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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo è un metodo per generare virus vaccinia ricombinanti "senza cicatrici" utilizzando la selezione host-range e l'identificazione visiva dei virus ricombinanti.

Abstract

Il virus Vaccinia (VACV) è stato determinante per eradicare il virus variola (VARV), l'agente causale del vaiolo, dalla natura. Dal suo primo utilizzo come vaccino, VACV è stato sviluppato come vettore per i vaccini terapeutici e come virus oncolitico. Queste applicazioni sfruttano il genoma facilmente manipolabile di VACV e l'ampia gamma di host come una piattaforma eccezionale per generare virus ricombinanti con una varietà di applicazioni terapeutiche. Sono stati sviluppati diversi metodi per generare VACV ricombinante, tra cui metodi di selezione dei marcatori e selezione dominante transitoria. Qui, presentiamo un perfezionamento di un metodo di selezione dell'intervallo host accoppiato con l'identificazione visiva dei virus ricombinanti. Il nostro metodo sfrutta la pressione selettiva generata dalla proteina antivirale ospite chinasi R (PKR) accoppiata con un gene di fusione fluorescente che esprime E3L con tag mCherry, uno dei due antagonisti VACV PKR. La cassetta, compreso il gene di interesse e la fusione mCherry-E3L, è affiancata da sequenze derivate dal genoma VACV. Tra il gene di interesse e mCherry-E3L c'è una regione più piccola che è identica ai primi 150 nucleotidi del braccio da 3', per promuovere la ricombinazione omologa e la perdita del gene mCherry-E3L dopo la selezione. Dimostriamo che questo metodo consente una generazione efficiente e senza soluzione di continuità di rVACV in una varietà di tipi di cellule senza richiedere la selezione di farmaci o uno screening completo per i virus mutanti.

Introduzione

Il virus Vaccinia (VACV) è stato determinante per la prima eradicazione di successo di un patogeno umano, il virus variola (VARV), dalla natura. Fin dallo sterminio del virus della variola, i poxvirus tra cui VACV hanno continuato ad essere utili virus terapeutici sia per la medicina umana che per quella animale. Ad esempio, un vaccino contro il virus della rabbia basato su VACV è stato molto efficace nel prevenire la trasmissione della rabbia silvatica in Europa1 e negli Stati Uniti2. Più recentemente, i poxvirus ricombinanti che esprimono una varietà di molecole antitumorali (ad esempio, anticorpi a catena singola o eritropoietina umana) hanno visto un successo incoraggiante come agenti oncolitici3,4,5. VACV è particolarmente attraente come vettore perché è facilmente suscettibile di manipolazione genetica, possiede una vasta gamma di ospiti, ed è stabile in una varietà di condizioni, consentendo un facile trasporto e la vitalità del vaccino nel campo6,7. Mentre sono state sviluppate diverse tecniche per generare VACV ricombinante per esperimenti di laboratorio e generazione di vaccini, le attuali strategie per generare questi virus hanno notevoli limitazioni.

Grazie all'utilità di VACV, sono state sviluppate più strategie per generare virus ricombinanti. La prima strategia utilizza una ricombinazione omologa per introdurre una cassetta che include il transgene e un gene marcatore selezionabile come un gene di resistenza agli antibiotici. La cassetta è affiancata da due nucleotidi da 500 dollari (nt) o bracci più grandi che indirizzano il gene verso un sito specifico del genoma virale, che viene poi stabilmente integrato da eventi crossover doppi8,9,10. Questa strategia è rapida ed efficiente; tuttavia, si traduce in materiale genetico extra sotto forma di gene marcatore che può produrre effetti imprevisti. Inoltre, esiste un limite massimo pratico al numero di transgeni che possono essere introdotti limitata dal numero di marcatori unici selezionabili disponibili. Le strategie di selezione dominante transitoria (TDS) hanno affrontato questo problema facilitando la generazione di virus ricombinanti "senza cicatrici"11. Utilizzando questa strategia, un plasmide contenente un gene MUTANTe VACV e un gene marcatore selezionabile sono integrati nel genoma virale, ma senza ulteriore fianco DNA VACV affiancato. Questo approccio si traduce nell'integrazione transitoria dell'intero plasmide e nella duplicazione del gene VACV come risultato dell'integrazione da parte di un singolo evento di crossover. Questo intermedio è stabile finché viene mantenuto sotto pressione di selezione, permettendo l'arricchimento di questo costrutto. Quando la selezione viene rimossa, la duplicazione VACV consente un secondo evento di crossover che comporta la rimozione del plasmide e la successiva formazione del virus di tipo selvaggio (wt) o ricombinante in un rapporto approssimativo di 50:50. Mentre tDS genera virus ricombinanti senza richiedere l'introduzione stabile del DNA estraneo, più cloni di virus devono essere sottoposti a screening per la mutazione prevista mediante l'analisi del sequenziamento, un passo potenzialmente dispendioso in termini di tempo e denaro.

Qui, presentiamo un approccio alla generazione di poxvirus ricombinanti che combinano i migliori aspetti di ciascuno di questi approcci, simile a un approccio che è stato descritto per la replica incompetente modificato vaccini Ankara12,13,14. Questa strategia combina la selezione della gamma visiva e dell'ospite per generare rapidamente virus ricombinanti mediante eventi di crossover doppi e successivamente elimina il gene marcatore selezionabile mediante la ricombinazione omologa. Questo approccio consente la rapida generazione di mutanti mediati dalla ricombinazione omologa, con la natura "senza cicatrici" degli approcci TDS, pur non richiedendo una successiva fase di screening per distinguere il tipo selvaggio e i virus mutanti. Il nostro metodo utilizza anche la selezione della gamma host al posto della selezione degli antibiotici, eliminando il rischio di cambiamenti fenotipici chimicamente indotti nella linea cellulare. Per questo approccio, abbiamo scelto di utilizzare la proteina antivirale ospite chinasi R (PKR) come agente selettivo per generare VACV ricombinante. PKR è espresso come un monomero inattivo nella maggior parte dei tipi di cella15. Quando si lega l'RNA a doppio filamento (dsRNA) nei domini di legame dsRNA del terminale N, pKR si dimerde e viene autofosforelofillato16. Questa forma attiva di fosforolato PKR la sottounità alfa del fattore di avvio eucariotico 2 (eIF2), inibendo infine la consegna di frattempo meticonil-tRNA al ribosoma, impedendo così la traduzione intracellulare e inibendo ampiamente la replicazione di molte famiglie virus17,18.

In risposta all'ampia e potente attività antivirale del PKR, molti virus hanno sviluppato almeno una strategia per prevenire l'attivazione del PKR. La maggior parte dei poxvirus esprime due antagonisti del PKR, codificati dai geni E3L e K3L in VACV, che antagonizzano il PKR attraverso due meccanismi distinti19. E3 previene l'omodimerizzazione del PKR legando l'RNA a doppio filamento20,21, mentre K3 agisce come un inibitore pseudosubstrate legandosi direttamente al PKR attivato e quindi inibendo l'interazione con il suo substrato eIF2 .22 È importante sottolineare che questi due antagonisti del PKR non inibiscono necessariamente il PKR a tutte le specie. Ad esempio, l'omolologo K3 del virus del vaiolo delle pecore inibiva fortemente il PKR dalle pecore, mentre il pologio di pecora E3 non mostrava una notevole inibizione del PKR23,24. In questo studio, presentiamo un metodo per utilizzare la pressione selettiva mediata da PKR combinata con la selezione della fluorescenza per generare un ricombinante VACV eliminato per E3L e K3L (VC-R4), che non può replicare in cellule competenti pKR derivate da specie diverse. Questo virus ricombinante fornisce un eccellente background per la generazione rapida di virus ricombinanti che esprimono geni sotto il controllo del promotore nativo E3L.

Protocollo

1. Generazione del vettore di ricombinazione

  1. Progettare i numeri primi per generare la cassetta di selezione. Progettare ogni singolo amplificatore con sequenze sovrapposte con amplificatori vicini e il vettore per facilitare l'assemblaggio enzimatico isotermico di molecole di DNA, chiamato anche assemblaggio Gibson, utilizzando uno dei diversi strumenti di progettazione primer online.
    NOTA: questo protocollo può essere completato anche utilizzando i metodi tradizionali di clonazione basati su endonuclease. In tal caso, progettare i numeri di prima livello con i siti di restrizione appropriati anziché con sequenze sovrapposte.
  2. Utilizzando i primer progettati nel passaggio 1.1, la PCR amplifica i seguenti elementi in ordine da 5' a 3' (Figura 1): 500 nucleotidi della regione genomica VACV 5' di E3L (5' braccio), EGFP o il gene di interesse, 150 nucleotidi dalla regione genomica VACV immediatamente 3 di E3L (corto 3' braccio), un promotore di poxvirus precoce/tardire sintetico25, il gene di fusione mCherry-E3L e i nucleotidi 500 dalla regione genomica VACV 3' di E3L compreso il braccio corto 3' (lungo 3' braccio).
    1. In un tubo PCR, aggiungere i reagenti nel seguente ordine per ogni amplificatore: 17 luna di acqua libera DNase, 1,2 l di ogni primer (concentrazione iniziale concentrazione finale: 0,5 m), 5 luna di buffer di reazione PCR 5x, DNA modello (10 ng per gli amplificatori amplificati da plasmidi: EGFP e e/L promoter-mCherry-E3L cassetta; 100 ng per amplificatori amplificati dal DNA genomico virale: 5' e 3') e 0,5 L di polimerasi di DNA. Regolare il volume d'acqua aggiunto per un volume di reazione finale di 50.L.
      NOTA: La concentrazione del DNA del modello deve essere determinata empiricamente, ma generalmente iniziamo con 10 ng/reazione.
    2. Mettere i tubi in un termociclista, sciogliere il DNA a 98 gradi centigradi per 30 s, quindi utilizzare 25 giri di un protocollo PCR in tre fasi: 98 gradi centigradi per 5 s, 55 gradi c per 10 s e 72 gradi per 1 min.
      NOTA: Determinare la temperatura di fusione in base al Tm suggerito dal produttore per ogni set di primer. Determinare il tempo di estensione appropriato in base alla lunghezza di ciascun amplificatore (1 minuto/kb).
  3. Visualizza i prodotti di amplificazione su un gel di agarose dell'1%. Aggiungete 10 l di ciascun prodotto di DNA e 2 l di tampone di carico a ciascun pozzo, e eseguite a 8 V/cm per 1 h.
  4. Gel purifica ogni amplificatore utilizzando un kit di estrazione gel di DNA e il protocollo del produttore. Eluire gli amplicons dalla colonna aggiungendo 50 -L di acqua libera da DNase e centrifugando immediatamente.
  5. Linearizzare il vettore di clonazione pUC19 utilizzando la digestione endonucleale EcoRI. Ad un tubo, aggiungere 1 g di pUC19, acqua a un volume di 17 L, 2 L di buffer di reazione e 1 L (20 unità) di EcoRI. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 ora.
    1. Visualizzate i prodotti di amplificazione su un gel di agarose dell'1% eseguito a 8 V/cm per 1 h. Accisie la banda dal gel e purificate il prodotto utilizzando il kit di estrazione del gel di DNA come descritto al punto 1.4.
  6. Ligate tutti i singoli, gel purificati ampi e il vettore linearizzato utilizzando un kit master mix.
    1. Ad un tubo PCR, aggiungere 0,2 pmol di pUC19 linearizzato e ogni amplificatore (braccio 5', EGFP, braccio corto 3', e/l promotore-mCherry-E3L cassetta, 3'braccio). Aggiungere l'acqua libera di DNase ad un volume finale di 10 o L, quindi aggiungere 10 L di miscela master di assemblaggio del DNA. Incubare campioni a 50 gradi centigradi per 1 h.
  7. Trasformare l'E. coli chimicamente competente con 2 l del prodotto assemblato dal punto 1.6 come descritto in precedenza26,27. Piastra 100 L delle cellule trasformate su piastre di agarose LB che contengono 100 g/mL di ampicillina. Incubare le piastre durante la notte a 37 .
  8. Scegli colonie ben isolate e trasferisci singole colonie su tubi contenenti brodo di Luria con 100 ampicillina. Incubare i tubi per una notte a 37 s mentre si agita a 225 giri/min.
  9. Isolare i plasmidi dalla cultura notturna utilizzando un kit miniprep plasmide. Controllare la concentrazione e la purezza del DNA utilizzando uno spettrofotometro. Un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0 è accettabile.
  10. Inviare i plasmidi per il sequenziamento di Sanger per determinare se il prodotto di clonazione desiderato è corretto. Conservare il DNA a -20 gradi centigradi.

2. Generazione del virus ricombinante

  1. Infettare un monostrato confluente di cellule adatte con il virus da ricombinedcombined a una molteplicità di infezione di 1,0 (MOI - 1,0) in una piastra a 6 pozze. Incubare le cellule infette a 37 e 5% di CO2 per 1 h. Quindi aspirare il mezzo e sostituirlo con DMEM fresco. Incubare le cellule infette a 37 e 5% di CO2.
    NOTA: Per la replicazione virus competenti come un virus vaccinia che manca K3L22, una linea cellulare come la linea cellulare renale coniglio europeo RK13 (ATCC #CCL-37) o BSC-40 è appropriata. Tuttavia, per i virus carenti di replicazione, come il virus descritto in questo documento privo sia di PKR antagonisti E3L e K3L, è necessaria una linea cellulare complementare che esprima questi due geni nelle cellule trans o PKR knock-down o knock-out.
  2. Trasfecare le cellule infette con 500 ng del vettore generato e convalidato nel passaggio 1.10 utilizzando un reagente di trasfezione disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore. Incubare le cellule a 37 e 5% CO2 per 48 h.
    NOTA: Se si utilizza un virus vaccinia privo di E3L e K3L, la pressione selettiva mediata da PKR guiderà la selezione di virus ricombinati e manterrà l'espressione della proteina di fusione mCherry-E3L in queste cellule. Se lo si desidera, dovrebbe anche essere possibile amplificare PCR solo l'inserto da utilizzare per la trasfezione invece dell'intero plasmide.
  3. 48 ore dopo l'infezione, raccogliere il monostrato infetto. In alcuni casi, le cellule possono essere raccolte tramite pipettaggio, ma se sono ancora strettamente aderenti, raccoglile con un raschietto cellulare. Congelare le cellule tre volte, e poi sonicare i lisati per 15 s al 50% di ampiezza. Conservare questo lisato a -80 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'uso.
  4. Diluire in modo seriale il lisato raccolto al punto 2,3 da 10-1 a10-6 aggiungendo 120 luna del lisato a 1080 gradi di DMEM (10-1), e quindi aggiungendo 120 l di questa diluizione a 1080 ldi dMEM (10-2) e ripetendo questo processo altre quattro volte. Aggiungere 1 mL di ogni diluizione a un singolo pozzo confluente di una linea cellulare competente PKR, in questo caso cellule RK13.
    1. Incubare le cellule infette a 37 e 5% di CO2 per 1 h. Quindi aspirare il mezzo e sostituirlo con DMEM fresco Incubare le cellule infette a 37 e 5% CO2.
  5. 24-48 ore dopo l'infezione, identificare i virus ricombinanti mediante microscopia a fluorescenza. Le placche dei virus ricombinanti esprimono fluorescenza rossa a causa dell'integrazione del gene di fusione mCherry-E3L (Figura 2). Se inizialmente è stato utilizzato un virus privo di inibitori del PKR, tutte le placche conterranno virus ricombinante.
  6. La placca purifica i virus ricombinanti tre volte sulle cellule RK13. Dopo l'ultimo giro di purificazione della placca, tutte le placche devono esprimere fluorescenza rossa.
  7. Infettare una piastra confluente a 6 pozze di cellule DI RK13 che esprimono gli inibitori vaCV PKR E3L e K3L (RK13-E3L-K3L cellule28) con il virus di fluorescinaggio rosso purificato dalla placca dal passo 2.6. Mirare a circa 50-100 placche per pozzo.
    NOTA: Queste cellule forniscono gli antagonisti VACV PKR in trans e alleviano la pressione selettiva mediata dal PKR per mantenere il gene di fusione mCherry-E3L, promuovendo così la generazione "senza cicatrici" del virus ricombinante.
  8. Identificare i virus collassati mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un microscopio EVOS2 e un cubo di filtro GFP (Eccitazione: 470/22, Emissione: 525/50) e un cubo di filtro RFP (Eccitazione: 531/40, Emissione: 593/40).
    NOTA: La frequenza con cui viene perso il gene di fusione mCherry-E3L è di circa il 2,5%(tabella 2). Se EGFP non è incluso come gene marcatore, le placche di virus mutanti che hanno perso il gene di fusione mCherry-E3L saranno incolore.
  9. La placca purifica le placche solo verdi (VC-R4) o incolore (E3L) per tre volte sulle cellule RK13-E3L-K3L. Assicurarsi che non si fluoriscano in rosso.
  10. Confermare la perdita di mCherry-E3L e la presenza della mutazione prevista da parte del sequenziamento PCR e Sanger.
    NOTA: Se il gene o la mutazione di interesse non ha attività inibitoria del PKR, i virus ricombinanti devono essere coltivati su cellule RK13-E3L-K3L o una linea cellulare equivalente inibita al PKR o carente di PKR (Figura 3).

Risultati

Abbiamo usato la procedura illustrata nella Figura 1 per generare un VACV privo sia di PKR antagonisti E3L che di K3L, sostituendo E3L con EGFP in un virus già eliminato per K3L (vP872). La figura 2 mostra le placche fluorescenti rosse nelle cellule RK13 competenti di PKR che indicano l'espressione virale di mCherry-E3L, nonché EGFP espresse nelle cellule RK13-E3L-K3L che confermano la perdita di E3L e il collasso del marcatore di selezione mCherry-E3L.

Discussione

Qui presentiamo una variazione di una strategia di selezione dei marcatori transitoria 32 per generare virus della vaccino ricombinante senza trattenere il DNA estraneo nel virus ricombinante finale. La nostra strategia utilizza una pressione selettiva mediata dalla proteina antivirale ospite PKR piuttosto che da altre forme di pressione selettiva come gli antibiotici. L'uso di geni antivirali ospiti elimina la possibilità di cambiamenti fenotipici indotti chimicamente nelle cellule o un aumento ...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo progetto è stato finanziato dai National Institutes of Health (AI114851) a SR.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master MixNEBM0492LHigh-fidelity polymerase used in PCR
AmpicillinThermoFisher Scientific11593027Bacterial selective agent
Disposable Cell ScrapersThermoFisher Scientific08-100-242Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging systemThermoFisher ScientificAMAFD2000Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFPThermoFisherAMEP4651GFP Cube
EVOS Light Cube, RFPThermoFisherAMEP4652RFP Cube
GenJetSignaGen LaboratoriesSL100489Transfection reagent
Luria Bertani (LB) BrothGibco10855021Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kitNEBT1020LGel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kitNEBT1010LMiniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop OneThermoFisher ScientificND-ONE-WSpectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master MixNEBE2621LIsothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 SonicatorQsonicaQ500-110Sonicator for virus lysates
RK13 cellsATCCCCL-37Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture platesVWR10062-892Cell culture plates

Riferimenti

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