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Method Article
En este informe, describimos un método de doble giro para preparar plasma rico en plaquetas activado (PRP). Utilizando trombina autóloga, se cultivaron células madre derivadas del tejido adiposo humano (hASCs). Se ha demostrado que el PRP activado promueve la proliferación de hASCs.
El plasma rico en plaquetas activado (PRP) preparado a partir de sangre total mediante centrifugación demostró un efecto estimulante de la proliferación en varios tipos de células cultivadas, lo que implica un posible uso en medicina regenerativa. En este caso, se utilizó un método de doble centrifugado para preparar PRP a partir de sangre entera. El PRP se activó aún más por la trombina autóloga. Se midió el recuento de plaquetas en el PRP activado y se examinó el efecto estimulante de la proliferación en las células madre derivadas del tejido adiposo humano (hASCs). El recuento de plaquetas resultante fue 11,5 veces mayor en PRP que en plasma de sangre total. La proliferación de hASCs se incrementó notablemente con la incubación con 1% de PRP. El método descrito se puede utilizar para preparar PRP de forma reproducible con una alta concentración de plaquetas. El PRP preparado por este método promueve marcadamente la proliferación de hASCs.
El plasma rico en plaquetas activado (PRP) se prepara por centrifugación de sangre total y se ha demostrado que contiene plaquetas muy por encima de los niveles basales1. La RPP autóloga se ha utilizado ampliamente en el tratamiento quirúrgico, incluida la cicatrización de heridas2, lesiones óseas3 y cirugías estéticas 4,5. Después de la activación de las plaquetas en el PRP, los gránulos α presentes en las plaquetas liberan varios factores de crecimiento, como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y otros 1,6,7. Estos factores de crecimiento juegan un papel importante en la proliferacióncelular 8, la migración9 y la diferenciación9.
Hasta la fecha, varios estudios han reportado el efecto estimulante de la proliferación del PRP en diferentes tipos de células 10,11,12,13,14,15,16. Uno de estos tipos de células son las células madre derivadas del tejido adiposo humano (hASCs); Las hASC existen en el tejido adiposo humano y se pueden recolectar fácilmente en grandes cantidades. El efecto regenerativo de las hASCs sugiere además un uso potencial en aplicaciones clínicas8. Nuestros estudios previos informaron que, en comparación con el PRP no activado, el PRP activado tenía un marcado efecto proliferativo sobre las hASC y los fibroblastos dérmicos humanos (hDF)8. Además, informamos que el PRP promueve la proliferación de hDFs a través de una vía de señalización ERK1/217. Recientemente, también informamos que el PRP promueve la proliferación de hASCs a través de las vías de señalización ERK1/2, JNK y Akt18. En las hASCs, el PRP juega un papel importante como suplemento que promueve la proliferación. El conocimiento sobre el efecto del PRP en las hASC ayudará al desarrollo de métodos de cultivo a gran escala y permitirá realizar más estudios sobre el mecanismo de proliferación en las hASC.
En este informe, presentamos y describimos un método para preparar PRP a partir de sangre total mediante centrifugación. Este método utiliza el método de doble centrifugado para preparar fácilmente una muestra estable de PRP. Para evaluar la función biológica del PRP, medimos los recuentos concentrados de plaquetas y la concentración de varios factores de proliferación. También confirmamos el efecto estimulador del crecimiento mediante el uso del PRP preparado para el cultivo de hASCs.
El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión de Ética de la Universidad Médica de Kansai de acuerdo con las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975. Todos los especímenes fueron recolectados y utilizados con el consentimiento informado de los donantes.
1. Preparación
2. Extracción de sangre
3. Método de doble giro para hacer PRP
4. Prepara el activador
5. Activación de PRP
6. Almacenamiento de PRP
7. Medición de las concentraciones de plaquetas y los niveles de factores de crecimiento
8. Ensayo de proliferación celular
Concentraciones enriquecidas de plaquetas y PDGF-BB en PRP
Las concentraciones de plaquetas y PDGF-BB en PRP aumentaron 11,5 veces y 25,9 veces, respectivamente, tan altas como las del plasma entero. Sin embargo, las concentraciones de EGF en el PRP no cambiaron y el IGF fue solo el 70% del plasma total (Tabla 1). Los experimentos se replicaron cuatro veces por el método de doble espín.
Aumento de la proliferació...
Después de la activación del PRP, varios factores de crecimiento, como PDGF, EGF, IGF, TGF-β y VEGF 1,6,7 "activan" las células y tejidos de las heridas, promoviendo la cicatrización de las heridas20,21. En el caso de la cirugía estética de reconstrucción, se ha demostrado que las células activadas inducen la cicatrización y me...
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
No aplicable.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
20 mL Syringe, Terumo syringe lock type | Terumo, Tokyo, Japan. | SS-20LZP | |
50 mL Tube, Polypropylene Conical Tube | Corning, NY, USA. | 352070 | |
Automated Hematology System | Sysmex Corp., Tokyo, Japan | XE-2100 | |
Blood Collection Needle, SafeTouch PSV set with luer adapter, 21 G x 3/4” | Nipro, Osaka, Japan. | 32-384 | |
Blood Collection Tube, ACD Solution A Blood Collection Tube, 8.5 mL | BD Vacutainer, NJ, USA. | 364606 | |
Blood Collection Tube, Serum Blood Collection Tube/monovette, 10 mL | BD Vacutainer, NJ, USA. | 366430 | |
Calcium Chloride, 1 mEq/ mL, | Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan. | 3215400A1061 | |
Cannula, BS non-bevel needle, 18 G (1.2 mm) x 75 mm | BS Medical, Tokyo, Japan. | BS-81007 | Not for sale |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan | CK04 | |
Centrifuge | Kokusan, Tokyo, Japan. | H-19F | |
Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany. | 5415R | |
EnSpire 2300 Multilabel Reader | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | ||
Filter Unit | Merck Millipore, Co. Cork, Ireland. | SLGP033RS | |
Human EGF Quantikine ELISA Kit | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DEG00 | |
Human IGF-I Quantikine ELISA Kit | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DG100 | |
Human PDGF-BB Quantikine ELISA Kit | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DBB00 | |
Pipette Tip, ART 1000 Reach Barrier Tip | Thermo Scientific, MA, USA. | 2079-05-HR | |
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μL | Nichiryo, Saitama, Japan. | 00-NPX2-1000 | |
Sterling Nitrile Power-Free Exam Gloves | Kimberly-Clark | 50707 | |
Yamazen Alcohol for Disinfection | Yamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan. | A7L07 |
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