진한다고 보고했습니다18. hASC에서 PRP는 증식을 촉진하는 보충제로서 중요한 역할을 합니다. PRP가 hASC에 미치는 영향에 대한 지식은 대규모 배양 방법의 개발에 도움이 될 것이며 hASC의 증식 메커니즘에 대한 추가 연구를 가능하게 할 것입니다.

이 보고서에서는 원심분리를 사용하여 전혈에서 PRP를 준비하는 방법을 소개하고 설명합니다. 이 방법은 이중 스핀 방법을 사용하여 안정적인 PRP 샘플을 쉽게 준비할 수 있습니다. PRP의 생물학적 기능을 평가하기 위해 농축된 혈소판 수와 여러 증식 인자의 농도를 측정했습니다. 또한 hASCs 배양을 위해 제조된 PRP를 사용하여 성장 촉진 효과를 확인하였습니다.

프로토콜

이 연구는 1975년 헬싱키 선언의 윤리 지침에 따라 간사이 의과대학의 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 표본은 기증자의 사전 동의하에 수집되어 사용되었습니다.

1. 준비

  1. 충분한 설명을 듣고자 한 후, 건강한 성인 헌혈자로부터 혈액을 채취한다. 여기에서 28-38세 사이의 남성 헌혈자 4명으로부터 혈액을 채취했습니다.
    1. 헌혈자는 채혈 6시간 전에 500mL의 물을 마실 것을 권장합니다.
      참고: 건강한 성인의 헤모글로빈(Hb), 적혈구(RBC) 수 및 혈소판(PL) 농도에 대한 참조 범위는 Vajpayee19에 설명되어 있습니다. 헌혈에 적합하기 위해서는 헌혈자의 혈액 분석이 이 범위 내에 있어야 합니다.

2. 채혈

  1. 시술 중에 헌혈자를 앉히십시오.
  2. 장갑을 착용하십시오. 기증자가 주먹을 쥐는 동안 기증자의 팔뚝 위쪽에 지혈대를 고정합니다.
  3. 적당한 정맥이 발견되면 70% 알코올로 피부를 2회 살균하고 바늘을 삽입합니다.
  4. 21g 주사기를 사용하여 혈액을 채취합니다. 채혈 중에 지혈대를 풀지 마십시오.
    1. 8.5mL 채혈 튜브를 사용하여 혈액을 채취합니다. 튜브 내의 혈액 상태를 관찰하고 혈류가 느려지는 즉시 새 튜브로 교체하십시오.
    2. PRP를 만들기에 충분한 양의 혈액을 모으십시오. 총 부피가 34mL인 항응고 혈액 튜브 4개를 수집합니다. 튜브를 10회 뒤집어 혈액과 항응고제를 섞습니다.
    3. 항응고제가 없는 10mL 혈청 채혈 튜브( 재료 표 참조)를 사용하여 활성제를 만들기 위한 혈액을 수집합니다(4단계 참조). 비항응고제 혈액 10mL를 수집합니다.

3. PRP를 만드는 더블 스핀 방식

  1. 혈소판 수를 위해 40μL의 항응고 전혈을 복용합니다. 여과된 피펫 팁을 사용하여 피펫을 혈액 오염으로부터 보호하십시오.
  2. 항응고된 전혈을 450 x g 과 실온에서 7분간 원심분리합니다. 이것은 층상 혈액 샘플을 얻기 위한 첫 번째 스핀입니다. 상층은 혈장 분획, 중간층은 얇은 담황색 보트, 최하층은 적혈구로 구성됩니다.
  3. 마커를 사용하여 버피 코트 아래 2mm에 선을 만듭니다.
  4. 긴 캐뉼라가 있는 20mL 주사기를 사용하여 버피 코트 아래 2mm 표시까지 혈장을 수집합니다. 담황색 털이 있는 노란색 혈장에는 혈소판, 백혈구 및 일부 적혈구가 포함되어 있습니다. 두 개의 튜브에서 혈장을 혈청 채혈 튜브로 수집합니다. 4개의 튜브의 내용물을 2개의 튜브로 결합하여 총 16mL의 혈장을 수집합니다.
  5. 버피 코트를 덮은 플라즈마를 1,600 x g 과 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 이것이 두 번째 스핀입니다. 층상 혈액 샘플의 상층액은 혈소판 부족 혈장(PPP)입니다.
  6. 긴 캐뉼라가 있는 20mL 주사기를 사용하여 PPP를 1mL의 액체가 들어 있는 50mL 혈청 채혈 튜브로 옮깁니다. 나머지 1mL 혈장에서 혈소판 펠릿에 축적된 혈소판을 PRP로 사용하였다. 수집된 PRP의 총 부피는 2mL였습니다.
  7. 각 튜브의 PRP를 소용돌이친 다음 하나의 튜브(총 2mL)로 모입니다.
  8. 혈소판 수를 위해 PRP 400μL를 복용합니다.
  9. PRP를 각 튜브에 약 400μL를 포함하는 여러 개의 1.5mL 튜브로 분취합니다. 총 4 개의 튜브가 있습니다. 튜브당 약 500μL PRP가 권장됩니다.

4. 액티베이터 준비

  1. 혈청 채혈 튜브에 항응고제가 없는 혈액 10mL를 넣고(2.3.3단계) 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다.
  2. 실험실 원심분리기에서 항응고제 없이 혈액 샘플을 2,015 x g 과 실온에서 8분 동안 원심분리합니다.
  3. 상등액을 자가 트롬빈으로 수집합니다.
  4. 0.5 M CaCl2 와 자가 트롬빈을 1:1 (v/v) 비율로 활성제로 혼합합니다. 예를 들어, 500 μL의 CaCl2 를 500 μL의 자가 트롬빈과 혼합하였다. 활성제의 총 부피를 1mL로 만듭니다.

5. PRP 활성화

  1. PRP와 활성제를 10:1(v/v) 비율로 혼합합니다. 각 1.5mL 튜브에 400μL의 PRP와 40μL의 활성제를 혼합한 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이것은 응고된 형태로 활성화된 PRP입니다.

6. PRP의 보관

  1. 원심분리기는 4°C 실험실용 원심분리기에서 9,000 x g 에서 10분 동안 PRP를 활성화했습니다.
  2. 피펫을 통해 상층액을 적절한 부피의 주사기에 모읍니다.
  3. 0.22μm 멤브레인을 통해 상층액을 여과합니다.
  4. 최종 PRP를 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.

7. 혈소판 농도 및 성장 인자 수치 측정

  1. 자동 혈액학 시스템을 사용하여 전체 혈장 및 PRP의 혈소판 수를 계산합니다( 재료 표 참조).
  2. 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 전체 혈장 및 활성 PRP의 PDGF-BB, IGF 및 EGF 농도를 분석합니다( 재료 표 참조).

8. 세포 증식 분석

  1. 앞서 설명한 방법18을 사용하여 hASC를 분리합니다.
    1. 24-well 배양 플레이트에 1.0 x 104 cells/well의 밀도로 hASC를 파종하고 37°C에서 하룻밤 동안 10% FBS와 항생제를 함유한 DMEM에서 배양합니다. 실험에서 7-9절의 hASC를 사용합니다.
  2. 세포 배지를 무혈청 DMEM으로 교체합니다. 6 시간 후 지정된 농도에서 PRP를 첨가하고 37 ° C에서 48 시간 동안 더 배양합니다.
  3. WST-8 용액 ( 재료 표 참조)으로 37 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다. 450 nm에서 multi-well plate reader로 흡광도를 판독합니다.
  4. 표준 곡선 구성: 3시간 동안 10% FBS를 사용하여 DMEM의 24웰 플레이트에서 0, 6,250, 12,500, 25,000, 50,000 및 100,000 cells/well의 밀도로 hASC를 시드합니다. 37°C에서 1시간 동안 WST-8 용액으로 배양한 후 450nm에서 흡광도를 판독합니다.
    1. A450nm에 대한 셀 수를 플로팅하여 표준 곡선을 그립니다.
  5. 표준 곡선을 기반으로 흡광도에서 hASC의 수를 추정합니다.

결과

PRP에서 혈소판 및 PDGF-BB의 농축 농도
PRP에서 혈소판과 PDGF-BB의 농도는 각각 11.5배 및 25.9배 증가했으며, 이는 전체 혈장에서와 같았습니다. 그러나 PRP 내 EGF 농도는 변하지 않았고 IGF는 전체 혈장의 70%에 불과했습니다(표 1). 실험은 이중 스핀 방법으로 4번 반복되었습니다.

PRP 자극에 의한 hASC의 증식 강화
세?...

토론

PRP 활성화 후, PDGF, EGF, IGF, TGF-β 및 VEGF 1,6,7과 같은 여러 성장 인자는 상처 치유를 촉진하는 상처의 세포와 조직을 "활성화"합니다20,21. 미용 재건 수술의 경우, 활성화된 세포가 치유를 유도하고 미관을 개선하는 것으로 나타났다22,23

공개

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 말

해당 사항 없음

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
20 mL Syringe, Terumo syringe lock typeTerumo, Tokyo, Japan.SS-20LZP
50 mL Tube, Polypropylene Conical TubeCorning, NY, USA.352070
Automated Hematology SystemSysmex Corp., Tokyo, JapanXE-2100
Blood Collection Needle, SafeTouch PSV set with luer adapter, 21 G x 3/4”Nipro, Osaka, Japan.32-384
Blood Collection Tube, ACD Solution A Blood Collection Tube, 8.5 mLBD Vacutainer, NJ, USA.364606
Blood Collection Tube, Serum Blood Collection Tube/monovette, 10 mLBD Vacutainer, NJ, USA.366430
Calcium Chloride, 1 mEq/ mL,Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan.3215400A1061
Cannula, BS non-bevel needle, 18 G (1.2 mm) x 75 mmBS Medical, Tokyo, Japan.BS-81007Not for sale
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, JapanCK04
CentrifugeKokusan, Tokyo, Japan.H-19F
CentrifugeEppendorf, Hamburg, Germany.5415R
EnSpire 2300 Multilabel ReaderPerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
Filter UnitMerck Millipore, Co. Cork, Ireland.SLGP033RS
Human EGF Quantikine ELISA KitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADEG00
Human IGF-I Quantikine ELISA KitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADG100
Human PDGF-BB Quantikine ELISA KitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADBB00
Pipette Tip, ART 1000 Reach Barrier TipThermo Scientific, MA, USA.2079-05-HR
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μLNichiryo, Saitama, Japan.00-NPX2-1000
Sterling Nitrile Power-Free Exam GlovesKimberly-Clark50707
Yamazen Alcohol for DisinfectionYamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan.A7L07

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