Un modello immunologico per il trapianto di cellule cardiache e cardiache cardiache cardiache cardiache cardiache cardiache

Riepilogo

Descriviamo un modello di trapianto di cuore addominale eterotopico nei ratti, implicando modifiche delle strategie attuali, che portano a un approccio chirurgico semplificato. Inoltre, descriviamo un nuovo modello di rigetto mediante iniezione in-ear di cellule muscolari cardiache vitali, consentendo ulteriori analisi immunologiche dei trapianti nei ratti.

Abstract

Il trapianto di cuore eterotopico nei ratti è stato un modello comunemente usato per diversi studi immunologici per più di 50 anni. Dalla prima descrizione del 1964 sono state segnalate diverse modifiche. Dopo 30 anni di esecuzione trapianto di cuore eterotopico nei ratti, abbiamo sviluppato un approccio chirurgico semplificato, che può essere facilmente insegnato ed eseguito senza ulteriore formazione chirurgica o sfondo.

Dopo la dissezione dell'aorta ascendente e l'arteria polmonare e la legatura delle vene cavalleria e polmonare superiori e inferiori, il cuore del donatore viene raccolto e successivamente perfuso con soluzione salina ghiacciata integrata con eparina. Dopo aver bloccato e incitato i vasi addominali ricitati, l'aorta ascendente del donatore e l'arteria polmonare vengono anastomused all'aorta addominale ricevente e vena cava inferiore, rispettivamente, utilizzando suture di corsa continue.

A seconda delle diverse combinazioni donatore-ricevente, questo modello consente di analizzare il rifiuto acuto o cronico degli alloinnesti. Il significato immunologico di questo modello è ulteriormente rafforzato da un nuovo approccio di iniezione nell'orecchio di cellule muscolari cardiache vitali e dalla successiva analisi del tessuto linfatico cervicale drenante.

Introduzione

Il trapianto di cuore eterotopico è un modello sperimentale spesso usato per diverse indagini riguardanti la tolleranza ai trapianti, il rigetto degli alloinnesti acuti e cronici, la lesione da ischemia-reperfusione, la perfusione di macchine o il rimodellamento cardiaco. Tra gli altri vantaggi, la funzione di innesto può essere monitorata in modo non invasivo dalla palpazione e l'insufficienza dell'innesto non comporta una compromissione vitale del ricevente in contrasto con altri organi, come reni o fegati.

Nel 1964, Abbott et al. inizialmente descrisse il trapianto di cuore addominale eterotopico nei ratti¹. Più tardi, nel 1966, la tecnica end-to-side per le anastomosi è stata descritta da Tomita et al.². Le basi per il modello attualmente utilizzato sono state riportate da Ono e Lindsey nel 1969³. Nel corso degli ultimi decenni, sono state pubblicate diverse modifiche per creare diversi tipi di innesti cardiaci ventricolari lasciati scaricati, parzialmente caricati o caricati, tra cui il trapianto combinato di cuore eterotopico^4,5,6. Per le analisi immunologiche, un trapianto di innesto cardiaco caricato non in volume viene più comunemente eseguito. In questo caso, il flusso sanguigno entra retrogradamente nell'aorta ascendente del donatore e successivamente nelle arterie coronarie. Il drenaggio venoso si verifica lungo il seno coronarico nell'atrio destro e nel ventricolo (Figura 1A-B). Pertanto, il ventricolo sinistro è escluso dal flusso sanguigno, a parte le quantità marginali di sangue dalle vene tebesi. Questo lo rende anche un modello utile per studiare i meccanismi patofisiologici durante la terapia dispositivo di assistenza ventricolare sinistra⁷.

Il trapianto di cuore eterotopico è stato eseguito in varie specie tra cui topi, conigli, maiali ed è stato anche utilizzato come dispositivo di assistenza uni- o biventricolare in esseri umani^8,9,10,11. Il ratto rappresenta ancora un popolare animale sperimentale per i modelli di trapianto, soprattutto perché i tempi di sopravvivenza dell'innesto per diverse combinazioni di ceppo di ratto sono stati ben definiti in passato e un gran numero di reagenti immunologici sono accessibili^12,13. A differenza dei topi, i ratti sono più grandi rendendo la chirurgia e l'accesso al tessuto linfatico per analisi immunologiche più fattibile¹². Inoltre, l'introduzione di tecnologie di clonazione commerciale nei ratti negli ultimi anni porterà molto probabilmente ad un interesse ricorrente per i modelli sperimentali di ratto¹⁴.

In generale, gli innesti cardiaci eterotopici possono essere attaccati ai vasi riceventi eseguendo anastomosi cervicale o addominale. Tuttavia, alcuni studi suggeriscono che un anastomosi femorale facilita un migliore monitoraggio grazie a un migliore accesso per la palpazione manuale o l'ecocardiografia transfemorale e permette quindi un rilevamento più preciso del fallimento dell'innesto^15,16.

È stato dimostrato che non vi è alcuna differenza per quanto riguarda il tempo di funzionamento, il tasso di complicanza, il risultato e il tempo di sopravvivenza dell'innesto tra entrambe le tecniche di anastomosis¹⁷. Chiaramente, la disponibilità di un numero sufficiente di linfonodi drenanti deve essere menzionata come un beneficio dell'anastomosi cervicale; tuttavia, sono necessari periodi di formazione più lunghi. Al contrario, l'anastomosi addominale è meno complicata e altrettanto preziosa per le indagini immunologiche, soprattutto se combinata con i risultati di un nuovo metodo di iniezione in orecchio di cellule muscolari cardiache allogeniche e successiva linfadenectomia cervicale. Una combinazione di entrambi i modelli offre un ampio spettro di analisi immunologiche post-interventistiche.

Il seguente protocollo si riferisce al funzionamento in coppie di chirurghi al fine di ridurre il tempo di ischemia. Tuttavia, tutti gli esperimenti possono essere eseguiti da una singola persona. L'installazione di strumenti e materiali per l'espianto e l'impianto del cuore è esposta nella figura 2A-B.

Protocollo

Tutte le esperienze sugli animali sono state effettuate secondo le linee guida del comitato locale Ethics Animal Review Board delle autorità regionali per la protezione dei consumatori e la sicurezza alimentare della Bassa Sassonia (LAVES, Oldenburg, Germania) con le ID di approvazione 12/0768 e 17/2472.

1. Espianto e perfusione cardiaco

NOTA: Come donatori di innesto, sono stati utilizzati ratti maschi o femmine all'età di 7-22 settimane.

1. Anestesizzare il ratto donatore per inalazione isoflurane (induzione al 5% e manutenzione al 3% con un flusso O₂ di 1 L/min). Iniettare 5 mg di Carprofen sottocutaneamente per kg di peso corporeo per analgesia perioperatoria e verificare l'assenza del riflesso di ritiro del pizzico.
2. Applicare il lubrificante per gli occhi e rimuovere la pelliccia addominale e toracica utilizzando un clipper meccanico.
3. Mettere il donatore in posizione supina, fissare gli arti alla base del tavolo di funzionamento con elastici e sterilizzare la pelle con il 70% di etanolo o un'altra alternativa sufficiente.
4. Incise la pelle in direzione longitudinale e dopo l'applicazione dell'anestetico locale (ad esempio, lidocaine 0,2%) eseguire una laparotomia mediana utilizzando le forbici.
5. Inserire retrattili, mobilitare l'intestino a sinistra del donatore ed esporre la vena cava inferiore con tamponi di cotone sterilizzati.
6. Per l'anticoagulazione, iniettare 500 U.U. di eparina sciolti in 1 mL di soluzione salina isotonica ghiacciata per via endovenosa forando la vena cava inferiore. Fermare l'emorragia nel sito di puntura mediante compressione leggera con un tampone di cotone dopo la retrazione dell'ago (Figura 3A).
7. Incitare il diaframma ed eseguire la toracotomia laterale su entrambi i lati del donatore.
8. Pin la parete ventrale mobilitata del torace sul tavolo dell'operazione.
9. Rimuovere il pericardio e il nervo vagale con una preparazione smussata utilizzando due supporti micro-aghi.
10. Eseguire la transezione dei vasi addominali al fine di esanguinare il donatore e scaricare il cuore.
11. Inserire il ramo smussato di una sonda a forbici appuntite nel sinuspero pericardico trasversale e separare l'aorta ascendente e l'arteria polmonare il più possibile sotto la leggera trazione caudale del cuore con un impacco bagnato (Figura 3B).
12. Posizionare una singola legatura 5-0 intorno alla vena cava superiore e inferiore e alle vene polmonari e stringerla il più dorsale possibile (Figura 3C).
13. Sever il tessuto dorsale alla legatura ed estrarre il cuore (Figura 3D).
14. Perfuso il cuore espiantato con una cannula da 18 G da un catetere per via endovenosa attraverso l'aorta ascendente e l'arteria polmonare con 30 mL di ghiaccio freddo, soluzione salina isotona integrata con 1000 I.U. di eparina e posizionare il cuore in un tubo da 15 mL riempito con soluzione salina su ghiaccio (Figura 3E-F).

2. Impianto cardiaco

NOTA: Come destinatari, sono stati utilizzati ratti maschi o femmine di 10-14 settimane. I donatori e i destinatari hanno avuto un peso approssimativamente abbinato.

1. Eseguire l'anestesia del ratto ricevente utilizzando anche l'inalazione isoflurano (induzione al 5% e manutenzione all'1,5-2% con un flusso O₂ di 1 L/min). Iniettare 5 mg di Carprofen sottocutaneamente per kg di peso corporeo per analgesia perioperatoria e verificare l'assenza del riflesso di ritiro del pizzico.
2. Applicare il lubrificante per gli occhi, rimuovere la pelliccia addominale, fissare gli arti e sterilizzare la pelle analogamente alla preparazione del donatore. Per un risultato postoperatorio ottimale, eseguire l'operazione su un tappetino riscaldante per prevenire l'ipotermia intraoperatoria.
3. Dopo l'incisione longitudinale della pelle, applicare un anestetico locale, come la lidocaina (0,2%), sulla fascia addominale. Aprire la cavità addominale per laparotomia mediana e inserire retrattori.
4. Mobilitare l'intestino sul lato superiore sinistro del destinatario e metterlo in un impacco caldo e bagnato.
5. Dopo aver mobilitato il duodenum e il jejunum prossimale, rispettivamente, utilizzando il microscopio chirurgico (o occhiali di ingrandimento) con un ingrandimento 5-7x, esporre l'aorta addominale e la vena cava inferiore per la preparazione smussata con tamponi di cotone. Non separare i vasi addominali.
6. Sollevare i vasi addominali utilizzando due micro supporti ad ago senza ferire le vene lombari e posizionare il morsetto vascolare Cooley (Figura 4A).
7. Forare i vasi addominali con una cannula ad arco di 27 G(Figura 4B)30-45 gradi ad arco.
8. Allargare il sito di puntura utilizzando le forbici Potts per creare un'incisione longitudinale che corrisponda alle dimensioni del lume dei vasi donatori(Figura 4C-D) e perfondere i vasi destinatari con soluzione salina per rimuovere i coaguli e prevenire la trombosi postoperatoria.
9. Mettere l'innesto nel situs e fissare l'aorta ascendente del donatore all'aorta addominale ricevente con due semplici punti interrotti (8-0 sutura non riassorbibile) all'angolo cranico e caudale dell'incisione longitudinale (Figura 4E).
10. Anastomose l'aorta ascendente del donatore con l'aorta addominale del ricevente da un 8-0 in esecuzione sutura monofilamento in due fasi: in primo luogo, posizionare l'innesto a destra dei recipienti ed eseguire la prima metà dell'anastomosi (Figura 4E). Successivamente, posizionare l'innesto a sinistra dei recipienti ed eseguire la seconda metà dell'anastomosi (Figura 4F).
11. Fissare l'arteria polmonare del donatore alla vena cava inferiore analogamente all'anastomosi aortale (8-0 sutura non riassorbibile). Suturare la prima metà dell'anastomosi venosa dal lato intraluminale della nave (Figura 4G-H).
12. Sciacquare le anastomomes con la salina direttamente prima di stringere i nodi per prevenire l'embolia periferica.
13. Posizionare una garza emostatica intorno a entrambe le anastomosi e rilasciare con attenzione il morsetto vascolare Cooley in modo che la reperfusione dell'innesto possa iniziare. Gestire il sanguinamento lungo le anastomosi mediante compressione leggera con tamponi di cotone sterilizzato.
    NOTA: L'innesto dovrebbe iniziare a battere dopo circa 60 s.
14. Sostituire l'intestino in un meandro come la moda. Assicurarsi che non ci siano malrotazioni della radice mesenterica per prevenire la necrosi intestinale o l'ostruzione meccanica.
15. Chiudere i muscoli/fascia addominali e la pelle separatamente utilizzando suture continue 3-0 di corsa polifilamento.

3. Cura postoperatoria

1. Per l'analgesia postoperatoria, fornire ai destinatari un'iniezione sottocutanea aggiuntiva di 5 mg di Carprofen per kg di peso corporeo nel primo giorno postoperatorio (POD). Inoltre, aggiungere 1 g di Metamizol a 500 mL di acqua potabile fino al terzo POD.
2. Iniziare a monitorare la funzione di innesto cardiaco da palpazione addominale quotidiana sul terzo POD.
   NOTA: In caso di insufficienza di innesto prima del terzo POD, è necessario considerare un guasto chirurgico piuttosto che immunologico. Tuttavia, questo ovviamente dipende dalla combinazione di deformazione scelta e dal rispettivo modello immunologico (ad esempio, il rigetto iperacuto dopo l'immunizzazione precedente).
3. Dopo il rigetto del trapianto, estrarre tessuti come i linfonodi retroperitoneali drenanti cranici delle anastomosi, della milza, del sangue, del timo e dell'innesto per ulteriori analisi immunologiche tramite citometria di flusso o immunosofia.

4. digestione ezimatica del cuore e iniezione sottocutanea di cellule cardiache nell'orecchio

1. Eseguire l'espianto cardiaco e la perfusione in modo analogo al trapianto di cuore eterotopico (vedere il punto 1).
2. Tritare il cuore in blocchi da 3 mm x 3 mm utilizzando un bisturi sterile o forbici sterili e incubarlo per 30 min a 37 gradi centigradi in mezzo di coltura contenente 0,5 mg/mL di collagenasi.
   NOTA: È importante utilizzare un mezzo di coltura contenente penicillina, streptomicina e glutammina senza siero di vitello fetale (FCS) in particolare perché FCS inibisce la digestione del collagenase.
3. Aggiungere il tessuto digerito a un setaccio di grandi dimensioni, rimuovendo accuratamente il mezzo di coltura e il trito per ottenere una sospensione delle cellule muscolari cardiache vitali, per lo più cellule cardiache singole morte e cellule del sangue rimanenti. Lavare due volte la sospensione cellulare con una soluzione salina isotonica sterile.
   NOTA: Impostazioni di centrifugazione: 10 min, 200 x g, 20 .
4. Filtrare la sospensione utilizzando un colino cellulare da 40 m e raccogliere le connie cellulari vitali lavando il colino cellulare con 5-10 mL di soluzione salina isotonica.
5. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule cerebrali cardiache in soluzione salina disciolte ad una concentrazione di 5x10⁵ cellule/mL e disegnare la soluzione cellulare in una siringa da 1 mL.
6. Eseguire l'anestesia in modo analogo al protocollo descritto per la narcosi ricevente (vedere il punto 2) per il trapianto di cuore eterotopico.
7. Posizionare il destinatario in posizione laterale e fissare l'orecchio con un dito utilizzando nastro a doppio lato (Figura 5A).
8. Iniettare 20 -L della soluzione della cellula muscolare cardiaca (contenente 1 x 10⁴ cellule) tramite un cannula s.c. da 27 G vicino ai vasi capillari visivi nell'orecchio del ricevente (Figura 5B).
9. Dopo un periodo di osservazione definito (a seconda della combinazione di deformazione scelta e della forza di rifiuto), estrarre i linfonodi cervicali drenanti ed eseguire ulteriori analisi come citometria di flusso o co-culture (Figura 5C).
   NOTA: Inoltre, l'analisi istologica della pinna può essere eseguita per determinare l'infiltrazione cellulare.

Risultati

In passato, diverse questioni immunologiche sono state affrontate sulla base del modello, che è stato convalidato nel gruppo di lavoro da più di 500 trapianti con un tasso di sopravvivenza superiore al 95%^13,18,19,20,21^,22,2323,...

Discussione

Il metodo precedentemente descritto per il trapianto cardiaco eterotopico nei ratti si basa principalmente sulla descrizione di Ono e Lindsey nel 1969³. Da allora, sono state introdotte diverse modifiche in varie specie che hanno portato ad un'ampia varietà di questo modello. Combinando molte di queste modifiche e introducendo la nostra esperienza derivante da oltre 30 anni di esecuzione di trapianti di cuore eterotopici in laboratorio, abbiamo creato un approccio chirurgico fattibile, che non ri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia device (including isoflurane vaporizer)	Summit Anesthesia Solutions	No Catalog Number available
Cannula (27 G)	BD Microlance	302200
Carprofen	Pfizer	Rimadyl 50 mg/mL
Cellstar Tubes (15 mL)	GreinerBioOne	188271
Cell strainer (40 µm)	BD Falcon	2271680
Collagenase Type CLSII	Biochrome	C2-22
Compresses 5x5 cm	Fuhrmann	31501
Compresses 7.5x7.5 cm	Fuhrmann	31505
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf	1032128
Dexpathenol (5 %)	Bayer	"Bepanthen"
DPBS BioWhittaker	Lonza	17-512F
Forceps	B. Braun	Aesculap BD557R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD313R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD35
Heating mat	Gaymar Industries	"T/Pump"
Hemostatic gauze	Ethicon	Tabotamp
Heparin-Natrium 25 000 I.E.	Ratiopharm	No Catalog Number available
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-pored sieve (stainless steel)	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
Lidocaine	Astra Zeneca	2 % Xylocain
Metamizol-Natrium	Ratiopharma	Novaminsulfon 500 mg/mL
Micro forceps	B. Braun	Aesculap BD3361
Micro needle holder	Codman, Johnson & Johnson Medical	Codmann 80-2003
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap BD336R
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap FD241R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FD101R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FM471R
Needle holder	B. Braun	Aesculap BM221R
Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x)	PAA	P11-010
Peripheral venous catheter (18 G)	B. Braun	4268334B
Peripheral venous catheter (22 G)	B. Braun	4268091B
Probe pointed scissors	B. Braun	Aesculap BC030R
Retractors	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
RPMI culture medium	Lonza	BE12-702F
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Baxter	No Catalog Number available
Scissors	B. Braun	Aesculap BC414
Surgical microscope	Carl-Zeiss	OPMI-MDM
Sutures (anastomoses)	Catgut	Mariderm 8-0 monofil
Sutures (ligature)	Resorba	Silk 5-0 polyfil
Sutures (skin, fascia)	Ethicon	Mersilene 3-0
Syringe (1 mL)	B. Braun	9166017V
Syringe (10 mL)	B. Braun	4606108V
Syringe (20 mL)	B. Braun	4606205V
Vascular clamp	B. Braun	Aesculap FB708R