Иммунологическая модель для гетеротопической трансплантации сердца и сердечной мышечной клетки у крыс

Резюме

Мы описываем модель гетеротопической трансплантации брюшного сердца у крыс, подразумевающую модификации современных стратегий, которые приводят к упрощению хирургического подхода. Кроме того, мы описываем новую модель отторжения путем инъекций в ухо жизненно важных клеток сердечной мышцы, что позволяет дальнейшей трансплантации иммунологических анализов у крыс.

Аннотация

Гетеротопная трансплантация сердца у крыс является широко используемой моделью для различных иммунологических исследований на протяжении более 50 лет. С момента первого описания в 1964 году было сообщено о нескольких изменениях. После 30 лет проведения гетеротопной трансплантации сердца у крыс, мы разработали упрощенный хирургический подход, который можно легко преподавать и выполнять без дальнейшей хирургической подготовки или фона.

После вскрытия восходящей аорты и легочной артерии и перевязки верхних и нижних кавалерийских и легочных вен донорское сердце собирается и впоследствии проникает ледяным сольственным раствором, дополненным гепарином. После зажима и нарезки брюшных сосудов реципиента, восходящая аорта и легочная артерия анастомозируются реципиенту брюшной аорты и нижней полой вены, соответственно, используя непрерывные ходовые швы.

В зависимости от различных комбинаций доноров-реципиентов, эта модель позволяет анализировать острый или хронический отказ аллотрансплантатов. Иммунологическое значение этой модели еще больше усиливается новым подходом инъекций в ухо жизненно важных клеток сердечной мышцы и последующим анализом дренажной лимфатической ткани шейки матки.

Введение

Гетеротопическая трансплантация сердца является часто используемой экспериментальной моделью для различных исследований, касающихся толерантности к трансплантации, острого и хронического отторжения аллотрансплантата, травмы ишемии-реперфузии, машинной перфузии или ремоделирования сердца. Среди других преимуществ, функция трансплантата может контролироваться неинвазивно пальпации и трансплантата отказ не приводит к жизненному нарушению получателя в отличие от других органов, таких как почки или печень.

В 1964 году Abbott et al. первоначально описали гетеротопическую трансплантацию брюшного сердца у крыс¹. Позже, в 1966 году, сквозная техника для анастомос была описана Tomita et al.². Основы для используемой в настоящее время модели были сообщены Ono и Lindsey в 1969³. В течение последних десятилетий, несколько изменений были опубликованы для создания различных типов выгруженных, частично загруженных или загруженных левожелудочковых сердечных трансплантатов, включая комбинированные гетеротопические трансплантации сердца и легких^4,5,6. Для иммунологического анализа чаще всего проводится необъемная трансплантация интафтрансплантатий сердца. В этом случае кровоток ретроградно поступает в восходящую аорту донора, а затем и на коронарные артерии. Венозный дренаж происходит вдоль коронарной синусовой синуса в правое предсердие и желудочек(рисунок 1A-B). Таким образом, левый желудочек исключается из кровотока, кроме незначительного количества крови из тебесианских вен. Это также делает его полезной моделью для изучения патофизиологических механизмов во время левого желудочковой терапии вспомогательного устройства^7.

Гетеротопическая трансплантация сердца была выполнена в различных видах, включая мышей, кроликов, свиней и даже был использован в качестве одно- или бивентрикулярного устройства помощи у людей^8,9,10,11. Крыса по-прежнему представляет собой популярное экспериментальное животное для трансплантации моделей, тем более, что трансплантат выживаемости для различных комбинаций штамма крыс были четко определены в прошлом и большое количество иммунологических реагентов доступны^12,13. В отличие от мышей, крысы больше сделать хирургии и доступ к лимфатической ткани для иммунологического анализа более осуществимым¹². Кроме того, внедрение коммерческих технологий клонирования у крыс в последние годы, скорее всего, приведет к повторяющейся заинтересованности в экспериментальных крысных моделях^14.

В целом, гетеротопные сердечные трансплантаты могут быть прикреплены к сосудам-получателю либо путем выполнения шейного или брюшного анастомоза. Тем не менее, несколько исследований показывают, что бедренный анастомоз облегчает улучшение мониторинга за счет лучшего доступа для ручной пальпации или трансфеморальной эхокардиографии и, таким образом, позволяет более точное обнаружение трансплантата отказа^15,16.

Было показано, что нет никакой разницы в отношении времени операции, частота осложнений, результат и время выживания трансплантата между обеими методами анастомоз¹⁷. Очевидно, что наличие достаточного количества дренажных лимфатических узлов должно быть упомянуто в качестве преимущества анастомоза шейки матки; однако требуется более длительные периоды обучения. В отличие от этого, анастомоз брюшной полости менее сложен и одинаково ценен для иммунологических исследований, особенно в сочетании с результатами нового метода инъекции в ухо аллогенных клеток сердечной мышцы и последующей лимфаденэктомии шейки матки. Сочетание обеих моделей предлагает широкий спектр постинтервенционных иммунологических анализов.

Следующий протокол относится к операции в парах хирургов, с тем чтобы уменьшить время ишемии. Тем не менее, все эксперименты могут быть выполнены одним человеком. Настройка инструментов и материалов для выделения сердца и имплантации отображается на рисунке 2A-B.

протокол

Все опыты животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами местного Совета по этике животных обзор региональных властей по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов Нижней Саксонии (LAVES, Ольденбург, Германия) с утверждением iDs 12/0768 и 17/2472.

1. Эмплантация сердца и перфузия

ПРИМЕЧАНИЕ: Как доноры трансплантата, женщины или самцы крыс в возрасте 7-22 недель были использованы.

1. Анестезия донорской крысы путем вдыхания изофлуран (индукция на 5% и обслуживание на 3% с потоком O₂ 1 л/мин). Вводят 5 мг карпрофена подкожно на кг массы тела при периоперационной обезболивании и проверяйте отсутствие упорный рефлекс вывода.
2. Нанесите глазную смазку и удалите брюшной и грудной мех с помощью механического клипера.
3. Поместите донора в положение на спине, зафиксировать конечности у основания оперативного стола эластичными полосами и стерилизовать кожу 70% этанолом или другой достаточной альтернативой.
4. Инцежизг кожи в продольном направлении и после применения местной анестезии (например, лидокаин 0,2%) выполнить среднюю лапаротомию с помощью ножниц.
5. Вставьте втягивающие, мобилизуем кишечник влево от донора и разоблачите нижнюю полу вены стерилизованные ватные тампоны.
6. Для антикоагуляции вводят 500 М.У. гепарина, растворенного в 1 мл ледяного изотонического соливого раствора внутривенно путем прокола нижней вены. Остановить кровотечение в месте прокола легким сжатием с ватным тампоном после опрокидки иглы(рисунок 3A).
7. Нарезка диафрагмы и выполнять боковую торакотомию с обеих сторон донора.
8. Прикрепите мобилизованную вентральную стенку грудной клетки к оперативному столу.
9. Удалите перикард и нерва, тупой подготовки с помощью двух микро-иглы держателей.
10. Выполните трансрежур створ брюшной полости для того, чтобы выманить донора и разгрузить сердце.
11. Вставьте тупую ветвь зонда, направленную ножницами в трансерс перикардиальной синусик, и разделите восходящую аорту и легочную артерию как можно более дистальную под световой каудальной тягой сердца с мокрым компрессом(рисунок 3B).
12. Поместите один 5-0 лигатуры вокруг начальника и нижней полына и легочных вен и затянуть его как дорсальный насколько это возможно (Рисунок 3C).
13. Разорвать ткани в дорсаль к лигатуре и извлечь сердце(Рисунок 3D).
14. Perfuse explanted сердце с 18 G канюли из внутривенного катетера через восходящую аорту и легочной артерии с 30 мл ледяного льда, изотон солей раствор дополняется 1000 I.U. гепарина и поместить сердце в 15 мл трубки заполнены солистиного раствора на льду (Рисунок 3E-F).

2. Имплантация сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве получателей, 10-14 недель женщины или самцы крыс ы были использованы. Доноры и реципиенты были примерно взвешены.

1. Выполните анестезию крысы-реципиента, также используя изофлуранинга (индукция на 5% и обслуживание на 1,5-2% с O₂ потока 1 л / мин). Вводят 5 мг карпрофена подкожно на кг массы тела при периоперационной обезболивании и проверяйте отсутствие упорный рефлекс вывода.
2. Нанесите глазную смазку, удалите мех живота, зафиксируйте конечности и стерилизуйте кожу аналогично донорской подготовке. Для оптимального послеоперационного результата выполняйте операцию на нагревательном коврике для предотвращения внутриоперационного переохлаждения.
3. После продольного разреза кожи нанесите местную анестезию, например лидокаин (0,2%), на брюшную фасцию. Откройте брюшную полость средней лапаротомией и вставьте вставки вставлений.
4. Мобилизуйте кишечник на левую верхнюю сторону получателя и поместите его в теплый, смачиваемый компресс.
5. После мобилизации двенадцатиперстной кишки и проксимальной геджуны, соответственно, используя хирургический микроскоп (или увеличительные очки) с 5-7-кратным увеличением, разоблачить брюшную аорту и нижнюю полу вены тупой подготовкой с ватными тампонами. Не отделяйте брюшные сосуды.
6. Поднимите брюшной сосуды с помощью двух микро держателей иглы, не повреждая поясничные вены и положение Кули сосудистого зажима(рисунок 4A).
7. Проколбрюгии брюшные сосуды с 30-45 "арочные 27 G канюли (Рисунок 4B).
8. Увеличайте место прокола с помощью ножниц Potts для создания продольного разреза, который соответствует размеру просвета сосудов-доноров(рисунок 4C-D) и наполнить сосуды-получатели сосудами с сольным раствором для того, чтобы удалить сгустки и предотвратить послеоперационный тромбоз.
9. Поместите трансплантат в situs и зафиксировать донора восходящей аорты к получателю брюшной аорты двумя простыми прерванными стежками (8-0 монофилат, не отрессорбируемый шов) в черепном и каудальном углу продольного разреза(рисунок 4E).
10. Анастомоз восходящей аорты донора с брюшной аортой реципиента бегом 8-0 монофиломент шов в два этапа: во-первых, место трансплантата справа от сосудов получателя и выполнить первую половину анастомоза(рисунок 4E). Затем поместите трансплантат слева от сосудов-получателей и выполните вторую половину анастомоза(рисунок 4F).
11. Зафиксировать донорскую легочную артерию на нижнюю полу вены по аналогии с аортальным анастомозом (8-0 монофиментата, неотносимое шов). Шов первой половины венозного анастомоза с внутрилюминной стороны судна(рисунок 4G-H).
12. Промыть анастомозы с сольнием непосредственно перед затягиванием узлов, чтобы предотвратить периферической эмболии.
13. Поместите гемостатической марли вокруг обоих анастомоза и тщательно отпустите сосудистический зажим Кули, чтобы реперфузия трансплантата может начаться. Обработка кровотечения вдоль анастомоза путем легкого сжатия со стерилизованные ватные тампоны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: трансплантат должен начать избиение примерно через 60 с.
14. Замените кишечник меандром, как мода. Убедитесь, что Есть нет malrotations мезентерического радика для предотвращения кишечного некроза или механической обструкции.
15. Закройте мышцы живота/ фасции и кожи отдельно с помощью непрерывного 3-0 полифилата работает швы.

3. Послеоперационный уход

1. Для послеоперационной обезболивания, поставить получателей с дополнительной подкожной инъекции 5 мг карпрофена на кг веса тела в первый послеоперационный день (POD). Кроме того, добавьте 1 г метамизола к 500 мл питьевой воды до третьего POD.
2. Начните мониторинг функции пересадки сердца путем ежедневного пальпации брюшной полости на третьем POD.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае отказа трансплантата до третьего POD, хирургическая, а не иммунологическая недостаточность должна быть рассмотрена. Однако это, конечно, зависит от выбранной комбинации штамма и соответствующей иммунологической модели (например, гиперострый отторжение после предварительной иммунизации).
3. После отторжения трансплантата, экстракт тканей, как слив ретроперитонеальных лимфатических узлов черепа анастомозов, селезенки, крови, тимуса и трансплантата для дальнейшего иммунологического анализа с помощью потока цитометрии или иммуногистохимии.

4. Ферментативное пищеварение сердца и подкожная инъекция клеток сердца в ухе

1. Выполните эндплантацию сердца и перфузию по аналогии с гетеротопной трансплантацией сердца (см. шаг 1).
2. Измельчите сердце в 3 мм х 3 мм блоков с помощью стерильных скальпеля или стерильных ножниц и инкубировать его в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию в культуре среды, содержащей 0,5 мг / мл коллагеназа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать культурную среду, содержащую пенициллин, стрептомицин и глутамин без сыворотки плода теленка (FCS), особенно как FCS подавляет пищеварение коллагеназы.
3. Добавьте переваренную ткань в крупнопокорное сито, удалив культурную среду и фарш тщательно, чтобы получить приостановку жизненно важных клеток сердечной мышцы, в основном мертвых одиночных клеток сердца и оставшихся кровяных клеток. Дважды вымойте клеточную подвеску стерильным изотоническим сольникным раствором.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки центрифугирования: 10 мин, 200 х г, 20 градусов по Цельсию
4. Фильтр подвески с помощью 40 мкм ячейки ситечко и собирать жизненно важные клетки congeries путем промывки ячейки ситечко с 5-10 мл изотонического сочного раствора.
5. После центрифугации, повторно приостановить клетки сердечной мышцы в солевой раствор растворенный в концентрации 5x10⁵ клеток /мл и обратить раствор клетки в шприц 1 мл.
6. Выполните анестезию по аналогии с протоколом, описанным для реципиента наркоза (см. шаг 2) для гетеротопической трансплантации сердца.
7. Поместите получателя в боковое положение и зафиксировать ухо пальцем с помощью двусторонней ленты(рисунок 5А).
8. Впрысните 20 кл. раствора сердечной мышцы (содержащий 1 х 10⁴ клетки) через 27 G cannula s.c. близко к зрительным сосудам капилляра в ухо получателя(рисунок 5B).
9. После определенного периода наблюдения (в зависимости от выбранной комбинации штамма и силы отторжения), извлекайте дренажные лимфатические узлы шейки матки и выполняйте дальнейшие анализы, такие как цитометрия потока или сокультуры(рисунок 5C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, гистологический анализ пинна может быть выполнен для определения проникновения клеток.

Результаты

В прошлом на основе модели рассматривались различные иммунологические вопросы, которые были проверены в рабочей группе более чем 500 трансплантациями с выживаемостью более 95%^{13,,18,,19,,20,,}

Обсуждение

Ранее описанный метод гетеротопной сердечной трансплантации у крыс в основном основан на описании Оно и Линдси в 1969³. С тех пор было введено несколько модификаций в различных видах, что привело к широкому разнообразию этой модели. Объединяя некоторые из этих модификаций и ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia device (including isoflurane vaporizer)	Summit Anesthesia Solutions	No Catalog Number available
Cannula (27 G)	BD Microlance	302200
Carprofen	Pfizer	Rimadyl 50 mg/mL
Cellstar Tubes (15 mL)	GreinerBioOne	188271
Cell strainer (40 µm)	BD Falcon	2271680
Collagenase Type CLSII	Biochrome	C2-22
Compresses 5x5 cm	Fuhrmann	31501
Compresses 7.5x7.5 cm	Fuhrmann	31505
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf	1032128
Dexpathenol (5 %)	Bayer	"Bepanthen"
DPBS BioWhittaker	Lonza	17-512F
Forceps	B. Braun	Aesculap BD557R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD313R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD35
Heating mat	Gaymar Industries	"T/Pump"
Hemostatic gauze	Ethicon	Tabotamp
Heparin-Natrium 25 000 I.E.	Ratiopharm	No Catalog Number available
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-pored sieve (stainless steel)	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
Lidocaine	Astra Zeneca	2 % Xylocain
Metamizol-Natrium	Ratiopharma	Novaminsulfon 500 mg/mL
Micro forceps	B. Braun	Aesculap BD3361
Micro needle holder	Codman, Johnson & Johnson Medical	Codmann 80-2003
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap BD336R
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap FD241R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FD101R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FM471R
Needle holder	B. Braun	Aesculap BM221R
Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x)	PAA	P11-010
Peripheral venous catheter (18 G)	B. Braun	4268334B
Peripheral venous catheter (22 G)	B. Braun	4268091B
Probe pointed scissors	B. Braun	Aesculap BC030R
Retractors	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
RPMI culture medium	Lonza	BE12-702F
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Baxter	No Catalog Number available
Scissors	B. Braun	Aesculap BC414
Surgical microscope	Carl-Zeiss	OPMI-MDM
Sutures (anastomoses)	Catgut	Mariderm 8-0 monofil
Sutures (ligature)	Resorba	Silk 5-0 polyfil
Sutures (skin, fascia)	Ethicon	Mersilene 3-0
Syringe (1 mL)	B. Braun	9166017V
Syringe (10 mL)	B. Braun	4606108V
Syringe (20 mL)	B. Braun	4606205V
Vascular clamp	B. Braun	Aesculap FB708R