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  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Il s’agit d’une méthode pour générer des virus vaccinias recombinants « sans cicatrices » à l’aide de la sélection de la gamme d’hôtes et de l’identification visuelle des virus recombinants.

Résumé

Le virus vaccinia (VACV) a joué un rôle déterminant dans l’éradication du virus de la variole (VARV), l’agent causatif de la variole, de la nature. Depuis sa première utilisation comme vaccin, vaCV a été développé comme vecteur de vaccins thérapeutiques et de virus oncolytique. Ces applications tirent parti du génome facilement manipulé de VACV et de la large gamme d’hôtes comme plate-forme exceptionnelle pour générer des virus recombinés avec une variété d’applications thérapeutiques. Plusieurs méthodes ont été développées pour générer des VACV recombinés, y compris des méthodes de sélection de marqueurs et une sélection dominante transitoire. Ici, nous présentons un raffinement d’une méthode de sélection de gamme d’hôtes couplée à l’identification visuelle des virus recombinants. Notre méthode tire parti de la pression sélective générée par la protéine antivirale hôte kinase R (PKR) couplée à un gène de fusion fluorescent exprimant mCherry-tagged E3L, l’un des deux antagonistes VACV PKR. La cassette, y compris le gène d’intérêt et la fusion mCherry-E3L, est flanquée de séquences dérivées du génome du VACV. Entre le gène d’intérêt et mCherry-E3L est une région plus petite qui est identique aux premiers nucléotides de 150 pouces du bras 3', pour favoriser la recombinaison et la perte homologues du gène mCherry-E3L après sélection. Nous démontrons que cette méthode permet une génération efficace et transparente de vruvure dans une variété de types de cellules sans nécessiter la sélection de médicaments ou un dépistage approfondi des virus mutants.

Introduction

Le virus vaccinia (VACV) a joué un rôle déterminant dans la première éradication réussie d’un agent pathogène humain, le virus de la variole (VARV), de la nature. Depuis l’extermination du virus de la variole, les virus du vaxovirus, y compris le VVC, continuent d’être des virus thérapeutiques utiles pour la médecine humaine et animale. Par exemple, un vaccin contre le virus de la rage à base de VGRI a été très efficace pour prévenir la transmission de la rage sylvatique en Europe1 et aux États-Unis2. Plus récemment, les poxvirus recombinés exprimant une variété de molécules antitumorales (p. ex., anticorps à chaîne unique ou érythropoïétine humaine) ont connu un succès encourageant en tant qu’agents oncolytiques3,4,5. VACV est particulièrement attrayant en tant que vecteur parce qu’il est facilement favorable à la manipulation génétique, possède une large gamme d’hôtes, et il est stable dans une variété de conditions, permettant un transport facile et la viabilité du vaccin dans le domaine6,7. Bien que de multiples techniques aient été mises au point pour générer des VACV recombinés pour les expériences en laboratoire et la génération de vaccins, les stratégies actuelles visant à générer ces virus ont des limites notables.

Grâce à l’utilité du VVC, de multiples stratégies pour générer des virus recombinants ont été développées. La première stratégie utilise une recombinaison homologue pour introduire une cassette comprenant le transgène et un gène marqueur sélectionnable comme un gène de résistance aux antibiotiques. La cassette est flanquée de deux nucléotides (nt) ou de bras plus gros qui dirigent le gène vers un site spécifique du génome viral, qui est ensuite intégré de façon stable par des événements double crossover8,,9,10. Cette stratégie est rapide et efficace; cependant, il en résulte du matériel génétique supplémentaire sous la forme du gène marqueur qui peut produire des effets inattendus. En outre, il existe une limite supérieure pratique au nombre de transgènes qui peuvent être introduits limités par le nombre de marqueurs sélectionnables uniques disponibles. Les stratégies transitoires de sélection dominante (TDS) ont abordé cette question en facilitant la génération de virus recombinants « sans cicatrices» 11. Grâce à cette stratégie, un plasmide contenant un gène VACV mutant et un gène marqueur sélectionnable sont intégrés dans le génome viral, mais sans ADN VACV flanquant supplémentaire. Cette approche se traduit par l’intégration transitoire de l’ensemble du plasmide et la duplication du gène VACV à la suite de l’intégration par un seul événement de croisement. Cet intermédiaire est stable tant qu’il est maintenu sous pression de sélection, ce qui permet l’enrichissement de cette construction. Lorsque la sélection est supprimée, la duplication VACV permet un deuxième événement de croisement qui entraîne l’élimination du plasmide et la formation subséquente du type sauvage (wt) ou du virus recombinant dans un rapport approximatif de 50:50. Alors que le TDS génère des virus recombinés sans nécessiter l’introduction stable de l’ADN étranger, plusieurs clones de virus doivent être examinés pour la mutation prévue par l’analyse de séquençage, une étape potentiellement longue et coûteuse.

Ici, nous présentons une approche pour générer des poxvirus recombinés combinant les meilleurs aspects de chacune de ces approches, similaire à une approche qui a été décrite pour la réplication incompetent vaccinia modifié Ankara12,13,14. Cette stratégie combine la sélection visuelle et de la gamme d’hôtes pour générer rapidement des virus recombinants par des événements multisegments doubles, et par la suite éliminer le gène marqueur sélectionnable par recombinaison homologue. Cette approche permet la génération rapide de mutants négociés par une recombinaison homologue, avec la nature « sans cicatrice » des approches TDS, tout en n’exigeant pas une étape de dépistage ultérieure pour distinguer les virus sauvages de type et mutant. Notre méthode utilise également la sélection de la gamme hôte à la place de la sélection d’antibiotiques, éliminant le risque de changements phénotypiques induits chimiquement dans la lignée cellulaire. Pour cette approche, nous avons choisi d’utiliser la protéine antivirale hôte kinase R (PKR) comme agent sélectif pour générer recombinant VACV. PKR est exprimé comme un monomère inactif dans la plupart des types de cellules15. Sur la liaison arnorisation à double brin (dsRNA) dans les domaines de liaison N-terminal dsRNA, PKR dimerizes et est autophosphorylated16. Cette forme active de phosphorylates PKR l’alpha sous-unité du facteur d’initiation eucaryotique 2 (eIF2), inhibant finalement la livraison de l’initiateur méthionyl-tRNA au ribosome, empêchant ainsi la traduction intracellulaire et inhibant largement la réplication de nombreuses famillesvirales 17,18.

En réponse à l’activité antivirale large et puissante de PKR, de nombreux virus ont développé au moins une stratégie pour prévenir l’activation de la PKR. La plupart des poxvirus expriment deux antagonistes PKR, codés par les gènes E3L et K3L dans VACV, qui contrarier PKR par deux mécanismes distincts19. E3 empêche l’homodimerisation PKR en liant l’ARN à double brin20,21, tandis que K3 agit comme un inhibiteur pseudo-ubstrate en liant directement à PKR activé et inhibant ainsi l’interaction avec son substrat eIF222. Fait important, ces deux antagonistes de PKR n’inhibent pas nécessairement PKR de toutes les espèces. Par exemple, l’homolog K3 du virus de la variole du mouton a fortement inhibé le PKR des moutons, tandis que l’homolog de la variole du mouton E3 n’a pas montré d’inhibition considérable de PKR23,24. Dans cette étude, nous présentons une méthode d’utilisation de la pression sélective à médiation PKR combinée à la sélection de fluorescence pour générer un recombinant VACV supprimé pour E3L et K3L (VC-R4), qui ne peut pas reproduire dans les cellules compétentes PKR dérivées de diverses espèces. Ce virus recombinant fournit un excellent arrière-plan pour la génération rapide de virus recombinants exprimant des gènes sous contrôle du promoteur indigène E3L.

Protocole

1. Générer le vecteur de recombinaison

  1. Amorce de conception pour générer la cassette de sélection. Concevez chaque amplicon individuel avec des séquences qui se chevauchent avec les amplicons voisins et le vecteur pour faciliter l’assemblage enzymatique isothermal des molécules d’ADN, également appelé assemblage Gibson, en utilisant l’un des outils de conception d’apprêt en ligne plusieurs.
    REMARQUE : Ce protocole peut également être complété à l’aide de méthodes traditionnelles de clonage à base d’endonuclease de restriction. Dans ce cas, concevez des amorces avec les sites de restriction appropriés plutôt qu’avec des séquences qui se chevauchent.
  2. À l’aide des amorces conçues à l’étape 1.1, PCR amplifie les éléments suivants dans l’ordre de 5' à 3' (figure 1) : 500 nucléotides de la région génomique VACV 5' de l’E3L (5' bras), de l’EGFP ou du gène d’intérêt, 150 nucléotides de la région génomique VACV immédiatement 3' de l’E3L (bras court 3'), un promoteur synthétique de poxvirus précoce/tardif25, le gène fusion mCherry-E3L, et 500 nucléotides de la région génomique VACV 3' de l’E3L dont le bras court 3' (long bras 3').
    1. Dans un tube PCR, ajouter les réactifs dans l’ordre suivant pour chaque amplicon : 17 ll d’eau libre DNase, 1,2 l de chaque amorce (concentration initiale de 10 m, concentration finale de 0,5 M), 5 L de tampon de réaction PCR 5x, ADN de modèle (10 ng pour les amplicons amplifiés à partir de plasmides : EGFP et E/L promoteur-mCherry-E3L cassette; 100 ng pour les amplicons amplifiés à partir de l’ADN génomique viral : 5' et 3' bras), et 0.5 'L de polymerase. Ajuster le volume d’eau ajouté pour un volume de réaction final de 50 ll.
      REMARQUE : La concentration de l’ADN de modèle devrait être déterminée empiriquement, mais nous commençons généralement par 10 ng/réaction.
    2. Placer le tube(s) dans un thermocycler, et faire fondre l’ADN à 98 oC pour 30 s, puis utiliser 25 tours d’un protocole PCR en trois étapes: 98 oC pour 5 s, 55 oC pour 10 s, et 72 oC pour 1 min.
      REMARQUE : Déterminez la température de fonte en fonction du Tm suggéré par le fabricant pour chaque ensemble d’apprêt. Déterminez le temps de prolongation approprié en fonction de la durée de chaque amplicon (1 minute/kb).
  3. Visualisez les produits d’amplification sur un gel agarose de 1 %. Ajouter 10 l de chaque produit d’ADN et 2 l de tampon de chargement à chaque puits, et fonctionner à 8 V/cm pendant 1 h.
  4. Gel purifiez chaque amplicon à l’aide d’un kit d’extraction de gel d’ADN et du protocole du fabricant. Elute les amplicons de la colonne en ajoutant 50 L d’eau libre DNase et immédiatement centrifugage.
  5. Linéariser le vecteur de clonage pUC19 à l’aide de la digestion de l’endonuclease EcoRI. À un tube, ajouter 1 g de pUC19, de l’eau à un volume de 17 ll, 2 L de tampon de réaction et 1 l (20 unités) d’EcoRI. Incuber à 37 oC pour 1 h.
    1. Visualisez les produits d’amplification sur un gel d’agarose de 1 % exécuté à 8 V/cm pendant 1 h. Excisez la bande du gel, et purifiez le produit à l’aide du kit d’extraction de gel d’ADN tel que décrit à l’étape 1.4.
  6. Ligater tous les amplicons individuels, gel purifié et le vecteur linéaire à l’aide d’un kit de mélange maître.
    1. Sur un tube PCR, ajouter 0,2 hol de pUC19 linéaire et chaque amplicon (5' bras, EGFP, bras court 3', cassette E/L promoteur-mCherry-E3L, 3'arm). Ajouter l’eau sans DNase à un volume final de 10 l, puis ajouter 10 l de mélange de maître d’assemblage d’ADN. Incuber des échantillons à 50 oC pour 1 h.
  7. Transformez E. coli chimiquement compétent avec 2 l du produit assemblé de l’étape 1.6 comme décrit précédemment26,27. Plaque 100 L des cellules transformées sur des plaques d’agarose LB contenant 100 g/mL d’ampicilline. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 oC.
  8. Choisissez des colonies bien isolées et transférez des colonies individuelles dans des tubes contenant du bouillon Luria avec une ampicilline de 100 g/mL. Incuber les tubes pendant la nuit à 37 oC tout en secouant à 225 tr/min.
  9. Isolez les plasmides de la culture du jour au lendemain à l’aide d’un kit de miniprep plasmide. Vérifiez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Un ratio A260/A280 compris entre 1,8 et 2,0 est acceptable.
  10. Soumettez les plasmides pour le séquençage Sanger pour déterminer si le produit de clonage désiré est correct. Conservez l’ADN à -20 oC.

2. Générer le virus recombinant

  1. Infecter un monolayer confluent de cellules appropriées avec le virus à recombiner à une multiplicité d’infection de 1,0 (MOI 1,0) dans une plaque de 6 puits. Incuber les cellules infectées à 37 oC et 5% de CO2 pour 1 h. Ensuite, aspirer le milieu et le remplacer par du DMEM frais. Incuber les cellules infectées à 37 oC et 5% de CO2.
    REMARQUE : Pour les virus compétents de réplication tels qu’un virus vaccinia qui n’a pas de K3L22, une lignée cellulaire telle que la lignée européenne de cellules rénales de lapin RK13 (ATCC #CCL-37) ou BSC-40 est appropriée. Cependant, pour les virus déficients de réplication, tels que le virus décrit dans cet article manquant à la fois PKR antagonistes E3L et K3L, une ligne cellulaire complémentaire exprimant ces deux gènes dans les cellules trans ou PKR knock-down ou knock-out sont nécessaires.
  2. Transfect les cellules infectées avec 500 ng du vecteur généré et validé à l’étape 1.10 à l’aide d’un réactif transfection disponible dans le commerce suivant le protocole du fabricant. Incuber les cellules à 37 oC et 5% de CO2 pour 48 h.
    REMARQUE : Si l’utilisation d’un virus vacciniane dépourvu de la protéine de fusion E3L et K3L, la pression sélective à médiation PKR stimulera la sélection des virus recombinés et maintiendra l’expression de la protéine de fusion mCherry-E3L dans ces cellules. Si désiré, il devrait également être possible de PCR amplifier seulement l’insert à utiliser pour la transfection au lieu de l’ensemble du plasmide.
  3. 48 heures après l’infection, récoltez le monolayer infecté. Dans certains cas, les cellules peuvent être récoltées par tuyauterie, mais si elles sont encore étroitement adhérées, récoltez-les avec un grattoir cellulaire. Congeler les cellules trois fois, puis sonicate les lysates pour 15 s à 50% d’amplitude. Conservez ce lysate à -80 oC jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
  4. Siluer en série 10 fois le lysate récolté à l’étape 2.3 de 10-1 à 10-6 en ajoutant 120 L du lysate à 1080 6 L de DMEM (10-1), puis en ajoutant 120 L de cette dilution à 1080 L de DMEM (10-2), et en répétant ce processus quatre fois de plus. Ajouter 1 ml de chaque dilution à un puits individuel et confluent d’une lignée cellulaire compétente de PKR, dans ce cas RK13 cellules.
    1. Incuber les cellules infectées à 37 oC et 5% de CO2 pour 1 h. Ensuite, aspirez le milieu et remplacez-le par DMEM frais Incuber les cellules infectées à 37 oC et 5% de CO2.
  5. 24 à 48 heures après l’infection, identifier les virus recombinants par microscopie de fluorescence. Les plaques des virus recombinants expriment la fluorescence rouge due à l’intégration du gène de fusion mCherry-E3L(figure 2). Si un virus dépourvu d’inhibiteurs de la PKR a été utilisé au départ, toutes les plaques contiendront le virus recombinant.
  6. Plaque purifier les virus recombinants trois fois sur les cellules RK13. Après la dernière ronde de purification de la plaque, toutes les plaques doivent exprimer la fluorescence rouge.
  7. Infectez une plaque confluente de cellules RK13 6-puits exprimant les inhibiteurs de VACV PKR E3L et K3L (cellules RK13-E3L-K3L28) avec le virus de fluorage rouge tri-purifié de l’étape 2.6. Visez environ 50-100 plaques par puits.
    REMARQUE : Ces cellules fournissent les antagonistes DE VACV PKR dans les trans et allègent la pression sélective PKR-négociée pour maintenir le gène de fusion mCherry-E3L, favorisant ainsi la génération « sans cicatrice » du virus recombinant.
  8. Identifier les virus effondrés par microscopie à fluorescence à l’aide d’un microscope EVOS2, et d’un cube de filtre GFP (Excitation: 470/22, Émission: 525/50) et un cube de filtre de DP (Excitation: 531/40, Émission: 593/40).
    REMARQUE : La fréquence à laquelle le gène de fusion mCherry-E3L est perdu est d’environ 2,5 %(tableau 2). Si l’EGFP n’est pas incluse comme gène marqueur, les plaques des virus mutants qui ont perdu le gène de fusion mCherry-E3L seront incolores.
  9. La plaque purifie trois fois les plaques vertes seulement (VC-R4) ou incolores (E3L) sur les cellules RK13-E3L-K3L. Assurez-vous qu’aucune plaque ne fluore rouge.
  10. Confirmer la perte de mCherry-E3L et la présence de la mutation attendue par le séquençage PCR et Sanger.
    REMARQUE : Si le gène ou la mutation d’intérêt n’a pas d’activité inhibitrice de la PKR, les virus recombinés doivent être cultivés sur des cellules RK13-E3L-K3L ou sur une lignée cellulaire équivalente inhibée par le PKR ou en PKR(figure 3).

Résultats

Nous avons utilisé la procédure diagrammed dans la figure 1 pour générer un VACV manquant à la fois PKR antagonistes E3L et K3L, en remplaçant E3L par EGFP dans un virus déjà supprimé pour K3L (vP872). La figure 2 montre des plaques fluorescentes rouges dans les cellules RK13 compétentes de PKR indicatifs de l’expression virale de mCherry-E3L, ainsi que l’EGFP exprimées dans les cellules RK13-E3L-K3L confirmant la perte de l’E3L et l’effondrem...

Discussion

Ici, nous présentons une variation d’une stratégie transitoire de sélection des marqueurs 32 pour générer des virus vaccinia recombinants sans retenir l’ADN étranger dans le virus recombinant final. Notre stratégie utilise une pression sélective négociée par la protéine antivirale hôte PKR plutôt que d’autres formes de pression sélective comme les antibiotiques. L’utilisation de gènes antiviraux hôtes élimine la possibilité de changements phénotypiques induits chimiqueme...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce projet a été financé par les National Institutes of Health (AI1114851) à SR.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master MixNEBM0492LHigh-fidelity polymerase used in PCR
AmpicillinThermoFisher Scientific11593027Bacterial selective agent
Disposable Cell ScrapersThermoFisher Scientific08-100-242Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging systemThermoFisher ScientificAMAFD2000Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFPThermoFisherAMEP4651GFP Cube
EVOS Light Cube, RFPThermoFisherAMEP4652RFP Cube
GenJetSignaGen LaboratoriesSL100489Transfection reagent
Luria Bertani (LB) BrothGibco10855021Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kitNEBT1020LGel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kitNEBT1010LMiniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop OneThermoFisher ScientificND-ONE-WSpectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master MixNEBE2621LIsothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 SonicatorQsonicaQ500-110Sonicator for virus lysates
RK13 cellsATCCCCL-37Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture platesVWR10062-892Cell culture plates

Références

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Réimpressions et Autorisations

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