Preparación de plasma rico en plaquetas activado para el cultivo de células madre derivadas del tejido adiposo humano

Resumen

En este informe, describimos un método de doble giro para preparar plasma rico en plaquetas activado (PRP). Utilizando trombina autóloga, se cultivaron células madre derivadas del tejido adiposo humano (hASCs). Se ha demostrado que el PRP activado promueve la proliferación de hASCs.

Resumen

El plasma rico en plaquetas activado (PRP) preparado a partir de sangre total mediante centrifugación demostró un efecto estimulante de la proliferación en varios tipos de células cultivadas, lo que implica un posible uso en medicina regenerativa. En este caso, se utilizó un método de doble centrifugado para preparar PRP a partir de sangre entera. El PRP se activó aún más por la trombina autóloga. Se midió el recuento de plaquetas en el PRP activado y se examinó el efecto estimulante de la proliferación en las células madre derivadas del tejido adiposo humano (hASCs). El recuento de plaquetas resultante fue 11,5 veces mayor en PRP que en plasma de sangre total. La proliferación de hASCs se incrementó notablemente con la incubación con 1% de PRP. El método descrito se puede utilizar para preparar PRP de forma reproducible con una alta concentración de plaquetas. El PRP preparado por este método promueve marcadamente la proliferación de hASCs.

Introducción

El plasma rico en plaquetas activado (PRP) se prepara por centrifugación de sangre total y se ha demostrado que contiene plaquetas muy por encima de los niveles basales¹. La RPP autóloga se ha utilizado ampliamente en el tratamiento quirúrgico, incluida la cicatrización de heridas², lesiones óseas³ y cirugías estéticas ^4,5. Después de la activación de las plaquetas en el PRP, los gránulos α presentes en las plaquetas liberan varios factores de crecimiento, como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y otros ^1,6,7. Estos factores de crecimiento juegan un papel importante en la proliferación^{celular 8}, la migración⁹ y la diferenciación⁹.

Hasta la fecha, varios estudios han reportado el efecto estimulante de la proliferación del PRP en diferentes tipos de células 10,11,12,13,14,15,16. Uno de estos tipos de células son las células madre derivadas del tejido adiposo humano (hASCs); Las hASC existen en el tejido adiposo humano y se pueden recolectar fácilmente en grandes cantidades. El efecto regenerativo de las hASCs sugiere además un uso potencial en aplicaciones clínicas⁸. Nuestros estudios previos informaron que, en comparación con el PRP no activado, el PRP activado tenía un marcado efecto proliferativo sobre las hASC y los fibroblastos dérmicos humanos (hDF)⁸. Además, informamos que el PRP promueve la proliferación de hDFs a través de una vía de señalización ERK1/2¹⁷. Recientemente, también informamos que el PRP promueve la proliferación de hASCs a través de las vías de señalización ERK1/2, JNK y Akt¹⁸. En las hASCs, el PRP juega un papel importante como suplemento que promueve la proliferación. El conocimiento sobre el efecto del PRP en las hASC ayudará al desarrollo de métodos de cultivo a gran escala y permitirá realizar más estudios sobre el mecanismo de proliferación en las hASC.

En este informe, presentamos y describimos un método para preparar PRP a partir de sangre total mediante centrifugación. Este método utiliza el método de doble centrifugado para preparar fácilmente una muestra estable de PRP. Para evaluar la función biológica del PRP, medimos los recuentos concentrados de plaquetas y la concentración de varios factores de proliferación. También confirmamos el efecto estimulador del crecimiento mediante el uso del PRP preparado para el cultivo de hASCs.

Protocolo

El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión de Ética de la Universidad Médica de Kansai de acuerdo con las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975. Todos los especímenes fueron recolectados y utilizados con el consentimiento informado de los donantes.

1. Preparación

1. Después de obtener el consentimiento informado, extraiga sangre de donantes adultos sanos. Aquí, se recolectó sangre de cuatro donantes de sangre masculinos de entre 28 y 38 años.
   1. Se recomienda a los donantes beber 500 mL de agua 6 h antes de la extracción de sangre.
      NOTA: Los rangos de referencia para la hemoglobina (Hb), el recuento de glóbulos rojos (RBC) y la concentración de plaquetas (PL) en adultos sanos son descritos por Vajpayee¹⁹. Para que sea apto para la donación de sangre, se requiere que el análisis de sangre del donante esté dentro de estos rangos.

2. Extracción de sangre

1. Haga que los donantes de sangre se sienten durante el procedimiento.
2. Usa guantes. Coloque un torniquete en la parte superior del brazo del donante mientras el donante cierra el puño.
3. Una vez que se encuentre una vena adecuada, esterilice la piel dos veces con alcohol al 70% e inserte la aguja.
4. Use una jeringa de 21 g para recolectar sangre. No afloje el torniquete durante la extracción de sangre.
   1. Use un tubo de recolección de sangre de 8.5 mL para recolectar la sangre. Observe el estado de la sangre en el tubo y cambie a un nuevo tubo tan pronto como el flujo sanguíneo disminuya.
   2. Recoja una cantidad suficiente de sangre para producir el PRP. Recolectar cuatro tubos de sangre anticoagulada con un volumen total de 34 mL. Invierta los tubos 10 veces para mezclar la sangre con el anticoagulante.
   3. Utilice un tubo de recolección de sangre sérica de 10 mL (consulte la Tabla de materiales) sin anticoagulante para recolectar sangre para fabricar el activador (consulte el paso 4). Recolectar 10 mL de sangre no anticoagulante.

3. Método de doble giro para hacer PRP

1. Tome 40 μL de sangre entera anticoagulada para el recuento de plaquetas. Utilice puntas de pipeta filtradas para proteger la pipeta de la contaminación sanguínea.
2. Centrifugar la sangre entera anticoagulada durante 7 min a 450 x g y temperatura ambiente. Este es el primer giro para obtener muestras de sangre en capas. La capa superior es la fracción plasmática, la capa intermedia es el delgado bote leucocitario y la capa inferior está formada por glóbulos rojos.
3. Usa un marcador para hacer una línea a 2 mm por debajo del pelaje buffy.
4. Use una jeringa de 20 ml con una cánula larga para recolectar el plasma justo hasta la marca de 2 mm por debajo de la capa leucocitaria. El plasma amarillo con capa leucocitaria contiene plaquetas, leucocitos y algunos eritrocitos. Recolectar el plasma de dos tubos en un tubo de recolección de sangre sérica. Combine el contenido de 4 tubos en 2 tubos para obtener un volumen total de 16 mL de plasma recolectado.
5. Centrifugar el plasma con la capa leucocitaria durante 5 min a 1.600 x g y temperatura ambiente. Este es el segundo giro. El sobrenadante de las muestras de sangre en capas es plasma pobre en plaquetas (PPP).
6. Utilice una jeringa de 20 mL con una cánula larga para transferir la PPP a un tubo de recolección de sangre sérica de 50 mL que contenga 1 mL de líquido como medida. Las plaquetas que se acumularon en el pellet del trombócito en el plasma de 1 mL restante se utilizaron como PRP. El volumen total de PRP recolectado fue de 2 mL.
7. Agite el PRP en cada tubo y luego acompáñelo en un tubo (total 2 mL).
8. Tome 400 μL de PRP para un recuento de plaquetas.
9. Aliquotar el PRP en varios tubos de 1,5 mL, que contienen aproximadamente 400 μL en cada tubo. Hay un total de cuatro tubos. Se recomiendan aproximadamente 500 μL de PRP por tubo.

4. Prepara el activador

1. Deje reposar los 10 ml de sangre sin anticoagulante en un tubo de extracción de sangre sérica (paso 2.3.3) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
2. Centrifugar la muestra de sangre sin anticoagulante durante 8 min a 2.015 x g y temperatura ambiente en una centrífuga de laboratorio.
3. Recoja el sobrenadante como trombina autóloga.
4. Mezclar CaCl₂ 0,5 M y trombina autóloga en una proporción de 1:1 (v/v) como activador. Por ejemplo, se mezclaron 500 μL de CaCl₂ con 500 μL de trombina autóloga. Haga un volumen total de 1 mL del activador.

5. Activación de PRP

1. Mezcle el PRP y el activador en una proporción de 10:1 (v/v). Mezcle 400 μL de PRP con 40 μL del activador en cada tubo de 1,5 mL y, a continuación, incube durante 10 min a temperatura ambiente. Este es PRP activado en forma coagulada.

6. Almacenamiento de PRP

1. Centrífuga de PRP activado a 9.000 x g durante 10 min en una centrífuga de laboratorio a 4 °C.
2. Recoja el sobrenadante a través de una pipeta en una jeringa de volumen adecuado.
3. Filtre el sobrenadante a través de una membrana de 0,22 μm.
4. Almacene el PRP final a -80 °C hasta su uso.

7. Medición de las concentraciones de plaquetas y los niveles de factores de crecimiento

1. Contar el número de plaquetas en plasma entero y PRP utilizando un sistema de hematología automatizado (ver Tabla de Materiales).
2. Analice las concentraciones de los niveles de PDGF-BB, IGF y EGF en plasma entero y PRP activado utilizando kits de ELISA disponibles comercialmente (consulte la tabla de materiales).

8. Ensayo de proliferación celular

1. Aislar las hASC utilizando un método descrito anteriormente¹⁸.
   1. Siembre hASC a una densidad de 1,0 x 10⁴ células/pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos e incube en DMEM que contenga un 10% de FBS y antibióticos durante la noche a 37 °C. Utilice las hASC de los pasajes 7 a 9 en los experimentos.
2. Reemplace los medios celulares con DMEM sin suero. Después de 6 h, agregue PRP a las concentraciones designadas y vuelva a incubar durante 48 h a 37 °C.
3. Incubar con solución WST-8 (ver Tabla de Materiales) durante 1 h a 37 °C. Lectura de absorbancia a 450 nm con un lector de placas multipocillo.
4. Construya una curva estándar: Siembre hASC a densidades de 0, 6,250, 12,500, 25,000, 50,000 y 100,000 celdas/pocillo en placas de 24 pocillos en DMEM con 10% de FBS durante 3 h. Leer la absorbancia a 450 nm después de la incubación con la solución WST-8 durante 1 h a 37 °C
   1. Dibuje la curva estándar trazando el número de celdas frente a A_{450 nm}.
5. Estime el número de hASC a partir de la absorbancia en función de la curva estándar.

Resultados

Concentraciones enriquecidas de plaquetas y PDGF-BB en PRP
Las concentraciones de plaquetas y PDGF-BB en PRP aumentaron 11,5 veces y 25,9 veces, respectivamente, tan altas como las del plasma entero. Sin embargo, las concentraciones de EGF en el PRP no cambiaron y el IGF fue solo el 70% del plasma total (Tabla 1). Los experimentos se replicaron cuatro veces por el método de doble espín.

Aumento de la proliferació...

Discusión

Después de la activación del PRP, varios factores de crecimiento, como PDGF, EGF, IGF, TGF-β y VEGF ^1,6,7 "activan" las células y tejidos de las heridas, promoviendo la cicatrización de las heridas^20,21. En el caso de la cirugía estética de reconstrucción, se ha demostrado que las células activadas inducen la cicatrización y me...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 mL Syringe, Terumo syringe lock type	Terumo, Tokyo, Japan.	SS-20LZP
50 mL Tube, Polypropylene Conical Tube	Corning, NY, USA.	352070
Automated Hematology System	Sysmex Corp., Tokyo, Japan	XE-2100
Blood Collection Needle, SafeTouch PSV set with luer adapter, 21 G x 3/4”	Nipro, Osaka, Japan.	32-384
Blood Collection Tube, ACD Solution A Blood Collection Tube, 8.5 mL	BD Vacutainer, NJ, USA.	364606
Blood Collection Tube, Serum Blood Collection Tube/monovette, 10 mL	BD Vacutainer, NJ, USA.	366430
Calcium Chloride, 1 mEq/ mL,	Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan.	3215400A1061
Cannula, BS non-bevel needle, 18 G (1.2 mm) x 75 mm	BS Medical, Tokyo, Japan.	BS-81007	Not for sale
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan	CK04
Centrifuge	Kokusan, Tokyo, Japan.	H-19F
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany.	5415R
EnSpire 2300 Multilabel Reader	PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
Filter Unit	Merck Millipore, Co. Cork, Ireland.	SLGP033RS
Human EGF Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DEG00
Human IGF-I Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DG100
Human PDGF-BB Quantikine ELISA Kit	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	DBB00
Pipette Tip, ART 1000 Reach Barrier Tip	Thermo Scientific, MA, USA.	2079-05-HR
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μL	Nichiryo, Saitama, Japan.	00-NPX2-1000
Sterling Nitrile Power-Free Exam Gloves	Kimberly-Clark	50707
Yamazen Alcohol for Disinfection	Yamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan.	A7L07