Preparação de plasma rico em plaquetas ativado para cultura de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano

Resumo

Neste relatório, descrevemos um método de dupla rotação para preparar plasma rico em plaquetas ativado (PRP). Usando trombina autóloga, células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) foram cultivadas. O PRP ativado demonstrou promover a proliferação de hASCs.

Resumo

O plasma rico em plaquetas ativado (PRP) preparado a partir de sangue total por centrifugação demonstrou um efeito estimulante da proliferação em vários tipos de células cultivadas, implicando um possível uso na medicina regenerativa. Aqui, um método de dupla rotação foi usado para preparar o PRP a partir do sangue total. O PRP foi posteriormente ativado pela trombina autóloga. A contagem de plaquetas foi medida no PRP ativado e o efeito estimulante da proliferação em células-tronco derivadas do tecido adiposo humano (hASCs) foi examinado. A contagem de plaquetas resultante foi 11,5 vezes maior no PRP do que no plasma sanguíneo total. A proliferação de hASCs foi marcadamente aumentada pela incubação com 1% de PRP. O método descrito pode ser usado para preparar o PRP de forma reprodutível com alta concentração de plaquetas. O PRP preparado por este método promove acentuadamente a proliferação de hASCs.

Introdução

O plasma rico em plaquetas ativado (PRP) é preparado por centrifugação de sangue total e mostra conter plaquetas bem acima dos níveis basais¹. A PPR autóloga tem sido amplamente utilizada no tratamento cirúrgico,^{incluindo cicatrização} de feridas2^{, lesão} óssea3 e cirurgias estéticas4,5. Após a ativação das plaquetas no PRP, os grânulos α presentes nas plaquetas liberam diversos fatores de crescimento, como fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs), fator de crescimento transformador beta (TGF-β), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e outros ^1,6,7. Esses fatores de crescimento desempenham um papel importante na proliferação celular⁸, migração⁹ e diferenciação⁹.

Até o momento, vários estudos relataram o efeito estimulante da proliferação do PRP em diferentes tipos de células 10,11,12,13,14,15,16. Um desses tipos de células são as células-tronco derivadas do tecido adiposo humano (hASCs); As hASCs existem no tecido adiposo humano e podem ser facilmente coletadas em grande número. O efeito regenerativo das hASCs sugere ainda um uso potencial em aplicações clínicas⁸. Nossos estudos anteriores relataram que, em comparação com o PRP não ativado, o PRP ativado teve um efeito proliferativo acentuado nas hASCs e fibroblastos dérmicos humanos (hDFs)⁸. Além disso, relatamos que o PRP promove a proliferação de hDFs por meio de uma via de sinalização ERK1/2¹⁷. Recentemente, também relatamos que o PRP promove a proliferação de hASCs por meio das vias de sinalização ERK1/2, JNK e Akt¹⁸. Nas hASCs, o PRP desempenha um papel importante como suplemento que promove a proliferação. O conhecimento sobre o efeito do PRP nas hASCs ajudará no desenvolvimento de métodos de cultura em larga escala e permitirá novos estudos sobre o mecanismo de proliferação em hASCs.

Neste relatório, apresentamos e descrevemos um método para preparar o PRP a partir de sangue total usando centrifugação. Este método usa o método de rotação dupla para preparar facilmente uma amostra estável de PRP. Para avaliar a função biológica do PRP, medimos a contagem concentrada de plaquetas e a concentração de vários fatores de proliferação. Também confirmamos o efeito estimulador do crescimento usando o PRP preparado para cultivo de hASCs.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão de Ética da Universidade Médica de Kansai de acordo com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinque de 1975. Todos os espécimes foram coletados e utilizados com consentimento informado dos doadores.

1. Preparação

1. Depois de obter o consentimento informado, colete sangue de doadores adultos saudáveis. Aqui, o sangue foi coletado de quatro doadores de sangue do sexo masculino com idades entre 28 e 38 anos.
   1. Recomenda-se que os doadores bebam 500 mL de água 6 h antes da coleta de sangue.
      NOTA: Os intervalos de referência para hemoglobina (Hb), contagem de glóbulos vermelhos (RBC) e concentração de plaquetas (PL) em adultos saudáveis são descritos por Vajpayee¹⁹. Para ser adequado para doação de sangue, a análise de sangue do doador deve estar dentro desses intervalos.

2. Coleta de sangue

1. Faça com que os doadores de sangue se sentem durante o procedimento.
2. Use luvas. Prenda um torniquete no braço do doador enquanto o doador fecha o punho.
3. Assim que uma veia adequada for encontrada, esterilize a pele duas vezes com álcool 70% e insira a agulha.
4. Use uma seringa de 21 G para coletar sangue. Não afrouxe o torniquete durante a coleta de sangue.
   1. Use um tubo de coleta de sangue de 8,5 mL para coletar o sangue. Observe o estado do sangue no tubo e mude para um novo tubo assim que o fluxo sanguíneo diminuir.
   2. Colete uma quantidade suficiente de sangue para fazer o PRP. Colete quatro tubos de sangue anticoagulado com um volume total de 34 mL. Inverta os tubos 10 vezes para misturar o sangue com o anticoagulante.
   3. Use um tubo de coleta de sangue sérico de 10 mL (consulte a Tabela de Materiais) sem anticoagulante para coletar sangue para fazer o ativador (consulte a Etapa 4). Colete 10 mL de sangue não anticoagulante.

3. Método de rotação dupla para fazer PRP

1. Tome 40 μL de sangue total anticoagulado para a contagem de plaquetas. Use pontas de pipeta filtradas para proteger a pipeta da contaminação do sangue.
2. Centrifugue o sangue total anticoagulado por 7 min a 450 x g e temperatura ambiente. Esta é a primeira rotação para obter amostras de sangue em camadas. A camada superior é a fração plasmática, a camada intermediária é o fino barco buffy e a camada inferior consiste em glóbulos vermelhos.
3. Use um marcador para fazer uma linha 2 mm abaixo do revestimento buffy.
4. Use uma seringa de 20 mL com uma cânula longa para coletar o plasma apenas até a marca de 2 mm abaixo do revestimento leucocitário. O plasma amarelo com revestimento leucocitário contém plaquetas, leucócitos e alguns eritrócitos. Colete o plasma de dois tubos em um tubo de coleta de sangue de soro. Combine o conteúdo de 4 tubos em 2 tubos para um volume total de 16 mL de plasma coletado.
5. Centrifugue o plasma com o buffy coat por 5 min a 1.600 x g e temperatura ambiente. Esta é a segunda rodada. O sobrenadante das amostras de sangue em camadas é o plasma pobre em plaquetas (PPP).
6. Use uma seringa de 20 mL com uma cânula longa para transferir o PPP para um tubo de coleta de sangue sérico de 50 mL contendo 1 mL de líquido como medida. As plaquetas que se acumularam no pellet de trombócitos no plasma de 1 mL restante foram usadas como PRP. O volume total de PRP coletado foi de 2 mL.
7. Vortex o PRP em cada tubo e, em seguida, agrupe em um tubo (total de 2 mL).
8. Tome 400 μL do PRP para uma contagem de plaquetas.
9. Aliquote o PRP em vários tubos de 1,5 mL, contendo aproximadamente 400 μL em cada tubo. Há um total de quatro tubos. Recomenda-se aproximadamente 500 μL de PRP por tubo.

4. Prepare o ativador

1. Deixe os 10 mL de sangue sem anticoagulante em um tubo de coleta de sangue de soro (etapa 2.3.3) descansar por 30 minutos em temperatura ambiente.
2. Centrifugue a amostra de sangue sem anticoagulante por 8 min a 2.015 x g e temperatura ambiente em uma centrífuga de laboratório.
3. Colete o sobrenadante como trombina autóloga.
4. Misture CaCl_{0,5 M 2} e trombina autóloga na proporção de 1:1 (v/v) como ativador. Por exemplo, 500 μL de CaCl₂ foram misturados com 500 μL de trombina autóloga. Faça um volume total de 1 mL do ativador.

5. Ativação do PRP

1. Misture o PRP e o ativador em uma proporção de 10:1 (v/v). Misture 400 μL de PRP com 40 μL do ativador em cada tubo de 1,5 mL e, em seguida, incube por 10 min em temperatura ambiente. Este é o PRP ativado em uma forma coagulada.

6. Armazenamento de PRP

1. A centrífuga ativou o PRP a 9.000 x g por 10 min em uma centrífuga de laboratório a 4 °C.
2. Recolher o sobrenadante através de uma pipeta para uma seringa de volume adequada.
3. Filtrar o sobrenadante através de uma membrana de 0,22 μm.
4. Conservar o PRP final a -80 °C até à utilização.

7. Medição das concentrações de plaquetas e dos níveis de fatores de crescimento

1. Conte o número de plaquetas no plasma total e no PRP usando um sistema de hematologia automatizado (consulte a Tabela de Materiais).
2. Analise as concentrações de níveis de PDGF-BB, IGF e EGF no plasma total e no PRP ativado usando kits ELISA disponíveis comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).

8. Ensaio de proliferação celular

1. Isolar os hASC utilizando um método¹⁸ descrito anteriormente.
   1. Semeie hASCs a uma densidade de 1,0 x 10⁴ células/poço em placas de cultura de 24 poços e incube em DMEM contendo 10% de FBS e antibióticos durante a noite a 37 °C. Use hASCs das passagens 7-9 em experimentos.
2. Substitua o meio celular por DMEM sem soro. Após 6 h, adicionar PRP nas concentrações designadas e incubar novamente durante 48 h a 37 °C.
3. Incubar com solução WST-8 (ver Tabela de Materiais) durante 1 h a 37 °C. Leia a absorbância a 450 nm com um leitor de placas de vários poços.
4. Construa uma curva padrão: semeie hASCs em densidades de 0, 6.250, 12.500, 25.000, 50.000 e 100.000 células/poço em placas de 24 poços em DMEM com 10% de FBS por 3 h. Ler a absorvância a 450 nm após incubação com solução WST-8 durante 1 h a 37 °C
   1. Desenhe a curva padrão plotando o número de células em relação ao A_{450 nm}.
5. Estime o número de hASCs da absorbância com base na curva padrão.

Resultados

Concentrações enriquecidas de plaquetas e PDGF-BB em PRP
As concentrações de plaquetas e PDGF-BB no PRP aumentaram 11,5 vezes e 25,9 vezes, respectivamente, tão altas quanto as do plasma total. No entanto, as concentrações de EGF no PRP não foram alteradas e o IGF foi de apenas 70% do plasma total (Tabela 1). Os experimentos foram replicados quatro vezes pelo método de duplo spin.

Aumento da proliferação ...

Discussão

Após a ativação do PRP, vários fatores de crescimento, como PDGF, EGF, IGF, TGF-β e VEGF ^1,6,7 "ativam" células e tecidos de feridas promovendo a cicatrização de feridas^20,21. No caso da cirurgia de reconstrução estética, as células ativadas demonstraram induzir a cicatrização e melhorar a estética^22,23

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 mL Syringe, Terumo syringe lock type	Terumo, Tokyo, Japan.	SS-20LZP
50 mL Tube, Polypropylene Conical Tube	Corning, NY, USA.	352070
Automated Hematology System	Sysmex Corp., Tokyo, Japan	XE-2100
Blood Collection Needle, SafeTouch PSV set with luer adapter, 21 G x 3/4”	Nipro, Osaka, Japan.	32-384
Blood Collection Tube, ACD Solution A Blood Collection Tube, 8.5 mL	BD Vacutainer, NJ, USA.	364606
Blood Collection Tube, Serum Blood Collection Tube/monovette, 10 mL	BD Vacutainer, NJ, USA.	366430
Calcium Chloride, 1 mEq/ mL,	Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan.	3215400A1061
Cannula, BS non-bevel needle, 18 G (1.2 mm) x 75 mm	BS Medical, Tokyo, Japan.	BS-81007	Not for sale
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan	CK04
Centrifuge	Kokusan, Tokyo, Japan.	H-19F
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany.	5415R
EnSpire 2300 Multilabel Reader	PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
Filter Unit	Merck Millipore, Co. Cork, Ireland.	SLGP033RS
Human EGF Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DEG00
Human IGF-I Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DG100
Human PDGF-BB Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DBB00
Pipette Tip, ART 1000 Reach Barrier Tip	Thermo Scientific, MA, USA.	2079-05-HR
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μL	Nichiryo, Saitama, Japan.	00-NPX2-1000
Sterling Nitrile Power-Free Exam Gloves	Kimberly-Clark	50707
Yamazen Alcohol for Disinfection	Yamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan.	A7L07