Sıçanlarda Heterotopik Kalp ve Kardiyak Kas Hücre Nakli için İmmünolojik Model

Özet

Sıçanlarda heterotopik karın kalp transplantasyonunun bir modelini açıklayarak, basitleştirilmiş bir cerrahi yaklaşıma yol açan mevcut stratejilerde değişiklik ima ediyoruz. Ayrıca, hayati kardiyak kas hücrelerinin kulak içi enjeksiyonu ile yeni bir ret modeli tarif, sıçanlarda daha fazla nakil immünolojik analizler sağlayan.

Özet

Sıçanlarda heterotopik kalp nakli 50 yılı aşkın bir süredir çeşitli immünolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir model olmuştur. 1964'teki ilk açıklamadan bu yana çeşitli değişiklikler bildirilmiştir. Sıçanlarda heterotopik kalp naklinin 30 yıl sonra, daha ileri cerrahi eğitim veya arka plan olmadan kolayca öğretilebilen ve yapilebilen basitleştirilmiş bir cerrahi yaklaşım geliştirdik.

Artan aort ve pulmoner arter indiksiyonu ve superior ve inferior kaval ve pulmoner venlerin ligasyonundan sonra donör kalp hasat edilir ve daha sonra heparin ile takviye buz gibi tuzlu çözeltiile perfüzyon. Alıcı karın damarlarının kenetlenme ve kesici haleledilmesinden sonra, aort ve pulmoner arter ilerleyen donör, sürekli çalışan dikişler kullanılarak sırasıyla alıcı abdominal aort ve inferior vena kavaya anastomozlanır.

Farklı donör alıcı kombinasyonlarına bağlı olarak, bu model allogreftlerin akut veya kronik reddinin analizini sağlar. Bu modelin immünolojik önemi daha hayati kardiyak kas hücrelerinin kulak içi enjeksiyon ve servikal lenfatik doku drenaj sonraki analizi yeni bir yaklaşım ile geliştirilmiştir.

Giriş

Heterotopik kalp transplantasyonu transplantasyon toleransı, akut ve kronik allogreft ret, iskemi-reperfüzyon yaralanması, makine perfüzyonu veya kardiyak remodelling ile ilgili farklı araştırmalarda sıkça kullanılan deneysel bir modeldir. Diğer avantajların yanı sıra, greft fonksiyonu palpasyon ve greft yetmezliği ile noninvaziv olarak izlenebilir böbrekler veya karaciğer gibi diğer organların aksine alıcının hayati bir bozulmaya yol açmaz.

1964 yılında, Abbott ve ark. başlangıçta sıçanlarda heterotopik karın kalp nakli açıklanan¹. Daha sonra, 1966 yılında, anastomozlar için uçtan uca tekniği Tomita ve ark.²tarafından tanımlanmıştır. Şu anda kullanılan model için zemin Ono ve Lindsey tarafından 1969^yılında3 bildirilmiştir. Son yıllarda, çeşitli değişiklikler kombine heterotopik kalp-akciğer nakli⁴dahil olmak üzere boşaltılmış, kısmen yüklü veya yüklü sol ventrikül kalp greftleri farklı oluşturmak için yayınlanmıştır^{4 ,5,6}. İmmünolojik analizler için hacimsiz yüklü kalp grefti transplantasyonu en sık yapılır. Bu durumda, kan akımı retrograd aort ve daha sonra koroner arterler artan donör girer. Venöz drenaj sağ atriyum ve ventrikül içine koroner sinüs boyunca oluşur (Şekil 1A-B). Bu nedenle, sol ventrikül kan akımı dışında, Dışında Thebesian damarlarından kan marjinal miktarda. Bu da sol ventrikül yardımcı cihaz tedavisi sırasında patofizyolojik mekanizmaları incelemek için yararlı bir model yapar⁷.

Heterotopik kalp nakli fareler, tavşanlar, domuzlar da dahil olmak üzere çeşitli türlerde yapılmıştır ve hatta insanlarda tek veya biventriküler yardımcı cihaz olarak kullanılmıştır^8,9,10,11. Sıçan hala organ nakli modelleri için popüler bir deneysel hayvan temsil eder, farklı sıçan suş kombinasyonları için greft sağkalım süreleri geçmişte iyi tanımlanmış ve immünolojik reaktifler çok sayıda erişilebilir beri^12,13. Farelerin aksine, sıçanlar daha büyük yapma cerrahi ve immünolojik analizler için lenfatik doku erişimi daha uygulanabilir¹². Ayrıca, son yıllarda sıçanlarda ticari klonlama teknolojilerinin tanıtımı büyük olasılıkla deneysel sıçan modelleri yinelenen bir ilgi yol açacaktır¹⁴.

Genel olarak, heterotopik kalp greftleri servikal veya abdominal anastomoz yaparak alıcı damarlara bağlanabilir. Ancak, birkaç çalışma femoral anastomoz manuel palpasyon veya transfemoral ekokardiyografi için daha iyi erişim nedeniyle gelişmiş izleme kolaylaştırır ve böylece greft yetmezliği daha kesin bir tespit sağlar öneririz^15,16.

Her iki anastomoz^tekniğiarasında operasyon süresi, komplikasyon oranı, sonuç ve greft sağkalım süresi arasında bir fark olmadığı gösterilmiştir. Açıkçası, drenaj lenf düğümleri yeterli sayıda durumu servikal anastomoz bir yararı olarak belirtilmelidir; ancak, daha uzun eğitim süreleri gereklidir. Buna karşılık, abdominal anastomoz daha az karmaşık ve immünolojik araştırmalar için eşit derecede değerli, özellikle allojenik kalp kası hücrelerinin kulak içi enjeksiyon ve sonraki servikal lenfadenektomi yeni bir yöntem sonuçları ile kombine. Her iki modelin bir kombinasyonu girişim sonrası immünolojik analizler geniş bir yelpazede sunuyor.

Aşağıdaki protokol, iskemi süresini azaltmak için cerrah çiftleri halinde çalışma anlamına gelir. Ancak, tüm deneyler tek bir kişi tarafından gerçekleştirilebilir. Kalp eksplantasyonu ve implantasyonu için alet ve malzemelerin kurulumu Şekil 2A-B'degösterilmiştir.

Protokol

Tüm hayvan deneyimleri, Aşağı Saksonya'nın (LAVES, Oldenburg, Almanya) tüketici koruma ve gıda güvenliği için yerel Etik Hayvan İnceleme Kurulu'nun yönergelerine uygun olarak 12/0768 ve 17/2472 onay lı olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Kalp eksplantasyonu ve perfüzyonu

NOT: Greft donörolarak 7-22 haftalık kadın veya erkek sıçanlar kullanıldı.

1. Donör sıçanı isofluran emdirerek anestezi edin (%5'te indüksiyon ve 1 L/dk O₂ akışı ile %3'te bakım). Perioperatif analjezi için vücut ağırlığı başına 5 mg Carprofen deri altı enjekte edin ve ayak ucutu yoksunluk refleksinin yokluğunu kontrol edin.
2. Göz yağlayıcı uygulayın ve mekanik bir makas kullanarak karın ve torasik kürk çıkarın.
3. Bir supine pozisyonda donör yerleştirin, elastik bantları ile operasyon masasının tabanında ekstremite düzeltmek ve% 70 etanol veya başka bir yeterli alternatif ile cildi sterilize.
4. Cildi uzunlamasına yönde ve lokal anestezi uygulamasından sonra (örn. lidokain %0,2) makas kullanarak ortanca laparotomi gerçekleştirin.
5. Retraktörler takın, donörün solundaki bağırsağı harekete geçirin ve sterilize edilmiş pamuklu bezlerle inferior vena kavayı ortaya çıkarın.
6. Antikoagülasyon için, 500 I.U. heparin enjekte 1 mL buz gibi iyotonik tuzlu çözeltisi intravenöz inferior vena kava delinerek çözülmüş. İğnenin geri çekilmesinden sonra pamuklu bir bez le hafif sıkıştırma ile delinme yerindeki kanamayı durdurun(Şekil 3A).
7. Diyaframı incise ve donörün her iki tarafına lateral torakotomi yapmak.
8. Toraksın harekete geçirilmiş ventral duvarını operasyon masasına sabitle.
9. İki mikro iğne tutucu kullanarak künt preparat ile perikard ve vagal sinir çıkarın.
10. Donör exsanguinate ve kalp boşaltmak için karın damarlarının trazeksiyon gerçekleştirin.
11. Transvers perikardiyal sinüs içine bir sonda sivri makas künt dalı yerleştirin ve ıslak bir kompres ile kalbin hafif kaudal çekiş altında mümkün olduğunca distal olarak artan aort ve pulmoner arter ayrı(Şekil 3B).
12. Superior ve inferior vena kava ve pulmoner venlerin etrafına tek bir 5-0 ligatür yerleştirin ve mümkün olduğunca dorsal olarak sıkın(Şekil 3C).
13. Doku dorsal'ı ligatüre doğru koparın ve kalbi ayıklayın(Şekil 3D).
14. Ekteki kalbe, artan aort ve pulmoner arterden gelen 18 G kanülile, 30 mL buz gibi buz soğuğu, 1000 I.U. heparin ile takviye edilmiş izoton salin çözeltisi ve kalbi tuzlu çözeltiile buz üzerinde doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin(Şekil 3E-F).

2. Kalp implantasyonu

NOT: Alıcı olarak 10-14 haftalık dişi veya erkek sıçanlar kullanılmıştır. Bağışçılar ve alıcılar yaklaşık ağırlık uyumlu idi.

1. Isofluran inhalasyonu (%5'te indüksiyon ve 1 L/dk O₂ akışı ile %1,5-2 oranında bakım) kullanarak alıcı farenin anestezisini gerçekleştirin. Perioperatif analjezi için vücut ağırlığı başına 5 mg Carprofen deri altı enjekte edin ve ayak ucutu yoksunluk refleksinin yokluğunu kontrol edin.
2. Göz yağlayıcı uygulayın, karın kürkkaldırmak, uzuvları düzeltmek ve donör hazırlık benzer şekilde cildi sterilize. Optimal postoperatif sonuç için, intraoperatif hipotermiyi önlemek için bir ısıtma paspas üzerinde operasyon gerçekleştirin.
3. Derinin uzunlamasına kesiden sonra abdominal fasyayayayali lidokain (%0.2) gibi lokal anestezi uygulayın. Median laparotomi ile karın boşluğuaçın ve retraktör ler takın.
4. Alıcının sol üst tarafına bağırsak seferber ve sıcak, ıslak kompres yerleştirin.
5. Duodenum ve proksimal jejunum seferber sonra, sırasıyla, cerrahi mikroskop kullanarak (veya büyüteç gözlük) 5-7x büyütme ile, pamuk lu bez ile künt hazırlık ile abdominal aort ve inferior vena kava maruz. Karın damarlarını ayırmayın.
6. Lomber damarları yaralamadan iki mikro iğne tutucukullanarak karın damarlarını yükseltin ve Cooley vasküler kelepçeyi yerleştirin (Şekil 4A).
7. 30-45° kemerli 27 G kanül(Şekil 4B)ile karın damarlarını delin.
8. Donör damarların lümenbüyüklüğüne(Şekil 4C-D)uyan uzunlamasına bir kesi oluşturmak ve pıhtıları çıkarmak ve postoperatif trombozönlemek için alıcı damarları tuzlu çözelti ile perfüzyon yapmak için Potts makası kullanarak delinme alanını büyütün.
9. Grefti situsa yerleştirin ve aort artan donörü alıcı karın aortuna iki basit kesme dikişle sabitle (8-0 monofilament rezorbable sütür) uzunlamasına kesikranial ve kaudal köşesinde(Şekil 4E).
10. Anastomoz bir çalışan 8-0 ile alıcının karın aort ile donörün yükselen aort monofilament sütür iki adımda: birincisi, grefti alıcı damarların sağına yerleştirin ve anastomozun ilk yarısını gerçekleştirin (Şekil 4E). Daha sonra, grefti alıcı damarların soluna yerleştirin ve anastomozun ikinci yarısını gerçekleştirin (Şekil 4F).
11. Donör pulmoner arteri inferior vena kavasına benzer şekilde aort anastomozuna sabitletirin (8-0 monofilament resüsite edilemeyen sütür). Venöz anastomozun ilk yarısını damar ın intraluminal tarafından diker (Şekil 4G-H).
12. Periferik emboli önlemek için düğüm sıkma önce doğrudan tuzlu ile anastomoz flush.
13. Hem anastomozların etrafına hemostatik gazlı bez yerleştirin ve greftin reperfüzyonunun başlayabilmesi için Cooley vasküler kelepçeyi dikkatlice bırakın. Sterilize pamuk lu bezler ile hafif sıkıştırma ile anastomozlar boyunca kanama yıkın.
    NOT: Greft yaklaşık 60 s sonra dayak başlamalıdır.
14. Bağırsaklarını moda gibi kıvrımlı bir şekilde değiştirin. Bağırsak nekrozu veya mekanik tıkanıklığı önlemek için mezenterik radiks hiçbir malrotasyonlar olmadığından emin olun.
15. Sürekli 3-0 polifilament çalışan dikişleri kullanarak karın kaslarını/fasyayı ve deriyi ayrı ayrı kapatın.

3. Ameliyat sonrası bakım

1. Postoperatif analjezi için, ilk ameliyat sonrası gün vücut ağırlığı kg başına 5 mg Carprofen ek bir deri altı enjeksiyon ile alıcılar tedarik (POD). Ayrıca, üçüncü POD kadar içme suyu 500 mL 1 g Metamizol ekleyin.
2. Üçüncü POD'da günlük abdominal palpasyon ile kalp grefti fonksiyonunu izlemeye başlayın.
   NOT: Üçüncü POD'dan önce greft yetmezliği olması durumunda immünolojik bir yetmezlik yerine cerrahi bir cerrahi olgu düşünülmelidir. Ancak, bu tabii ki seçilen suş kombinasyonu ve ilgili immünolojik modele bağlıdır (örneğin, önce bağışıklama sonrası hiperakut ret).
3. Greft reddinden sonra, akan sitometri veya immünohistokimya yoluyla daha fazla immünolojik analiz için anastomozların drenaj retroperitoneal lenf düğümleri, dalak, kan, timus ve greft gibi dokuları ayıklayın.

4. Kalp enzimatik sindirim ve kulakta kalp hücrelerinin deri altı enjeksiyonu

1. Heterotopik kalp nakline benzer şekilde kalp eksplantasyonu ve perfüzyon uyguluyor (bkz. adım 1).
2. Kalbi steril bir neşter veya steril makas kullanarak 3 mm x 3 mm bloklar halinde parçala ve 0,5 mg/mL kollajenaz içeren kültür ortamında 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Özellikle FCS kollajenaz sindirimi inhibe ederken, fetal baldır serumu (FCS) olmadan penisilin, streptomisin ve glutamin içeren kültür ortamının kullanılması önemlidir.
3. Büyük gözenekli elek için sindirilmiş doku ekleyin, kültür orta ve iyice hayati kalp kas hücrelerinin bir süspansiyon almak için kıyma kaldırırken, çoğunlukla ölü tek kalp hücreleri ve kalan kan hücreleri. Hücre süspansiyonuna steril isotonik tuzlu solüsyon ile iki kez yıkayın.
   NOT: Santrifüj ayarları: 10 dk, 200 x g, 20 °C
4. Süspansiyonu 40 μm'lik hücresüz kullanarak filtreleyin ve hücre süzgecini 5-10 mL İzotonik tuzlu çözelti ile yıkarak hayati hücre kongerilerini toplayın.
5. Santrifüjden sonra, 5x10⁵ hücre/mL konsantrasyonda çözünmüş ve hücre çözeltisini 1 mL şırıngaya doğru çeker.
6. Heterotopik kalp nakli için alıcı narkoz için açıklanan protokole benzer anestezi uygulayın (bkz. adım 2).
7. Alıcıyı yanal bir konuma yerleştirin ve kulağı çift taraflı bant kullanarak parmakla düzeltin(Şekil 5A).
8. 27 G kanül s.c. ile kardiyak kas hücresi solüsyonunun 20 μL'sini (1 x 10⁴ hücre içeren) alıcının kulağına görsel kılcal damarlara yakın bir şekilde enjekte edin(Şekil 5B).
9. Tanımlanmış bir gözlem döneminden sonra (seçilen gerinim kombinasyonuna ve ret gücüne bağlı olarak), drenaj lı servikal lenf düğümlerini ayıklayın ve akış sitometrisi veya ko-kültürler gibi daha fazla analiz yapın(Şekil 5C).
   NOT: Ayrıca hücre infiltrasyonunu belirlemek için pinnahistolojik analizi yapılabilir.

Sonuçlar

Geçmişte, farklı immünolojik sorunlar model temelinde ele alınmıştır, hangi fazla bir sağkalım oranı ile 500'den fazla organ nakli ile çalışma grubunda doğrulandı^{13, 1818,,19,20,21,22,23,24}. Toplam çalışma...

Tartışmalar

Sıçanlarda heterotopik kardiyak transplantasyonun daha önce açıklanan yöntemi esas olarak 1969 yılında Ono ve^Lindsey'intanımına dayanmaktadır 3 . O zamandan beri, çeşitli türlerde çeşitli değişiklikler bu modelin geniş bir çeşitlilik yol açmaktadır. Bu değişikliklerin birçoğunu birleştirerek ve 30 yılı aşkın heterotopik kalp naklinin laboratuvarda yapılmasından kaynaklanan kendi deneyimimizi sunarak, uzun eğitim süreleri veya cerrahi arka plan gerektirmeyen uygu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia device (including isoflurane vaporizer)	Summit Anesthesia Solutions	No Catalog Number available
Cannula (27 G)	BD Microlance	302200
Carprofen	Pfizer	Rimadyl 50 mg/mL
Cellstar Tubes (15 mL)	GreinerBioOne	188271
Cell strainer (40 µm)	BD Falcon	2271680
Collagenase Type CLSII	Biochrome	C2-22
Compresses 5x5 cm	Fuhrmann	31501
Compresses 7.5x7.5 cm	Fuhrmann	31505
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf	1032128
Dexpathenol (5 %)	Bayer	"Bepanthen"
DPBS BioWhittaker	Lonza	17-512F
Forceps	B. Braun	Aesculap BD557R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD313R
Forceps	B. Braun	Aesculap BD35
Heating mat	Gaymar Industries	"T/Pump"
Hemostatic gauze	Ethicon	Tabotamp
Heparin-Natrium 25 000 I.E.	Ratiopharm	No Catalog Number available
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-pored sieve (stainless steel)	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
Lidocaine	Astra Zeneca	2 % Xylocain
Metamizol-Natrium	Ratiopharma	Novaminsulfon 500 mg/mL
Micro forceps	B. Braun	Aesculap BD3361
Micro needle holder	Codman, Johnson & Johnson Medical	Codmann 80-2003
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap BD336R
Micro needle holder	B. Braun	Aesculap FD241R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FD101R
Micro scissors	B. Braun	Aesculap FM471R
Needle holder	B. Braun	Aesculap BM221R
Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x)	PAA	P11-010
Peripheral venous catheter (18 G)	B. Braun	4268334B
Peripheral venous catheter (22 G)	B. Braun	4268091B
Probe pointed scissors	B. Braun	Aesculap BC030R
Retractors	Forschungswerkstätten Hannover Medical School	No Catalog Number available
RPMI culture medium	Lonza	BE12-702F
Saline solution (NaCl 0.9 %)	Baxter	No Catalog Number available
Scissors	B. Braun	Aesculap BC414
Surgical microscope	Carl-Zeiss	OPMI-MDM
Sutures (anastomoses)	Catgut	Mariderm 8-0 monofil
Sutures (ligature)	Resorba	Silk 5-0 polyfil
Sutures (skin, fascia)	Ethicon	Mersilene 3-0
Syringe (1 mL)	B. Braun	9166017V
Syringe (10 mL)	B. Braun	4606108V
Syringe (20 mL)	B. Braun	4606205V
Vascular clamp	B. Braun	Aesculap FB708R