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Method Article
이 보고서에서는 활성화된 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 준비하기 위한 이중 스핀 방법에 대해 설명합니다. 자가 트롬빈을 사용하여 인간 지방 유래 줄기세포(hASC)를 배양했습니다. 활성화된 PRP는 hASC의 증식을 촉진하는 것으로 나타났습니다.
원심분리를 통해 전혈에서 제조한 활성 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 여러 종류의 배양 세포에서 증식 자극 효과를 입증하여 재생 의학에 사용할 수 있음을 시사했습니다. 여기에서는 전혈에서 PRP를 준비하기 위해 이중 스핀 방법을 사용했습니다. PRP는 자가 트롬빈에 의해 추가로 활성화되었습니다. 활성화된 PRP에서 혈소판 수를 측정하고 인간 지방 유래 줄기세포(hASC)의 증식 자극 효과를 조사했습니다. 그 결과 PRP에서 혈소판 수치가 전혈장보다 11.5배 더 높았습니다. hASC의 증식은 1% PRP를 사용한 배양에 의해 현저하게 향상되었습니다. 설명된 방법을 사용하여 고농도의 혈소판으로 PRP를 재현성 있게 준비할 수 있습니다. 이 방법으로 제조된 PRP는 hASC의 증식을 현저하게 촉진합니다.
활성 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 전혈의 원심분리에 의해 준비되며 기준선 수준1보다 훨씬 높은 혈소판을 포함하는 것으로 나타났습니다. 자가 RPP는 상처 치유2, 뼈 손상3, 미용 수술 4,5 등 외과적 치료에 널리 사용되어 왔습니다. PRP에서 혈소판이 활성화된 후 혈소판에 존재하는 α-과립은 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 형질 성장 인자 베타(TGF-β), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 등과 같은 여러 성장 인자를 방출합니다 1,6,7. 이러한 성장 인자는 세포 증식(cell proliferation)8, 이동(migration)9, 분화(differentiation)9에 중요한 역할을 합니다.
현재까지 여러 연구에서 다양한 종류의 세포에서 PRP의 증식 자극 효과를보고했습니다 10,11,12,13,14,15,16. 이러한 세포 유형 중 하나는 인간 지방 유래 줄기 세포(hASC)입니다. hASC는 인간 지방 조직에 존재하며 많은 수로 쉽게 수집될 수 있습니다. hASC의 재생 효과는 임상 응용 분야에서의 잠재적 사용을 시사합니다8. 이전 연구에서는 비활성 PRP와 비교하여 활성 PRP가 hASC 및 인간 진피 섬유아세포(hDF)에 현저한 증식 효과를 나타낸다고 보고했습니다8. 또한, PRP가 ERK1/2 신호전달 경로를 통해 hDF의 증식을 촉진한다고 보고했다17. 최근에는 PRP가 ERK1/2, JNK 및 Akt 신호전달 경로를 통해 hASC의 증식을 촉진한다고 보고했습니다18. hASC에서 PRP는 증식을 촉진하는 보충제로서 중요한 역할을 합니다. PRP가 hASC에 미치는 영향에 대한 지식은 대규모 배양 방법의 개발에 도움이 될 것이며 hASC의 증식 메커니즘에 대한 추가 연구를 가능하게 할 것입니다.
이 보고서에서는 원심분리를 사용하여 전혈에서 PRP를 준비하는 방법을 소개하고 설명합니다. 이 방법은 이중 스핀 방법을 사용하여 안정적인 PRP 샘플을 쉽게 준비할 수 있습니다. PRP의 생물학적 기능을 평가하기 위해 농축된 혈소판 수와 여러 증식 인자의 농도를 측정했습니다. 또한 hASCs 배양을 위해 제조된 PRP를 사용하여 성장 촉진 효과를 확인하였습니다.
이 연구는 1975년 헬싱키 선언의 윤리 지침에 따라 간사이 의과대학의 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 표본은 기증자의 사전 동의하에 수집되어 사용되었습니다.
1. 준비
2. 채혈
3. PRP를 만드는 더블 스핀 방식
4. 액티베이터 준비
5. PRP 활성화
6. PRP의 보관
7. 혈소판 농도 및 성장 인자 수치 측정
8. 세포 증식 분석
PRP에서 혈소판 및 PDGF-BB의 농축 농도
PRP에서 혈소판과 PDGF-BB의 농도는 각각 11.5배 및 25.9배 증가했으며, 이는 전체 혈장에서와 같았습니다. 그러나 PRP 내 EGF 농도는 변하지 않았고 IGF는 전체 혈장의 70%에 불과했습니다(표 1). 실험은 이중 스핀 방법으로 4번 반복되었습니다.
PRP 자극에 의한 hASC의 증식 강화
세?...
PRP 활성화 후, PDGF, EGF, IGF, TGF-β 및 VEGF 1,6,7과 같은 여러 성장 인자는 상처 치유를 촉진하는 상처의 세포와 조직을 "활성화"합니다20,21. 미용 재건 수술의 경우, 활성화된 세포가 치유를 유도하고 미관을 개선하는 것으로 나타났다22,23
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.
해당 사항 없음
Name | Company | Catalog Number | Comments |
20 mL Syringe, Terumo syringe lock type | Terumo, Tokyo, Japan. | SS-20LZP | |
50 mL Tube, Polypropylene Conical Tube | Corning, NY, USA. | 352070 | |
Automated Hematology System | Sysmex Corp., Tokyo, Japan | XE-2100 | |
Blood Collection Needle, SafeTouch PSV set with luer adapter, 21 G x 3/4” | Nipro, Osaka, Japan. | 32-384 | |
Blood Collection Tube, ACD Solution A Blood Collection Tube, 8.5 mL | BD Vacutainer, NJ, USA. | 364606 | |
Blood Collection Tube, Serum Blood Collection Tube/monovette, 10 mL | BD Vacutainer, NJ, USA. | 366430 | |
Calcium Chloride, 1 mEq/ mL, | Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan. | 3215400A1061 | |
Cannula, BS non-bevel needle, 18 G (1.2 mm) x 75 mm | BS Medical, Tokyo, Japan. | BS-81007 | Not for sale |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan | CK04 | |
Centrifuge | Kokusan, Tokyo, Japan. | H-19F | |
Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany. | 5415R | |
EnSpire 2300 Multilabel Reader | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | ||
Filter Unit | Merck Millipore, Co. Cork, Ireland. | SLGP033RS | |
Human EGF Quantikine ELISA Kit | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DEG00 | |
Human IGF-I Quantikine ELISA Kit | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DG100 | |
Human PDGF-BB Quantikine ELISA Kit | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DBB00 | |
Pipette Tip, ART 1000 Reach Barrier Tip | Thermo Scientific, MA, USA. | 2079-05-HR | |
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μL | Nichiryo, Saitama, Japan. | 00-NPX2-1000 | |
Sterling Nitrile Power-Free Exam Gloves | Kimberly-Clark | 50707 | |
Yamazen Alcohol for Disinfection | Yamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan. | A7L07 |
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