Um modelo imunológico para transplante heterotópico de células cardíacas e cardíacas em ratos

Resumo

Descrevemos um modelo de transplante de coração abdominal heterotópico em ratos, implicando modificações nas estratégias atuais, que levam a uma abordagem cirúrgica simplificada. Além disso, descrevemos um novo modelo de rejeição pela injeção in-ear de células musculares cardíacas vitais, permitindo novas análises imunológicas de transplante em ratos.

Resumo

O transplante de coração heterotópico em ratos tem sido um modelo comumente utilizado para diversos estudos imunológicos há mais de 50 anos. Várias modificações foram relatadas desde a primeira descrição em 1964. Após 30 anos realizando transplante de coração heterotópico em ratos, desenvolvemos uma abordagem cirúrgica simplificada, que pode ser facilmente ensinada e realizada sem maior treinamento cirúrgico ou antecedentes.

Após a dissecção da aorta ascendente e da artéria pulmonar e da ligadura de veias superiores e inferiores caval e pulmonar, o coração do doador é colhido e posteriormente perfundido com solução salina gelada suplementada com heparina. Após a fixação e incisamento dos vasos abdominais receptores, o doador ascendente de aorta e artéria pulmonar são anastomosados para a aorta abdominal receptora e veia cava inferior, respectivamente, usando suturas contínuas de corrida.

Dependendo de diferentes combinações doador-receptor, este modelo permite análises de rejeição aguda ou crônica de aloenxertos. O significado imunológico deste modelo é ainda mais aprimorado por uma nova abordagem da injeção intra-auricular de células musculares cardíacas vitais e posterior análise do tecido linfático cervical drenante.

Introdução

O transplante de coração heterotópico é um modelo experimental frequentemente utilizado para diferentes investigações sobre tolerância ao transplante, rejeição aguda e crônica de aloenxerto, lesão isquemia-reperfusão, perfusão de máquinas ou remodelagem cardíaca. Entre outras vantagens, a função do enxerto pode ser monitorada de forma não invasiva por palpação e a falha do enxerto não leva a um prejuízo vital do receptor em contraste com outros órgãos, como rins ou fígados.

Em 1964, Abbott et al. descreveram inicialmente transplante de coração abdominal heterotópico em ratos¹. Mais tarde, em 1966, a técnica de ponta a ponta para anastomoses foi descrita por Tomita et al.². As bases para o modelo atualmente usado foram relatadas por Ono e Lindsey em 1969³. Durante as últimas décadas, várias modificações foram publicadas para criar diferentes tipos de enxertos cardíacos ventriculares esquerdos descarregados, parcialmente carregados ou carregados, incluindo transplante heterotópico heterotópico coração-pulmão^4,5,6. Para análises imunológicas, é mais comumente realizado um transplante de enxerto cardíaco carregado sem volume. Neste caso, o fluxo sanguíneo entra retrógradamente na aorta ascendente do doador e, posteriormente, nas artérias coronárias. A drenagem venosa ocorre ao longo do seio coronário no átrio direito e ventrículo(Figura 1A-B). Portanto, o ventrículo esquerdo está excluído do fluxo sanguíneo, além de quantidades marginais de sangue das veias tesésias. Isso também o torna um modelo útil para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos durante a terapia do dispositivo de assistência ventricular esquerda⁷.

O transplante de coração heterotópico tem sido realizado em várias espécies, incluindo camundongos, coelhos, porcos e tem sido até usado como um dispositivo de assistência uniou ou biventricular em humanos^8,,9,,10,11. O rato ainda representa um animal experimental popular para modelos de transplante, especialmente porque os tempos de sobrevivência do enxerto para diferentes combinações de cepas de ratos foram bem definidos no passado e um grande número de reagentes imunológicos são acessíveis^12,13. Ao contrário dos camundongos, os ratos são maiores fazendo cirurgia e acesso ao tecido linfático para análises imunológicas mais viável¹². Além disso, a introdução de tecnologias comerciais de clonagem em ratos nos últimos anos provavelmente levará a um interesse recorrente em modelos experimentais de ratos¹⁴.

Em geral, enxertos cardíacos heterotópicos podem ser anexados aos vasos receptores, seja realizando anastomose cervical ou abdominal. No entanto, alguns estudos sugerem que uma anastomose femoral facilita o melhor monitoramento devido ao melhor acesso à palpação manual ou ecocardiografia transfemoral e, portanto, permite uma detecção mais precisa da falha do enxerto^15,16.

Mostrou-se que não há diferença quanto ao tempo de operação, taxa de complicações, desfecho e tempo de sobrevivência do enxerto entre ambas as técnicas de anastomose¹⁷. Claramente, a disponibilidade de um número suficiente de linfonodos drenantes deve ser mencionada como um benefício da anastomose cervical; no entanto, períodos de treinamento mais longos são necessários. Em contraste, a anastomose abdominal é menos complicada e igualmente valiosa para investigações imunológicas, especialmente quando combinada com resultados de um novo método de injeção intra-auricular de células musculares cardíacas alogênicas e linfadenectomia cervical subseqüente. Uma combinação de ambos os modelos oferece um amplo espectro de análises imunológicas pós-intervencionistas.

O protocolo a seguir refere-se à operação em pares de cirurgiões, a fim de reduzir o tempo de isquemia. No entanto, todos os experimentos podem ser realizados por uma única pessoa. A configuração de instrumentos e materiais para explantação e implantação de coração é exibida na Figura 2A-B.

Protocolo

Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com as diretrizes do Conselho de Ética Animal das autoridades regionais de defesa do consumidor e segurança alimentar da Baixa Saxônia (LAVES, Oldenburg, Alemanha) com as ids de aprovação 12/0768 e 17/2472.

1. Explantação e perfusão cardíaca

NOTA: Como doadores de enxerto, foram utilizados ratos do sexo feminino ou masculino com idade de 7 a 22 semanas.

1. Anestesie o rato doador por inalação de isoflurano (indução a 5% e manutenção a 3% com fluxo De₂ de 1 L/min). Injete 5 mg de Carprofen subcutâneamente por kg de peso corporal para analgesia perioperatória e verifique a ausência do reflexo de abstinência do dedo do pé.
2. Aplique lubrificante ocular e remova a pele abdominal e torácica usando um cortador mecânico.
3. Coloque o doador em posição supina, fixar os membros na base da mesa de operação com faixas elásticas e esterilizar a pele com 70% de etanol ou outra alternativa suficiente.
4. Incise a pele na direção longitudinal e após a aplicação do anestésico local (por exemplo, lidocaína 0,2%) realizar uma laparotomia mediana usando uma tesoura.
5. Insira retráteis, mobilize o intestino à esquerda do doador e exponha a veia cava inferior com cotonetes esterilizados.
6. Para anticoagulação, injete 500 U.I. de heparina dissolvida em 1 mL de solução salina isotônica gelada por via intravenosa, perfurando a veia cava inferior. Pare o sangramento no local da punção por compressão de luz com um cotonete após a retração da agulha(Figura 3A).
7. Incisa o diafragma e realiza toracotomia lateral em ambos os lados do doador.
8. Fixar a parede ventral mobilizada do tórax na mesa de operação.
9. Remova o pericárdio e o nervo vagal por preparação contundente usando dois suportes de microagulhas.
10. Realizar transsecção de vasos abdominais a fim de exanguiar o doador e descarregar o coração.
11. Insira o ramo contundente de uma sonda que apontou a tesoura no seio pericárdico transversivo e separe a aorta ascendente e a artéria pulmonar o mais distal possível sob leve tração caudal do coração com uma compressa molhada(Figura 3B).
12. Coloque uma única ligadura 5-0 em torno da veia cava superior e inferior e das veias pulmonares e aperte-a o mais dorsal possível (Figura 3C).
13. Respedao do tecido dorsal à ligadura e extraia o coração(Figura 3D).
14. Perfundir o coração explantado com uma cânula de 18 G de um cateter intravenoso através da aorta ascendente e da artéria pulmonar com 30 mL de solução salina de isotona gelada suplementada com 1000 U.I. de heparina e colocar o coração em um tubo de 15 mL cheio de solução salina no gelo(Figura 3E-F).

2. Implantação cardíaca

NOTA: Como destinatários, foram utilizados ratos fêmeas ou machos de 10 a 14 semanas. Doadores e receptores foram aproximadamente compatíveis com o peso.

1. Realize a anestesia do rato receptor usando também inalação de isoflurano (indução a 5% e manutenção a 1,5-2% com fluxo De₂ de 1 L/min). Injete 5 mg de Carprofen subcutâneamente por kg de peso corporal para analgesia perioperatória e verifique a ausência do reflexo de abstinência do dedo do pé.
2. Aplique lubrificante ocular, remova a pele abdominal, fixe os membros e esterilize a pele de forma análoga à preparação do doador. Para o desfecho pós-operatório ideal, realize a operação em um ata de aquecimento para evitar hipotermia intraoperatória.
3. Após a incisão longitudinal da pele, aplique um anestésico local, como lidocaína (0,2%), na fáscia abdominal. Abra a cavidade abdominal por laparotomia mediana e insira retráteis.
4. Mobilize o intestino para o lado superior esquerdo do receptor e coloque-o em uma compressa quente e úmida.
5. Após a mobilização do duodeno e do jejunpromal, respectivamente, utilizando o microscópio cirúrgico (ou óculos de ampliação) com uma ampliação de 5-7x, exponha a aorta abdominal e a veia cava inferior por preparação contundente com cotonetes. Não separe os vasos abdominais.
6. Eleve os vasos abdominais usando dois micro porta-agulhas sem ferir as veias lombares e posicione o grampo vascular Cooley(Figura 4A).
7. Perfure os vasos abdominais com uma cânula arqueada de 30-45° 27 G(Figura 4B).
8. Amplie o local da punção usando uma tesoura potts para criar uma incisão longitudinal que corresponda ao tamanho do lúmen dos vasos doadores (Figura 4C-D) e perfundir os vasos receptores com solução salina, a fim de remover coágulos e prevenir trombose pós-operatória.
9. Coloque o enxerto no situs e fixar a aorta ascendente do doador à aorta abdominal receptora por dois pontos simples interrompidos (8-0 sutura não ressorável de monofilamento) no canto cranial e caudal da incisão longitudinal(Figura 4E).
10. Anastomose a aorta ascendente do doador com a aorta abdominal do receptor por um 8-0 correndo sutura de monofilamento em duas etapas: primeiro, coloque o enxerto à direita dos vasos receptores e realize a primeira metade da anastomose(Figura 4E). Posteriormente, coloque o enxerto à esquerda dos vasos receptores e realize a segunda metade da anastomose (Figura 4F).
11. Fixar a artéria pulmonar doadora à veia cava inferior análogaà à anastomose aortal (8-0 sutura não ressorável de monofilamento). Sutura a primeira metade da anastomose venosa do lado intraluminal do vaso(Figura 4G-H).
12. Lave as anastomas com soro estona diretamente antes de apertar os nós para evitar embolia periférica.
13. Coloque uma gaze hemosática ao redor de ambas as anastomoses e libere cuidadosamente o grampo vascular Cooley para que a reperfusão do enxerto possa começar. Manuseie o sangramento ao longo das anastomas por compressão leve com cotonetes esterilizados.
    NOTA: O enxerto deve começar a bater depois de cerca de 60 s.
14. Substitua o intestino em uma forma como a do nameia. Certifique-se de que não há malrotaçãos do radix mesentérico para evitar necrose intestinal ou obstrução mecânica.
15. Feche os músculos abdominais/fáscia e a pele separadamente usando suturas contínuas de polifilamento 3-0.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Para analgesia pós-operatória, forneça aos receptores uma injeção subcutânea adicional de 5 mg de Carprofen por kg de peso corporal no primeiro dia pós-operatório (POD). Além disso, adicione 1 g de Metamizol a 500 mL de água potável até o terceiro POD.
2. Comece a monitorar a função do enxerto cardíaco por palpação abdominal diária no terceiro POD.
   NOTA: Em caso de falha do enxerto antes do terceiro POD, deve-se considerar uma falha cirúrgica e não imunológica. No entanto, isso depende, naturalmente, da combinação de cepas escolhida e do respectivo modelo imunológico (por exemplo, rejeição hiperaguda após a imunização prévia).
3. Após a rejeição do enxerto, extraia tecidos como os linfonodos retroperitoneal drenantes cranianos cranianos do anastomoses, do baço, do sangue, do timo e do enxerto para análises imunológicas posteriores através de citometria de fluxo ou imunohistoquímica.

4. Digestão enzimática do coração e injeção subcutânea de células cardíacas no ouvido

1. Realizar explantação cardíaca e perfusão de forma análoga ao transplante de coração heterotópico (ver passo 1).
2. Triture o coração em blocos de 3 mm x 3 mm usando um bisturi estéril ou uma tesoura estéril e incuba-o por 30 min a 37 °C em meio de cultura contendo 0,5 mg/mL colagenase.
   NOTA: É importante usar meio de cultura contendo penicilina, estreptomicina e glutamina sem soro fetal (FCS) particularmente porque a FCS inibe a digestão da colagemnase.
3. Adicione o tecido digerido a uma peneira de grande porte, enquanto remove o meio de cultura e pica-fogo completamente para obter uma suspensão de células cardíacas vitais, principalmente células cardíacas mortas e células sanguíneas remanescentes. Lave a suspensão celular duas vezes com solução salina isotônica estéril.
   NOTA: Configurações de centrifugação: 10 min, 200 x g, 20 °C
4. Filtrar a suspensão usando um filtro de células de 40 μm e coletar as congeries celulares vitais, lavando o coador celular com 5-10 mL de solução salina isotônica.
5. Após a centrifugação, resuspenda as células musculares cardíacas em solução salina dissolvida em uma concentração de 5x10⁵ células/mL e desenhe a solução celular em uma seringa de 1 mL.
6. Realizar anestesia análoga ao protocolo descrito para a narcose receptora (ver passo 2) para transplante de coração heterotópico.
7. Coloque o receptor em posição lateral e fixe a orelha com um dedo usando fita dupla face(Figura 5A).
8. Injete 20 μL da solução celular muscular cardíaca (contendo 1 x 10⁴ células) através de uma cânula de 27 G s.c. perto dos vasos capilares visuais no ouvido do receptor(Figura 5B).
9. Após um período de observação definido (dependendo da combinação de tensão escolhida e força da rejeição), extraia os linfonodos cervicais drenantes e realize análises adicionais, como citometria de fluxo ou co-culturas(Figura 5C).
   NOTA: Além disso, a análise histológica da pinna pode ser realizada para determinar a infiltração celular.

Resultados

No passado, diferentes questões imunológicas foram abordadas com base no modelo, que foi validado no grupo de trabalho por mais de 500 transplantes com uma taxa de sobrevivência superior a 95%^{13,18,19,20,21,22,23,24}. O te...

Discussão

O método anteriormente descrito de transplante cardíaco heterotópico em ratos baseia-se principalmente na descrição de Ono e Lindsey em 1969³. Desde então, várias modificações foram introduzidas em várias espécies levando a uma ampla diversidade deste modelo. Combinando várias dessas modificações e introduzindo nossa própria experiência resultante de mais de 30 anos realizando transplantes de coração heterotópicos em laboratório, criamos uma abordagem cirúrgica viável, que n?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia device (including isoflurane vaporizer)	Summit Anesthesia Solutions	No Catalog Number available
Cannula (27 G)	BD Microlance	302200
Carprofen	Pfizer	Rimadyl 50 mg/mL
Cellstar Tubes (15 mL)	GreinerBioOne	188271
Cell strainer (40 µm)	BD Falcon	2271680
Collagenase Type CLSII	Biochrome	C2-22
Compresses 5x5 cm	Fuhrmann	31501
Compresses 7.5x7.5 cm	Fuhrmann	31505
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf	1032128
Dexpathenol (5 %)	Bayer	"Bepanthen"
DPBS BioWhittaker	Lonza	17-512F
Forceps	B. Braun	Aesculap BD557R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD313R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD35
Heating mat	Gaymar Industries	"T/Pump"
Hemostatic gauze	Ethicon	Tabotamp
Heparin-Natrium 25 000 I.E.	Ratiopharm	No Catalog Number available
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-pored sieve (stainless steel)	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
Lidocaine	Astra Zeneca	2 % Xylocain
Metamizol-Natrium	Ratiopharma	Novaminsulfon 500 mg/mL
Micro forceps	B. Braun	Aesculap BD3361
Micro needle holder	Codman, Johnson & Johnson Medical	Codmann 80-2003
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap BD336R
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap FD241R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FD101R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FM471R
Needle holder	B. Braun	Aesculap BM221R
Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x)	PAA	P11-010
Peripheral venous catheter (18 G)	B. Braun	4268334B
Peripheral venous catheter (22 G)	B. Braun	4268091B
Probe pointed scissors	B. Braun	Aesculap BC030R
Retractors	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
RPMI culture medium	Lonza	BE12-702F
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Baxter	No Catalog Number available
Scissors	B. Braun	Aesculap BC414
Surgical microscope	Carl-Zeiss	OPMI-MDM
Sutures (anastomoses)	Catgut	Mariderm 8-0 monofil
Sutures (ligature)	Resorba	Silk 5-0 polyfil
Sutures (skin, fascia)	Ethicon	Mersilene 3-0
Syringe (1 mL)	B. Braun	9166017V
Syringe (10 mL)	B. Braun	4606108V
Syringe (20 mL)	B. Braun	4606205V
Vascular clamp	B. Braun	Aesculap FB708R