ラットにおける異所性心臓と心筋細胞移植のための免疫学的モデル

要約

我々は、ラットにおける異所性腹部心臓移植のモデルを記述し、現在の戦略の改変を暗示し、外科的アプローチを単純化する。さらに、重要な心筋細胞の耳内注射による新しい拒絶反応モデルを記述し、ラットにおける免疫学的分析をさらに可能にする。

要約

ラットにおける異所性心臓移植は、50年以上にわたり多様な免疫学的研究のために一般的に使用されてきたモデルである。1964年の最初の説明以来、いくつかの変更が報告されています。ラットで30年間異所性心臓移植を行った後、我々は簡単に教えられ、さらなる外科的訓練や背景なしで行うことができる簡単な外科的アプローチを開発しました。

上頂大動脈の解剖および肺動脈の解剖および上および下および下の静脈および肺静脈の結紮の後、ドナー心臓は収穫され、その後ヘパリンを補った氷冷生理食水溶液で浸透する。レシピエント腹部血管をクランプして切開した後、ドナーの上が大動脈と肺動脈は、連続的な走り縫合糸を使用して、それぞれレシピエント腹部大動脈および下大静脈に吻合される。

異なるドナーとレシピエントの組み合わせに応じて、このモデルは、同種移植片の急性または慢性拒絶反応の分析を可能にする。このモデルの免疫学的意義は、重要な心筋細胞の耳内注射と子宮頸部リンパ組織の排液のその後の分析の新しいアプローチによってさらに高められる。

概要

異所性心臓移植は、移植耐性、急性および慢性同種移植片拒絶、虚血再灌流傷害、機械灌流または心臓改造に関する様々な調査のために頻繁に使用される実験モデルである。他の利点の中で、移植機能は、触診および移植片の障害によって非侵襲的に監視することができ、腎臓または肝臓などの他の器官とは対照的に、レシピエントの重要な障害をもたさない。

1964年、Abbottらは当初ラット¹における異所性腹部心臓移植について説明した。その後、1966年に、解剖学のためのエンドツーサイド技術は、Tomitaららによって記述^{されました。}現在使用されているモデルの基礎は、1969年に小野とリンジーによって報告^{されました 3}.過去数十年の間に、異種の異所性心臓肺移植^4、5、6,6を含む、アンロードされた、部分的にロードされた、または積み込まれた左心室⁴の心臓移植片の異なるタイプを作成するために^{いくつかの}変更が公開されている。免疫学的分析では、非体積負荷の心臓移植移植が最も一般的に行われる。この場合、血流は逆行してドナーの大動脈を上昇し、その後冠状動脈に入る。静脈の排水は、冠動脈静脈内に沿って右心房と心室に入って起こる(図1A-B)。したがって、左心室は、テベシア静脈からの血液の限界量とは別に、血流から除外される。これはまた、左心室補助装置療法7の間に病態生理学的メカニズムを研究するための有用なモデルになる^。

異所性心臓移植は、マウス、ウサギ、ブタを含む様々な種で行われ、^,ヒト^{8、9、10、119}のユニまたは自転車補助装置としても⁸使用されている。^,1011ラットは移植モデルに対して依然として一般的な実験動物を表しており、特に異なるラット株の組み合わせに対する移植片生存時間が過去に明確に定義されており、多数の免疫学的試薬が^12,13,13にアクセス可能であるためである。マウスとは異なり、ラットは、より大きな手術を行い、免疫学的分析のためのより現実的な¹²のためにリンパ組織へのアクセスを行う。さらに、近年ラットに商業的クローニング技術が導入されると、実験ラットモデル¹⁴に対する関心が再び高まる可能性が高い。

一般に、異所性心臓移植片は、子宮頸部または腹部吻当を行うことによって、レシピエント血管に結合することができる。しかし、いくつかの研究は、大腿骨吻合が手動触診または経胎児心エコー検査のためのより良いアクセスによる改善されたモニタリングを促進し、したがって、移植片の失敗^15、16,16のより正確な検出を可能にすることを示唆している。

両方の吻合技術¹⁷の間に、手術時間、合併症率、転帰および移植片生存時間に関する相違がないことを示している。明らかに、十分な数のリンパ節の排出の可用性は、子宮頸部吻合の利点として言及されなければならない。ただし、より長いトレーニング期間が必要です。対照的に、腹部吻合は、特に同種心筋細胞の耳内注射とその後の子宮頸部リンパ管切除術の新しい方法の結果と組み合わせると、免疫学的調査のためにそれほど複雑ではなく、同様に価値がある。両方のモデルの組み合わせは、介入後の免疫学的分析の広いスペクトルを提供しています。

以下のプロトコルは、虚血時間を短縮するために外科医の対で動作することを指す。しかし、すべての実験は、単一の人が行うことができます。心臓の排泄および移植のための器具および材料のセットアップは図2A-Bに表示される。

プロトコル

すべての動物の経験は、承認ID12/0768と17/2472でニーダーザクセン州(LAVES、オルデンブルク、ドイツ)の消費者保護と食品安全のための地域当局の地元の倫理動物審査委員会のガイドラインに従って行われています。

1. 心臓の流出と灌流

注:移植片ドナーとして、7〜22週齢の雌または雄のラットが使用された。

1. イソフルラン吸入(1 L/minの_O2流量で5%、維持時に5%で誘導)することによりドナーラットを麻酔する。術周麻酔のための体重のkg当たりカルプロフェン5mgを皮下に注入し、つま先ピンチ離脱反射の欠如を確認する。
2. 目の潤滑剤を塗布し、機械的なクリッパーを使用して腹部と胸部の毛皮を取り除きます。
3. ドナーをスピービンの位置に置き、手術台の基部に弾性バンドで手足を固定し、70%エタノールまたは別の十分な代替手段で皮膚を殺菌する。
4. 局所麻酔薬の塗布後、縦方向に皮膚を切開(例えば、リドカイン0.2%)はさみを使用して、中央値の腹腔切多を行います。
5. レトラクタを挿入し、ドナーの左側に腸を動員し、下の静脈を殺菌綿棒で露出させる。
6. 抗凝固の場合は、下の静脈を穿刺して1mLの氷冷等張生理食合液に溶解した500 I.U.のヘパリンを静脈内に注入する。針の引き込み後に綿棒で光圧縮することにより穿刺部位での出血を止める(図3A)。
7. 横隔膜を切開し、ドナーの両側に側部開切術を行う。
8. 胸郭の動員された腹側壁を操作テーブルにピン留めします。
9. 2つのマイクロニードルホルダーを使用して鈍い調製によって心膜と迷走神経を取り除きます。
10. ドナーを外装し、心臓をアンロードするために腹部血管の切除を行う。
11. プローブ尖ったはさみの鈍い枝を心膜静脈内に挿入し、濡れた圧縮で心臓の軽い尾側の牽引の下で可能な限り遠位に上昇大動脈と肺動脈を分離する(図3B)。
12. 上方静脈と下静脈と肺静脈の周りに単一の5-0合字を配置し、可能な限り後ろ向きに締めます(図3C)。
13. 組織の裏を合字に切断し、心臓を抽出する(図3D)。
14. 静脈内カテーテルから上昇大動脈を通る18Gカニューレと、30mLの氷冷、アイソトン生理食音溶液を1000 I.U.のヘパリンで補い、氷の上に生理食音溶液で満たされた15mLの心臓を入れる(図E-F)。

2. 心臓移植

注:レシピエントとして、10〜14週齢の雌または雄のラットが使用された。ドナーとレシピエントはほぼ体重が一致した。

1. イソフルラン吸入(5%で誘導し、1L/minの_O2流で1.5〜2%で維持)を用いてレシピエントラットの麻酔を行う。術周麻酔のための体重のkg当たりカルプロフェン5mgを皮下に注入し、つま先ピンチ離脱反射の欠如を確認する。
2. 目の潤滑剤を塗布し、腹部の毛皮を取り除き、手足を固定し、ドナーの準備に類似して皮膚を殺菌する。最適な術後の結果を得るために、加熱マット上で手術を行い、術中低体温症を防止します。
3. 皮膚の縦切開後、腹筋膜にリドカイン(0.2%)などの局所麻酔薬を塗布する。開腹手術の中央値で腹腔を開き、リトラクタを挿入します。
4. 腸をレシピエントの左上側に動員し、湿潤した湿潤で入れる。
5. 十二指腸と近位性の全角を動員した後、5-7倍の拡大で手術顕微鏡(または虫眼鏡)を用いて、綿棒で鈍い調製により腹部大動脈と下の大静脈を露出させる。腹部の血管を分離しないでください。
6. 腰部静脈を傷つけずに2つのマイクロ針ホルダーを使用して腹部を高め、クーリー血管クランプを配置します(図4A)。
7. 30~45°アーチ型27Gカニューレで腹部を穿刺する(図4B)。
8. ポッツはさみを使用して穿刺部位を拡大し、ドナー容器の内腔の大きさに合った縦切開を作成し(図4C-D)、血栓を除去し術後血栓症を予防するためにレシピエント血管に生理液を浸透させます。
9. 移植片を座地に置き、ドナーの大動脈を受け得られた腹部大動脈に2つの簡単な中断されたステッチで固定する(8-0縦切開の頭蓋および尾角角におけるモノフィラメント非再配置可能縫合糸(図4E)。
10. 8-0で走る受け取り側の腹部大動脈を有するドナーの上昇大動脈を吻合するモノフィラメント縫合は2つのステップで:まず、移植片をレシピエント血管の右側に置き、吻合の前半を行う(図4E)。続いて、移植片をレシピエント血管の左側に置き、吻膜の後半を行う(図4F)。
11. ドナー肺動脈を大動脈吻病に類似した下静脈に固定する(8-0モノフィラメント非再ソーブル縫合糸)。血管の内反体側からの静脈吻合の前半を縫合する(図4G-H)。
12. 末梢塞栓症を防ぐために結び目を締める前に、生理的な人を直接洗い流してください。
13. 両方のアナストモーゼの周りに止血性ガーゼを置き、移植片の再灌流が始まるようにクーリー血管クランプを慎重に放出します。滅菌綿棒で軽い圧縮によってアナストモーゼに沿って出血を処理する。
    注:移植片は約60のsの後に叩き始めるはずです。
14. 方法のような蛇行で腸を交換してください。腸壊死や機械的閉塞を防ぐために、腸間膜基数のマル回転がないことを確認してください。
15. 連続した3-0ポリフィラメントの縫合線を使用して、腹筋/筋膜と皮膚を別々に閉じます。

3. 術後ケア

1. 術後鎮痛の場合、術後1日(POD)の体重1kg当たりカルプロフェン5mgの追加皮下注射をレシピエントに供給する。さらに, 3番目のPODまで飲料水の500 mLにメタミゾールの1 gを追加します。.
2. 第3PODで毎日腹部触診によって心臓移植機能のモニタリングを開始する。
   注:第3POD前に移植片が失敗した場合、免疫不全ではなく外科的障害を考慮する必要があります。しかし、これはもちろん、選択された株の組み合わせとそれぞれの免疫学的モデル(例えば、事前免疫後の超急性拒絶反応)に依存する。
3. 移植片拒絶反応後、麻酔筋の頭蓋の後腹膜リンパ節の排出のような組織を抽出し、脾臓、血液、胸腺および移植片をフローサイトメトリーまたは免疫組織化学を介して更なる免疫学的分析を行う。

4. 心の酵素消化と耳の心臓細胞の皮下注射

1. 異所性心臓移植に類似した心臓の排泄および灌流を行う(ステップ1参照)。
2. 無菌メスまたは滅菌ハサミを使用して心臓を3mm x 3mmブロックに細断し、0.5mg/mLコラゲナーゼを含む培地中で37°Cで30分間インキュベートします。
   注:特にFCSはコラゲラーゼ消化を阻害するので、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミンを含む培養培地を胎児子牛血清(FCS)なしで使用することが重要です。
3. 消化された組織を大きな毛穴のふるいに加えながら、培養培地を取り除き、ミンチを十分にミンチして重要な心臓筋細胞、主に死んだ単一心細胞および残りの血液細胞の懸濁液を得る。細胞懸濁液を滅菌等張生理的な生理液で2回洗浄します。
   注意:遠心分離設定:10分、200 x g、20°C
4. 40 μmのセルストレーナーを使用して懸濁液をフィルターし、5-10 mLの等張生理的生理液で細胞ストレーナーを洗い流して、重要な細胞コンゲリーを収集します。
5. 遠心分離後、5x10⁵細胞/mLの濃度で溶解した生理食音溶液中の心筋細胞を再中断し、細胞溶液を1mLシリンジに引き上げる。
6. 異所性心臓移植のために、レシピエントナルコシス(ステップ2を参照)について説明したプロトコルに類似した麻酔を行う。
7. 受信者を横向きの位置に置き、両面テープを使用して指で耳を固定します(図5A)。
8. 27 G カニューレs.c.近くから心臓筋細胞溶液の 20 μL (1x 10⁴細胞を含む) を、視覚キャピラリー血管の近くからレシピエントの耳に注入する (図 5B)。
9. 定義された観察期間の後(選択した株の組み合わせと拒絶反応の強さに応じて)、排液子宮頸部リンパ節を抽出し、フローサイトメトリーまたは共培養などのさらなる分析を行う(図5C)。
   注:さらに、細胞の浸潤を決定するために、ピナの組織学的分析を行うことができます。

結果

これまで、異なる免疫学的問題は、95%^{以上の生存率を持}つ500以上の移植によって作業群で検証されたモデルに基づいて対処されてきました^{13,18,,19,,20,,21,,22,,23, 24.,24}総?...

ディスカッション

ラットにおける異所性心移植の先に説明した方法は、主に1969年の大野とリンジーの記述に基^づく3.それ以来、このモデルの多様性を広げ、様々な種に幾つかの改変が導入されている。これらの変更のいくつかを組み合わせ、実験室で異所性心臓移植を行った30年以上の経験を紹介し、長いトレーニング期間や外科的背景を必要としない実行可能な外科的アプローチを作成し?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia device (including isoflurane vaporizer)	Summit Anesthesia Solutions	No Catalog Number available
Cannula (27 G)	BD Microlance	302200
Carprofen	Pfizer	Rimadyl 50 mg/mL
Cellstar Tubes (15 mL)	GreinerBioOne	188271
Cell strainer (40 µm)	BD Falcon	2271680
Collagenase Type CLSII	Biochrome	C2-22
Compresses 5x5 cm	Fuhrmann	31501
Compresses 7.5x7.5 cm	Fuhrmann	31505
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf	1032128
Dexpathenol (5 %)	Bayer	"Bepanthen"
DPBS BioWhittaker	Lonza	17-512F
Forceps	B. Braun	Aesculap BD557R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD313R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD35
Heating mat	Gaymar Industries	"T/Pump"
Hemostatic gauze	Ethicon	Tabotamp
Heparin-Natrium 25 000 I.E.	Ratiopharm	No Catalog Number available
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-pored sieve (stainless steel)	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
Lidocaine	Astra Zeneca	2 % Xylocain
Metamizol-Natrium	Ratiopharma	Novaminsulfon 500 mg/mL
Micro forceps	B. Braun	Aesculap BD3361
Micro needle holder	Codman, Johnson & Johnson Medical	Codmann 80-2003
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap BD336R
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap FD241R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FD101R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FM471R
Needle holder	B. Braun	Aesculap BM221R
Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x)	PAA	P11-010
Peripheral venous catheter (18 G)	B. Braun	4268334B
Peripheral venous catheter (22 G)	B. Braun	4268091B
Probe pointed scissors	B. Braun	Aesculap BC030R
Retractors	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
RPMI culture medium	Lonza	BE12-702F
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Baxter	No Catalog Number available
Scissors	B. Braun	Aesculap BC414
Surgical microscope	Carl-Zeiss	OPMI-MDM
Sutures (anastomoses)	Catgut	Mariderm 8-0 monofil
Sutures (ligature)	Resorba	Silk 5-0 polyfil
Sutures (skin, fascia)	Ethicon	Mersilene 3-0
Syringe (1 mL)	B. Braun	9166017V
Syringe (10 mL)	B. Braun	4606108V
Syringe (20 mL)	B. Braun	4606205V
Vascular clamp	B. Braun	Aesculap FB708R