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要約

これは、組み換えウイルスの宿主範囲選択および視覚的同定を用いて「瘢痕のない」組換えワクシニアウイルスを生成する方法である。

要約

ワクシニアウイルス(VACV)は天然痘の原因物質であるバリオラウイルス(VARV)を自然から根絶するのに役立った。ワクチンとして初めて使用されて以来、ワクチンのベクターとして、また、癌性ウイルスとして開発されてきました。これらのアプリケーションは、VACVの容易に操作されたゲノムおよび広い宿主範囲を優れたプラットフォームとして利用し、様々な治療用途を有する組換えウイルスを生成する。マーカー選択法や過渡性優先選択を含む組換えVACVを生成するためにいくつかの方法が開発されています。ここでは、組換えウイルスの視覚的同定と相まって、宿主範囲選択方法の改良を提示する。我々の方法は、宿主抗ウイルスタンパク質キナーゼR(PKR)によって生成される選択的圧力を、2つのVACV PKRアンタゴニストの1つであるmCherryタグ付きE3Lを発現する蛍光融合遺伝子と相まって利用する。カセットには、対象遺伝子およびmCherry-E3L融合を含む、VACVゲノムに由来する配列によって横たわっている。対象遺伝子とmCherry-E3Lとの間には、3'アームの最初の〜150ヌクレオチドと同一である小さい領域であり、選択後のmCherry-E3L遺伝子の相同組換えおよび喪失を促進する。我々は、この方法が、薬物選択や変異型ウイルスの広範なスクリーニングを必要とせずに、様々な細胞型における効率的でシームレスなrVACVの生成を可能にすることを実証する。

概要

ワクシニアウイルス(VACV)は、自然からヒト病原体、バリオラウイルス(VARV)の最初の成功した根絶に役立ちました。バリオラウイルスの駆除以来、VACVを含むポックスウイルスは、ヒトおよび動物医学の両方に有用な治療ウイルスであり続けています。例えば、VACVベースの狂犬病ウイルスワクチンは、欧州1及び米国2におけるシルベージ狂犬病の感染を予防するのに非常に有効であった。さらに最近では、様々な抗腫瘍分子(例えば、単鎖抗体またはヒトエリスロポエチン)を発現する組換えポックスウイルスは、腫瘍分解剤33、4、54,5として励ましの成功を見ている。VACVは、遺伝子操作に容易に適性であるためベクターとして特に魅力的であり、広い宿主範囲を有し、かつ様々な条件下で安定であり、フィールド66,77における容易な輸送およびワクチンの生存率を可能にする。実験室実験やワクチン生成のための組換えVACVを生成する複数の技術が開発されているが、これらのウイルスを生成するための現在の戦略には顕著な限界がある。

VACVの有用性により、組換えウイルスを生成する複数の戦略が開発されている。第1の戦略は、抗生物質耐性遺伝子などのトランスジーンおよび選択可能マーカー遺伝子を含むカセットを導入するために相同組換えを採用する。カセットは、2〜500ヌクレオチド(nt)以上の腕によって横にされ、遺伝子をウイルスゲノムの特定の部位に導き、その後、二重交差事象88、9、109,10によって安定的に統合される。この戦略は迅速かつ効率的です。しかし、それは予期しない効果を生み出す可能性のあるマーカー遺伝子の形で余分な遺伝物質をもたらす。さらに、利用可能なユニークな選択可能なマーカーの数によって制限される導入可能なトランス遺伝子の数に実用的な上限がある。一時的な支配的選択(TDS)戦略は、「瘢痕のない」組換えウイルス11の生成を促進することによってこの問題に対処してきた。この戦略を用いて、変異型VACV遺伝子と選択マーカー遺伝子を含むプラスミドをウイルスゲノムに統合するが、追加の隣接するVACV DNAは含まない。このアプローチは、単一のクロスオーバーイベントによる統合の結果として、プラスミド全体の一過性の統合とVACV遺伝子の重複をもたらす。この中間体は、選択圧力下で維持される限り安定であり、この構成体の濃縮を可能にする。選択が除去されると、VACVの複製は、プラスミドの除去と野生型(wt)または組換えウイルスのおよそ50:50比のいずれかで形成される第2のクロスオーバー事象を可能にする。TDSは、外来DNAの安定した導入を必要とせずに組換えウイルスを生成する一方で、複数のウイルスクローンをシーケンシング分析、潜在的に時間とコストのかかるステップによって予想される突然変異をスクリーニングする必要があります。

ここでは、これらのアプローチのそれぞれの最良の側面を組み合わせた組換えポックスウイルスを生成するアプローチを提示し、複製無能修飾ワクシニアアンカラ12、13、1413,14に対12して説明されているアプローチと同様である。この戦略は、視覚的およびホスト範囲の選択を組み合わせて、二重交差事象によって組換えウイルスを迅速に生成し、その後、相同組換えによって選択可能なマーカー遺伝子を排除する。このアプローチは、相同組換えによって媒介される突然変異体の迅速な生成を可能にし、TDSアプローチの「スカーレス」性質を有する一方で、野生型および変異型ウイルスを区別するためのその後のスクリーニングステップを必要としない。我々の方法はまた、抗生物質選択の代わりに宿主範囲選択を使用し、細胞株中の化学的に誘発されたフェノールの変化のリスクを排除する。このアプローチでは、組換えVACVを生成する選択剤として、宿主抗ウイルスタンパク質キナーゼR(PKR)を用いることを選択しました。PKRは、ほとんどの細胞タイプ15において非活性モノマーとして表される。N末端dsRNA結合ドメインで二本鎖RNA(dsRNA)を結合すると、PKRは二量体化し、自己リン酸化された16である。このPKRの活性型は、真核生物開始因子2(eIF2)のαサブユニットをリン酸化し、最終的には開始メチオニルtRNAのリボソームへの送達を阻害し、それによって細胞内翻訳を防止し、多くのウイルスファミリー17,18,18の複製を広く阻害する。

PKRの広範かつ強力な抗ウイルス活性に応答して、多くのウイルスはPKR活性化を防ぐために少なくとも1つの戦略を進化させた。ポックスウイルスの大部分は、2つのPKRアンタゴニストを発現し、VACV中のE3LおよびK3L遺伝子によってコードされ、2つの異なる機構19を介してPKRに拮抗する。E3は、二本鎖RNA20,21と結合することによりPKRホモジマー化を防ぎ、K321は活性化されたPKRに直接結合することにより擬似基質阻害剤として作用し、それによってその基質eIF2α22との相互作用を阻害する。22重要なことに、これら2種のPKRアンタゴニストは、必ずしもすべての種からPKRを阻害するわけではない。例えば、羊痘ウイルスからのK3ホモログは羊由来のPKRを強く阻害し、一方、シープポックスE3ホモログは、かなりのPKR阻害23、24,24を示さなかった。本研究では、蛍光選択と組み合わせたPKR媒介性選択的圧力を用いて、多様な種由来のPKRの有能な細胞では複製できないE3LおよびK3L(VC-R4)に対して削除されたVACV組換え体を生成する方法を提示する。この組換えウイルスは、ネイティブE3Lプロモーターの制御下で遺伝子を発現する組換えウイルスの迅速な生成のための優れた背景を提供します。

プロトコル

1. 組み換えベクトルの生成

  1. 選択カセットを生成するプライマーを設計する。隣接するアンプリコンとベクトルと重なり合う配列を持つ個々のアンプリコンを設計し、いくつかのオンラインプライマー設計ツールのいずれかを使用して、ギブソンアセンブリとも呼ばれるDNA分子の等温酵素アセンブリを容易にします。
    注: このプロトコルは、従来の制限エンドヌクレアーゼベースのクローン作成方法を使用して実行することもできます。その場合、重複するシーケンスではなく、適切な制限部位を持つプライマーを設計する。
  2. ステップ1.1で設計されたプライマーを用いて、PCRは5'から3'まで順に以下の要素を増幅する(図1):E3L(5'アーム)のVACVゲノム領域5'の約500ヌクレオチド、EGFPまたは目的遺伝子、 〜150ヌクレオチドは、E3L(短3'アーム)のVVゲノム領域から直ちに3'、合成早期25/後期ポックスウイルスプロモーター25、mCherry-E3L融合遺伝子、および短い3'腕(長い3'腕)を含むE3LのVACVゲノム領域から〜500ヌクレオチドを含む。
    1. PCRチューブに、各アンプリコンに対して試薬を次の順序で加える:17μLのDNaseフリー水、各プライマーの1.2μL(初期濃度= 10 μM、 最終濃度=0.5μM、5x PCR反応バッファーの5μL、テンプレートDNA(プラスミドから増幅されたアンプリコン用10 ng:EGFPおよびE/Lプロモーター-mCherry-E3Lカセット;ウイルスゲノムDNAから増幅された増幅素異型の場合は100ng:5'および3'腕)、および0.5μLのDNAポリメラーゼ。50 μLの最終反応量に加えた水の量を調整します。
      注:テンプレートDNAの濃度は経験的に決定されるべきであるが、我々は一般的に10 ng /反応から始める。
    2. チューブをサーモサイクラーに入れ、DNAを98°Cで30sで溶かし、3段階PCRプロトコルの25ラウンド(5sの場合は98°C、10sの場合は55°C、10分間72°C)を使用します。
      注: 各プライマー セットのメーカーが推奨する Tm に基づいて、融解温度を決定します。各アンプリコンの長さ(1分/kb)に基づいて、適切な延長時間を決定します。
  3. 1%アガロースゲルで増幅産物を可視化します。各DNA製品の10μLと各ウェルに2μLのローディングバッファを加え、8 V /cmで1時間稼働します。
  4. ゲルはDNAゲル抽出キットおよび製造業者の議定書を使用して各増幅を精製する。50 μLのDNaseフリーウォーターを加え、直ちに遠心分離してカラムから切断機を溶かします。
  5. EcoRIエンドヌクレアーゼ消化を使用して、pUC19クローニングベクターを直線化します。チューブに、1 μgの pUC19、水を 17 μL、2 L の反応バッファー、および 1 μL (20 単位) のEcoRIを加えます。37°Cで1時間インキュベートする。
    1. 増幅産物を8V/cmで1時間動かした1%アガロースゲルで可視化し、ステップ1.4で説明したようにDNAゲル抽出キットを使用して製品を精製します。
  6. マスターミックスキットを使用して、個々のゲル精製アンプリコンおよび線形化ベクターのすべてをリゲートします。
    1. PCRチューブに、線形化pUC19と各アンプリコン(5'アーム、EGFP、短い3'アーム、E/ Lプロモーター-mCherry-E3Lカセット、3'アーム)の0.2 pmolを加えます。DNaseフリー水を最終体積10μLに加え、10μLのDNAアセンブリマスターミックスを追加します。50°Cで1時間インキュベートする。
  7. 前述の26、27,27のようにステップ1.6から組み立てられた製品の2μLで化学的に有能な大腸菌を変換します。100 μg/mL アンピシリンを含むLBアガロースプレート上の形質転換細胞のプレート 100 μL。プレートを一晩37°Cでインキュベートする。
  8. よく隔離されたコロニーを選び、100 μg/mL アンピシリンを含むルリアスープを含む管に個々のコロニーを移す。225rpmで振りながら、37°Cでチューブを一晩インキュベートします。
  9. プラスミドミニプレップキットを使用して、一晩培養からプラスミドを分離します。分光光度計を用いてDNAの濃度と純度を確認します。A260/A280の比率は1.8~2.0です。
  10. 希望のクローニング製品が正しいかどうかを判断するために、サンガーシーケンシング用のプラスミドを提出します。DNAを-20°Cに保存します。

2. 組換えウイルスの生成

  1. 6ウェルプレートで1.0(MOI = 1.0)の感染の多重度で再結合されるウイルスに適した細胞のコンフルエント単層に感染する。感染した細胞を37°Cで、CO2を5%で1時間インキュベートする。その後、培地を吸引し、新鮮なDMEMに置き換えます。感染細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベー2トする。
    注:K3L22を欠くワクシニアウイルスのような増殖の有能なウイルスのために、そのようなヨーロッパのウサギの腎臓細胞株RK13(ATCC#CCL-37)またはBSC-40のような細胞株が適している。しかしながら、この論文に記載したウイルスのような複製不十分なウイルスについては、PKRアンタゴニストE3LとK3Lの両方を欠いているが、これら2つの遺伝子をトランスまたはPKRノックダウンまたはノックアウト細胞で発現する補体細胞株が必要である。
  2. 500 ngのベクターを持つ感染細胞を、製造者のプロトコルに従って市販のトランスフェクション試薬を使用してステップ1.10で生成および検証した。細胞を37°Cで、5%CO2で48時間インキュベートする。2
    注:E3LとK3Lの両方を欠くワクシニアウイルスを使用する場合、PKR媒介性選択的圧は、再結合ウイルスの選択を駆動し、これらの細胞内のmCherry-E3L融合タンパク質の発現を維持します。必要に応じて、全体のプラスミドの代わりにトランスフェクションに使用する挿入物のみをPCR増幅することも可能であるべきである。
  3. 感染後48時間、感染した単層を収穫する。場合によっては、ピペット処理によって細胞を収穫することができますが、まだしっかりと接着している場合は、細胞スクレーパーで収穫します。細胞を3回凍結解凍し、50%振幅で15 sのライセートを超音波処理します。このライセートは-80°Cで使用できる状態になるまで保管してください。
  4. ステップ2.3で収穫したリセートを10-1から10-6に連続して希釈し、120μLの溶解液をDMEM(10-1)の1080 μLに加え、この希釈液の120μLを1080 μL(10-2)に加え、この4-2回繰り返します。-1各希釈液の1 mLを個々に加え、PKRの有能な細胞株のコンフルエントウェル(この場合はRK13細胞)を加える。
    1. 感染した細胞を37°Cで、CO2を5%で1時間インキュベートする。その後、培地を吸引し、37°Cおよび5%CO2で感染細胞をインキュベートした新鮮な2DMEMと交換してください。
  5. 感染後24~48時間、蛍光顕微鏡で組換えウイルスを同定する。組換えウイルス由来のプラークは、mCherry-E3L融合遺伝子の統合による赤色蛍光を発現する(図2)。PKR阻害剤を欠いたウイルスが最初に使用された場合、すべてのプラークは組換えウイルスを含む。
  6. プラークはRK13細胞上で3回組換えウイルスを精製する。プラークの精製の最終ラウンドの後、すべてのプラークは、赤い蛍光を発現する必要があります。
  7. VACV PKR阻害剤E3LおよびK3L(RK13+E3L+K3L細胞28)を発現するRK13細胞のコンフルエント6ウェルプレートを、ステップ2.6からプラーク精製赤蛍光ウイルスに感染させる。井戸あたり約50〜100プラークを目指してください。
    注:これらの細胞は、トランスでVACV PKR拮抗薬を提供し、mCherry-E3L融合遺伝子を維持するためにPKR媒介性選択的圧力を緩和し、組換えウイルスの「瘢痕のない」生成を促進する。
  8. EVOS2顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡による崩壊したウイルスを同定し、GFPフィルターキューブ(励起:470/22、発光:525/50)およびRFPフィルターキューブ(励起:531/40、放出:593/40)。
    注: mCherry-E3L融合遺伝子が失われる頻度は約2.5%です(表2)。EGFPがマーカー遺伝子として含まれていない場合、mCherry-E3L融合遺伝子を失った変異型ウイルスのプラークは無色になります。
  9. プラークは、RK13+E3L+K3L細胞上で緑色のみの(VC-R4)または無色のプラーク(E3L)を3回精製します。プラークが赤く蛍光を発しないようにしてください。
  10. pcrおよびサンガーシーケンシングによるmCherry-E3Lの損失および予想される突然変異の存在を確認する。
    注:目的の遺伝子または変異がPKR阻害活性を有しない場合、組換えウイルスはRK13+E3L+K3L細胞または同等のPKR阻害またはPKR欠損細胞株上で増殖しなければならない(図3)。

結果

図1の手順を用いて、PKRアンタゴニストE3LとK3Lの両方を欠いたVACVを生成し、すでにK3Lのために削除されたウイルス中のEGFPにE3Lを置き換えることによって(vP872)。図2は、mCherry-E3Lのウイルス発現を示すPKRの有能RK13細胞における赤色蛍光プラーク、ならびに、mCherry-E3L選択マーカーのE3Lの喪失および崩壊を確認するRK13+E3L+K3L細胞で発現したEGFPを示す。

ディスカッション

ここでは、最終組換えウイルスに外来DNAを保持せずに組換えワクシニアウイルスを生成する過渡マーカー選択戦略32のバリエーションを提示する。我々の戦略は、抗生物質などの選択的圧力の他の形態ではなく、宿主抗ウイルスタンパク質PKRによって媒介される選択的圧力を使用する。宿主抗ウイルス遺伝子の使用は、細胞内の化学的に誘発された表型変化の可能性、また?...

開示事項

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

謝辞

このプロジェクトは、国立衛生研究所(AI114851)がSRに資金を提供しました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master MixNEBM0492LHigh-fidelity polymerase used in PCR
AmpicillinThermoFisher Scientific11593027Bacterial selective agent
Disposable Cell ScrapersThermoFisher Scientific08-100-242Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging systemThermoFisher ScientificAMAFD2000Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFPThermoFisherAMEP4651GFP Cube
EVOS Light Cube, RFPThermoFisherAMEP4652RFP Cube
GenJetSignaGen LaboratoriesSL100489Transfection reagent
Luria Bertani (LB) BrothGibco10855021Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kitNEBT1020LGel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kitNEBT1010LMiniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop OneThermoFisher ScientificND-ONE-WSpectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master MixNEBE2621LIsothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 SonicatorQsonicaQ500-110Sonicator for virus lysates
RK13 cellsATCCCCL-37Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture platesVWR10062-892Cell culture plates

参考文献

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