JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu raporda, aktive edilmiş trombositten zengin plazma (PRP) hazırlamak için çift döndürme yöntemini açıklıyoruz. Otolog trombin kullanılarak, insan yağ kaynaklı kök hücreler (hASC'ler) kültürlendi. Aktive edilmiş PRP'nin hASC'lerin proliferasyonunu teşvik ettiği gösterilmiştir.

Özet

Tam kandan santrifüjleme yoluyla hazırlanan aktive edilmiş trombositten zengin plazma (PRP), çeşitli kültürlenmiş hücrelerde proliferasyonu uyarıcı bir etki gösterdi ve bu da rejeneratif tıpta olası bir kullanım anlamına geliyor. Burada tam kandan PRP hazırlamak için çift sıkma yöntemi kullanılmıştır. PRP, otolog trombin ile daha da aktive edildi. Aktive edilmiş PRP'de trombosit sayısı ölçüldü ve insan yağ kaynaklı kök hücrelerde (hASC'ler) proliferasyonu uyarıcı etki incelendi. Elde edilen trombosit sayısı PRP'de tam kan plazmasına göre 11,5 kat daha yüksekti. hASC'lerin proliferasyonu, %1 PRP ile inkübasyon ile belirgin şekilde artmıştır. Tarif edilen yöntem, yüksek konsantrasyonda trombosit ile PRP'yi tekrarlanabilir şekilde hazırlamak için kullanılabilir. Bu yöntemle hazırlanan PRP, hASC'lerin çoğalmasını belirgin şekilde teşvik eder.

Giriş

Aktive edilmiş trombositten zengin plazma (PRP), tam kanın santrifüjlenmesiyle hazırlanır ve başlangıç seviyeleri1'in çok üzerinde trombositler içerdiği gösterilmiştir. Otolog RPP, yara iyileşmesi2, kemik yaralanması3 ve estetik ameliyatlar 4,5 dahil olmak üzere cerrahi tedavide yaygın olarak kullanılmaktadır. PRP'de trombositlerin aktivasyonundan sonra, trombositlerde bulunan α-granüller, trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), insülin benzeri büyüme faktörleri (IGF'ler), dönüştürücü büyüme faktörü beta (TGF-β), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve diğerleri gibi çeşitli büyüme faktörlerini serbest bırakır 1,6,7. Bu büyüme faktörleri hücre proliferasyonunda8, göç9 ve farklılaşma9'da önemli bir rol oynar.

Bugüne kadar, birçok çalışmada PRP'nin farklı hücre türlerinde proliferasyon uyarıcı etkisi bildirilmiştir 10,11,12,13,14,15,16. Bu hücre tiplerinden biri insan yağ kaynaklı kök hücrelerdir (hASC'ler); hASC'ler insan yağ dokusunda bulunur ve çok sayıda kolayca toplanabilir. hASC'lerin rejeneratif etkisi ayrıca klinik uygulamalarda potansiyel bir kullanım olduğunu düşündürmektedir8. Önceki çalışmalarımız, aktive edilmemiş PRP ile karşılaştırıldığında, aktive edilmiş PRP'nin hASC'ler ve insan dermal fibroblastları (hDF'ler) üzerinde belirgin bir proliferatif etkiye sahip olduğunu bildirmiştir8. Ek olarak, PRP'nin bir ERK1/2 sinyal yolu17 aracılığıyla hDF'lerin proliferasyonunu desteklediğini bildirdik. Son zamanlarda, PRP'nin ERK1/2, JNK ve Akt sinyal yolları18 yoluyla hASC'lerin çoğalmasını teşvik ettiğini de bildirdik. hASC'lerde PRP, proliferasyonu destekleyen bir takviye olarak önemli bir rol oynar. PRP'nin hASC'ler üzerindeki etkisi hakkında bilgi sahibi olmak, büyük ölçekli kültür yöntemlerinin geliştirilmesine yardımcı olacak ve hASC'lerde proliferasyon mekanizması hakkında daha fazla çalışma yapılmasını sağlayacaktır.

Bu raporda, santrifüj kullanarak tam kandan PRP hazırlamak için bir yöntem tanıtıyor ve açıklıyoruz. Bu yöntem, stabil bir PRP numunesini kolayca hazırlamak için çift sıkma yöntemini kullanır. PRP'nin biyolojik fonksiyonunu değerlendirmek için konsantre trombosit sayımlarını ve çeşitli proliferasyon faktörlerinin konsantrasyonunu ölçtük. Ayrıca, hASC'leri kültürlemek için hazırlanan PRP'yi kullanarak büyüme uyarıcı etkisini de doğruladık.

Protokol

Çalışma, 1975 tarihli Helsinki Deklarasyonu'nun etik yönergelerine uygun olarak Kansai Tıp Üniversitesi Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm örnekler toplandı ve donörlerden bilgilendirilmiş onam alınarak kullanıldı.

1. Hazırlık

  1. Bilgilendirilmiş onam aldıktan sonra, sağlıklı yetişkin donörlerden kan alın. Burada yaşları 28-38 arasında değişen dört erkek kan bağışçısından kan toplandı.
    1. Bağışçılara kan alımından 6 saat önce 500 mL su içmelerini önerin.
      NOT: Sağlıklı yetişkinlerde hemoglobin (Hb), kırmızı kan hücresi (RBC) sayısı ve trombosit (PL) konsantrasyonu için referans aralıkları Vajpayee19 tarafından tanımlanmıştır. Kan bağışına uygun olabilmesi için bağışçının kan tahlilinin bu aralıklar içinde olması gerekmektedir.

2. Kan alma

  1. İşlem sırasında kan bağışçılarının oturmasını sağlayın.
  2. Eldiven giyin. Bağışçı yumruk yaparken bağışçının üst koluna bir turnike sıkın.
  3. Uygun bir damar bulunduğunda, cildi% 70 alkol ile iki kez sterilize edin ve iğneyi yerleştirin.
  4. Kan almak için 21 G'lik bir şırınga kullanın. Kan alımı sırasında turnikeyi gevşetmeyin.
    1. Kanı almak için 8,5 mL'lik bir kan alma tüpü kullanın. Tüpteki kanın durumunu gözlemleyin ve kan akışı yavaşlar yavaşlamaz yeni bir tüpe geçin.
    2. PRP yapmak için yeterli miktarda kan toplayın. Toplam hacmi 34 mL olan dört tüp antikoagüle kan toplayın. Kanı antikoagülan ile karıştırmak için tüpleri 10 kez ters çevirin.
    3. Aktivatörü yapmak için kan toplamak için antikoagülan içermeyen 10 mL'lik bir serum kan alma tüpü (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın (bkz. Adım 4). 10 mL antikoagülan olmayan kan toplayın.

3. PRP yapmak için çift sıkma yöntemi

  1. Trombosit sayısı için 40 μL antikoagüle tam kan alın. Pipeti kan kontaminasyonundan korumak için filtreli pipet uçları kullanın.
  2. Antikoagüle edilmiş tam kanı 450 x g ve oda sıcaklığında 7 dakika santrifüjleyin. Bu, katmanlı kan örnekleri elde etmek için ilk dönüştür. Üst tabaka plazma fraksiyonudur, orta tabaka ince kabarık teknedir ve en alt tabaka kırmızı kan hücrelerinden oluşur.
  3. Buffy kaplamanın 2 mm altında bir çizgi oluşturmak için bir işaretleyici kullanın.
  4. Uzun kanüllü 20 mL'lik bir şırınga kullanın ve plazmayı buffy kaplamanın hemen altındaki 2 mm işaretine kadar toplayın. Buffy kaplamalı sarı plazma trombositler, lökositler ve bazı eritrositler içerir. Plazmayı iki tüpten bir serum kan alma tüpüne toplayın. Toplanan toplam 16 mL plazma hacmi için 4 tüpün içeriğini 2 tüpte birleştirin.
  5. Plazmayı buffy coat ile 1.600 x g ve oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleyin. Bu ikinci dönüş. Katmanlı kan örneklerinin süpernatanı trombositten fakir plazmadır (PPP).
  6. PPP'yi ölçü olarak 1 mL sıvı içeren 50 mL'lik bir serum kan alma tüpüne aktarmak için uzun kanüllü 20 mL'lik bir şırınga kullanın. Kalan 1 mL plazmada trombosit peletinde biriken trombositler PRP olarak kullanıldı. Toplanan toplam PRP hacmi 2 mL idi.
  7. PRP'yi her tüpte vorteksleyin ve ardından bir tüpe toplayın (toplam 2 mL).
  8. Trombosit sayımı için 400 μL PRP alın.
  9. PRP'yi, her tüpte yaklaşık 400 μL içeren birkaç 1,5 mL'lik tüpe ayırın. Toplam dört tüp vardır. Tüp başına yaklaşık 500 μL PRP önerilir.

4. Aktivatörü hazırlayın

  1. Bir serum kan alma tüpünde (adım 2.3.3) antikoagülan içermeyen 10 mL kanın oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
  2. Kan örneğini antikoagülan olmadan 8 dakika boyunca 2.015 x g'da ve oda sıcaklığında bir laboratuvar santrifüjünde santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı otolog trombin olarak toplayın.
  4. 0.5 M CaCl2 ve otolog trombini aktivatör olarak 1: 1 (h / h) oranında karıştırın. Örneğin, 500 μL CaCl2 , 500 μL otolog trombin ile karıştırıldı. Aktivatörün toplam hacmini 1 mL yapın.

5. PRP aktivasyonu

  1. PRP ve aktivatörü 10:1 (h/h) oranında karıştırın. Her 1,5 mL'lik tüpte 400 μL PRP ile 40 μL aktivatör karıştırın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Bu, pıhtılaşmış bir formda aktive edilmiş PRP'dir.

6. PRP'nin saklanması

  1. Santrifüj, 4 ° C'lik bir laboratuvar santrifüjünde 10 dakika boyunca 9.000 x g'da PRP'yi aktive etti.
  2. Süpernatanı pipet yoluyla uygun hacimli bir şırıngaya toplayın.
  3. Süpernatanı 0.22 μm'lik bir zardan süzün.
  4. Son PRP'yi kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

7. Trombosit konsantrasyonlarının ve büyüme faktörü seviyelerinin ölçümü

  1. Otomatik bir hematoloji sistemi kullanarak tüm plazma ve PRP'deki trombosit sayısını sayın (bkz.
  2. Ticari olarak temin edilebilen ELISA kitlerini kullanarak tüm plazma ve aktive edilmiş PRP'deki PDGF-BB, IGF ve EGF seviyelerinin konsantrasyonlarını analiz edin (bkz.

8. Hücre proliferasyon testi

  1. Daha önce açıklanan bir yöntemi kullanarak hASC'leri izole edin18.
    1. 1.0 x 104 hücre/kuyu yoğunluğunda hASC'leri 24 oyuklu kültür plakalarında tohumlayın ve gece boyunca 37 °C'de %10 FBS ve antibiyotik içeren DMEM'de inkübe edin. Deneylerde 7-9 numaralı pasajlardaki hASC'leri kullanın.
  2. Hücre ortamını serumsuz DMEM ile değiştirin. 6 saat sonra, belirlenen konsantrasyonlarda PRP ekleyin ve 37 ° C'de 48 saat daha inkübe edin.
  3. WST-8 çözeltisi ile 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Çok kuyulu bir plaka okuyucu ile 450 nm'de absorbansı okuyun.
  4. Standart bir eğri oluşturun: 0, 6,250, 12,500, 25,000, 50,000 ve 100,000 hücre/kuyu yoğunluklarında hASC'leri DMEM'de 24 oyuklu plakalarda 3 saat boyunca% 10 FBS ile tohumlayın. WST-8 çözeltisi ile 37 ° C'de 1 saat inkübe edildikten sonra 450 nm'de absorbansı okuyun
    1. A450 nm'ye karşı hücre sayısını çizerek standart eğriyi çizin.
  5. Standart eğriye dayalı olarak absorbanstan hASC'lerin sayısını tahmin edin.

Sonuçlar

PRP'de zenginleştirilmiş trombosit ve PDGF-BB konsantrasyonları
PRP'deki trombosit ve PDGF-BB konsantrasyonları sırasıyla 11.5 kat ve 25.9 kat artarak tüm plazmadakiler kadar yüksek olmuştur. Bununla birlikte, PRP'deki EGF konsantrasyonları değişmedi ve IGF, tüm plazmanınkinin sadece% 70'i idi (Tablo 1). Deneyler çift spin yöntemi ile dört kez tekrarlandı.

PRP stimülasyonu ile hASC'lerin gelişmi?...

Tartışmalar

PRP aktivasyonundan sonra, PDGF, EGF, IGF, TGF-β ve VEGF 1,6,7 gibi çeşitli büyüme faktörleri, yara iyileşmesini destekleyen yara hücrelerini ve dokularını "aktive eder"20,21. Kozmetik rekonstrüksiyon cerrahisi durumunda, aktive edilmiş hücrelerin iyileşmeyi indüklediği ve estetiği iyileştirdiği gösterilmiştir

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Uygulanamaz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
20 mL Syringe, Terumo syringe lock typeTerumo, Tokyo, Japan.SS-20LZP
50 mL Tube, Polypropylene Conical TubeCorning, NY, USA.352070
Automated Hematology SystemSysmex Corp., Tokyo, JapanXE-2100
Blood Collection Needle, SafeTouch PSV set with luer adapter, 21 G x 3/4”Nipro, Osaka, Japan.32-384
Blood Collection Tube, ACD Solution A Blood Collection Tube, 8.5 mLBD Vacutainer, NJ, USA.364606
Blood Collection Tube, Serum Blood Collection Tube/monovette, 10 mLBD Vacutainer, NJ, USA.366430
Calcium Chloride, 1 mEq/ mL,Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan.3215400A1061
Cannula, BS non-bevel needle, 18 G (1.2 mm) x 75 mmBS Medical, Tokyo, Japan.BS-81007Not for sale
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, JapanCK04
CentrifugeKokusan, Tokyo, Japan.H-19F
CentrifugeEppendorf, Hamburg, Germany.5415R
EnSpire 2300 Multilabel ReaderPerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
Filter UnitMerck Millipore, Co. Cork, Ireland.SLGP033RS
Human EGF Quantikine ELISA KitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADEG00
Human IGF-I Quantikine ELISA KitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADG100
Human PDGF-BB Quantikine ELISA KitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADBB00
Pipette Tip, ART 1000 Reach Barrier TipThermo Scientific, MA, USA.2079-05-HR
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μLNichiryo, Saitama, Japan.00-NPX2-1000
Sterling Nitrile Power-Free Exam GlovesKimberly-Clark50707
Yamazen Alcohol for DisinfectionYamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan.A7L07

Referanslar

  1. Eppley, B. L., Woodell, J. E., Higgins, J. Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 114 (6), 1502-1508 (2004).
  2. Salcido, R. S. Autologous platelet-rich plasma in chronic wounds. Advances in Skin & Wound. 26 (6), 248 (2013).
  3. Marx, R. E., et al. Platelet-rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 85 (6), 638-646 (1998).
  4. Bhanot, S., Alex, J. C. Current applications of platelet gels in facial plastic surgery. Facial Plastic Surgery. 18 (1), 27-33 (2002).
  5. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plastic and Reconstructive Surgery. 107 (1), 238 (2001).
  6. Eppley, B. L., Pietrzak, W. S., Blanton, M. Platelet-rich plasma: a review of biology and applications in plastic surgery. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (6), 147-159 (2006).
  7. Lubkowska, A., Dolegowska, B., Banfi, G. Growth factor content in PRP and their applicability in medicine. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 26, 3-22 (2012).
  8. Kakudo, N., et al. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 122 (5), 1352-1360 (2008).
  9. Kakudo, N., Morimoto, N., Kushida, S., Ogawa, T., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma releasate promotes angiogenesis in vitro and in vivo. Medical Molecular Morphology. 47 (2), 83-89 (2014).
  10. Liu, Y., Kalen, A., Risto, O., Wahlstrom, O. Fibroblast proliferation due to exposure to a platelet concentrate in vitro is pH dependent. Wound Repair and Regeneration. 10 (5), 336-340 (2002).
  11. Lucarelli, E., et al. Platelet-derived growth factors enhance proliferation of human stromal stem cells. Biomaterials. 24 (18), 3095-3100 (2003).
  12. Kilian, O., et al. Effects of platelet growth factors on human mesenchymal stem cells and human endothelial cells in vitro. European Journal of Medical Research. 9 (7), 337-344 (2004).
  13. Kanno, T., Takahashi, T., Tsujisawa, T., Ariyoshi, W., Nishihara, T. Platelet-rich plasma enhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 63 (3), 362-369 (2005).
  14. Gruber, R., et al. Platelet-released supernatants increase migration and proliferation, and decrease osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells under in vitro conditions. Platelets. 15 (1), 29-35 (2004).
  15. Koellensperger, E., von Heimburg, D., Markowicz, M., Pallua, N. Human serum from platelet-poor plasma for the culture of primary human preadipocytes. Stem Cells. 24 (5), 1218-1225 (2006).
  16. Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25 (5), 1270-1278 (2007).
  17. Hara, T., et al. Platelet-rich plasma stimulates human dermal fibroblast proliferation via a Ras-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway. Journal of Artificial Organs. 19 (4), 372-377 (2016).
  18. Lai, F., et al. Platelet-rich plasma enhances the proliferation of human adipose stem cells through multiple signaling pathways. Stem Cell Research and Therapy. 9 (1), 107 (2018).
  19. Vajpayee, N., Graham, S. S., Bem, S. Basic examination of blood and bone marrow. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22, 509-535 (2011).
  20. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound. 24 (4), 176-181 (2011).
  21. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  22. Cervelli, V., et al. platelet rich lipotransfert: our experience and current state of art in the combined use of fat and PRP. BioMed Research International. 2013, 434191 (2013).
  23. Gentile, P., et al. Platelet-Rich Plasma and Micrografts Enriched with Autologous Human Follicle Mesenchymal Stem Cells Improve Hair Re-Growth in Androgenetic Alopecia. Biomolecular Pathway Analysis and Clinical Evaluation. Biomedicines. 7 (2), (2019).
  24. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 3 (6), 406 (2015).
  25. Gentile, P., Casella, D., Palma, E., Calabrese, C. Engineered Fat Graft Enhanced with Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells for Regenerative Medicine: Clinical, Histological and Instrumental Evaluation in Breast Reconstruction. Journal of Clinical Medicine. 8 (4), (2019).
  26. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and Potentiality of Human Adipose-Derived Stem Cells (hASCs) Obtained from Enzymatic Digestion of Fat Graft. Cells. 8 (3), (2019).
  27. Scioli, M. G., Bielli, A., Gentile, P., Cervelli, V., Orlandi, A. Combined treatment with platelet-rich plasma and insulin favours chondrogenic and osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in three-dimensional collagen scaffolds. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (8), 2398-2410 (2017).
  28. Marx, R. E., Garg, A. K. . Dental and craniofacial applications of platelet-rich plasma. , (2005).
  29. Kakudo, N., Kushida, S., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma: the importance of platelet separation and concentration. Plastic and Reconstructive Surgery. 123 (3), 1135-1136 (2009).
  30. Kakudo, N., Kushida, S., Minakata, T., Suzuki, K., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma promotes epithelialization and angiogenesis in a splitthickness skin graft donor site. Medical Molecular Morphology. 44 (4), 233-236 (2011).
  31. Kushida, S., et al. Platelet and growth factor concentrations in activated platelet-rich plasma: a comparison of seven commercial separation systems. Journal of Artificial Organs. 17 (2), 186-192 (2014).
  32. Morimoto, N., et al. Exploratory clinical trial of combination wound therapy with a gelatin sheet and platelet-rich plasma in patients with chronic skin ulcers: study protocol. British Medical Journal Open. 5 (5), 007733 (2015).
  33. Kushida, S., Kakudo, N., Morimoto, N., Mori, Y., Kusumoto, K. Utilization of Platelet-Rich Plasma for a Fistula With Subcutaneous Cavity Following Septic Bursitis: A Case Report. Eplasty. 15, 31 (2015).
  34. Eby, B. W. Platelet-rich plasma: harvesting with a single-spin centrifuge. Journal of Oral Implantology. 28 (6), 297-301 (2002).
  35. Castillo, T. N., Pouliot, M. A., Kim, H. J., Dragoo, J. L. Comparison of growth factor and platelet concentration from commercial platelet-rich plasma separation systems. The American Journal of Sports Medicine. 39 (2), 266-271 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Aktive Trombositten Zengin PlazmaPRP Haz rlamaift Spin Y ntemiTam KanSantrif jlemeOtolog TrombinTrombosit Say mnsan Ya Kaynakl K k H crelerHASC lerin ProliferasyonuRejeneratif T pProliferasyon Uyar c EtkiY ksek Konsantrasyonlu Trombositler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır