호스트 범위 및 시각적 선택을 사용하여 신속하고 원활한 재조합 Poxviruses 생성

요약

이는 재조합 바이러스의 호스트 범위 선택 및 시각적 식별을 사용하여 "무소" 재조합 백시니아 바이러스를 생성하는 방법이다.

초록

백시니아 바이러스 (VACV)는 자연에서 천연두의 원인 인 바리올라 바이러스 (VARV)를 근절하는 데 중요한 역할을했습니다. 백신으로 처음 사용된 이후, VACV는 치료 백신및 온용해 바이러스의 벡터로 개발되었습니다. 이러한 응용 분야는 VACV의 쉽게 조작할 수 있는 게놈 및 광범위한 숙주 범위를 다양한 치료 응용 분야와 함께 재조합 바이러스를 생성하는 뛰어난 플랫폼으로 활용합니다. 마커 선택 방법 및 과도 지배적 선택을 포함하여 재조합 VACV를 생성하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 여기서, 재조합 바이러스의 시각적 식별과 결합된 숙주 범위 선택 방법의 구체화를 제시한다. 우리의 방법은 mCherry 태그E3L를 발현하는 형광 융합 유전자와 결합된 숙주 항바이러스 단백질 키나제 R(PKR)에 의해 생성된 선택적 압력을 활용하며, 두 개의 VACV PKR 길항제 중 하나이다. 관심 있는 유전자 및 mCherry-E3L 융합을 포함하는 카세트는 VACV 게놈으로부터 유래된 서열에 의해 측면화된다. 관심 유전자와 mCherry-E3L 사이에는 3' 암의 제1~150뉴클레오티드와 동일한 더 작은 영역이며, 선택 후 mCherry-E3L 유전자의 상동성 재조합 및 손실을 촉진한다. 당사는 이 방법이 돌연변이 바이러스에 대한 약물 선택 또는 광범위한 스크리닝을 요구하지 않고 다양한 세포 유형에서 효율적이고 원활한 rVACV 생성을 허용한다는 것을 입증합니다.

서문

백시니아 바이러스 (VACV)는 자연에서 인간 병원균, 바리올라 바이러스 (VARV)의 첫 번째 성공적인 박멸을위한 도구였다. 바리올라 바이러스의 박멸 이후, VACV를 포함한 백스바이러스는 인간 및 동물 의학 모두에 유용한 치료 바이러스로 계속 되어 왔습니다. 예를 들어, VACV 기반 광견병 바이러스 백신은 유럽¹ 및 미국^2에서실바틱 광견병의 전염을 방지하는 데 매우 효과적이었다. 보다 최근에는 다양한 항종양 분자(예를 들어, 단일 사슬 항체 또는 인간 에리스로포이에틴)를 발현하는 재조합 백혈바이러스가 종양용해제^{3,,4,,5로서}의욕적인 성공을 보이고 있다. VACV는 유전자 조작에 용이하게 순종할 수 있고, 광범위한 숙주 범위를 보유하며, 다양한 조건하에서 안정되어, 현장에서 의 수송 및 백신 생존이 용이하기 때문에 벡터로서 특히 매력적이다^6,,7. 실험실 실험 및 백신 생성을 위한 재조합 VACV를 생성하기 위하여 다중 기술이 개발된 동안, 이 바이러스를 생성하는 현재 전략은 주목할 만한 한계가 있습니다.

VACV의 유용성 으로 인해 재조합 바이러스를 생성하는 여러 전략이 개발되었습니다. 첫번째 전략은 항생 저항 유전자와 같은 이식유전자 및 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 카세트를 소개하기 위하여 상동 재조합을 이용합니다. 카세트는 2~500개의 뉴클레오티드(nt) 또는 더 큰 암에 의해 측면이 바이러스 게놈내의 특정 부위로 유전자를 지시하고, 이어서 이중 크로스오버 이벤트^8,,9,,10에의해 안정적으로 통합된다. 이 전략은 빠르고 효율적입니다. 그러나, 그것은 예기치 않은 효력을 생성할 수 있는 마커 유전자의 양식에 있는 추가 유전 물자 초래합니다. 더욱이, 유효한 고유 선택 가능한 마커의 수에 의해 제한될 수 있는 트랜스게네의 수에 대한 실질적인 상한이 있다. 과도 지배적 인 선택 (TDS) 전략은 "무모"재조합 바이러스의 생성을 촉진하여이 문제를^해결11. 이 전략을 사용하여, 돌연변이 VACV 유전자 및 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 플라스미드는 바이러스 게놈으로 통합되지만, 추가적인 측면 VACV DNA는 없이 통합된다. 이러한 접근법은 단일 크로스오버 이벤트에 의한 통합의 결과로 VACV 유전자의 전체 플라스미드 및 복제의 과도 적분을 초래한다. 이 중간은 선택 압력하에서 유지되는 한 안정적이며, 이 구제의 농축을 허용합니다. 선택이 제거되면, VACV 중복은 약 50:50 비율로 야생 형 (wt) 또는 재조합 바이러스 중 하나의 플라스미드 및 후속 형성의 제거를 초래하는 두 번째 크로스 오버 이벤트를 가능하게한다. TDS는 외국 DNA의 안정한 소개를 요구하지 않고 재조합 바이러스를 생성하는 동안, 다중 바이러스 클론은 시퀀싱 분석에 의해 예상되는 돌연변이를 위해 가려져야 합니다, 잠재적으로 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 단계.

여기서, 우리는 이러한 접근법의 각각의 가장 좋은 측면을 결합한 재조합 백스바이러스를 생성하는 접근법을 제시하며, 이는 복제가 무능한 변형백시니아 앙카라^{12,,13,,14에}대해 기재된 접근법과 유사하다. 이 전략은 이중 크로스오버 이벤트에 의해 재조합 바이러스를 신속하게 생성하고, 이어서 상동 재조합에 의해 선택 가능한 마커 유전자를 제거하기 위해 시각 및 숙주 범위 선택을 결합한다. 이 접근법은 야생 유형과 돌연변이 바이러스를 구별하기 위한 후속 스크리닝 단계를 요구하지 않는 동안 TDS 접근법의 "무불한" 특성과 함께 상동 재조합에 의해 매개된 돌연변이체의 신속한 생성을 허용합니다. 우리의 방법은 또한 세포주에서 화학적으로 유도된 현상형 변경의 리스크를 제거하는 항생제 선택 대신에 호스트 범위 선택을 이용합니다. 이러한 접근법을 위해, 우리는 숙주 항바이러스 단백질 키나제 R(PKR)을 재조합 VACV를 생성하는 선택적 제제로서 사용하기로 선택하였다. PKR은 대부분의 세포 유형^15에서비활성 단량체로 발현된다. N-말단 dsRNA 결합 도메인에서 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 결합하면 PKR은 이화되고^16을자가 포설화된다. 이러한 활성 형태의 PKR 인산화는 진핵 개시 인자 2(eIF2)의 알파 소부를 궁극적으로 리보솜으로 의 이니시에이터 메티오닐-tRNA의 전달을 억제하고, 세포내 번역을 방지하고 많은 바이러스 군모의 복제를 광범위하게 억제한다^17,,18.

PKR의 광범위하고 강력한 항바이러스 활성에 반응하여, 많은 바이러스는 PKR 활성화를 방지하기 위한 적어도 하나의 전략을 발전시키고 있다. 대부분의 백혈바이러스는 2개의 PKR 길항제를 발현하고, VACV에 있는 E3L 및 K3L 유전자에 의해 인코딩되고, 이는 2개의 명백한 기계장치^19를통해 PKR을 적대합니다. E3는 이중 가닥 RNA^20,,21,K3가 활성화된 PKR에 직접 결합하여 가성 기질 억제제로서 작용하여 PKR 을 결합하여 PKR 을 결합하여 PKR 을 상호작용을 방지하고 이에 의해 eIF2α^22를억제한다. 중요한 것은, 이 두 PKR 길항제가 모든 종으로부터 PKR을 반드시 억제하는 것은 아니다. 예를 들어, 양두 바이러스로부터의 K3 호몰로그는 양으로부터 PKR을 강하게 억제한 반면, 양두 E3 상동체는 상당한 PKR 억제를 나타내지^{않았다(23,,24).} 본 연구에서, 우리는 다양한 종에서 유래한 PKR 유능한 세포에서 복제할 수 없는 E3L 및 K3L(VC-R4)에 대해 삭제된 VACV 재조합을 생성하기 위해 형광 선택과 결합된 PKR 매개 선택적 압력을 사용하는 방법을 제시한다. 이러한 재조합 바이러스는 네이티브 E3L 프로모터의 제어 하에 유전자를 발현하는 재조합 바이러스의 신속한 생성을 위한 훌륭한 배경을 제공한다.

프로토콜

1. 재조합 벡터 생성

1. 선택 카세트를 생성하도록 프라이머를 디자인합니다. 여러 온라인 프라이머 설계 도구를 사용하여 Gibson 어셈블리라고도 하는 DNA 분자의 등온 효소 어셈블리를 용이하게 하기 위해 인접한 앰플리카 및 벡터와 겹치는 서열로 각 개별 앰플리클을 설계합니다.
   참고: 이 프로토콜은 기존의 제한 endonuclease 기반 복제 방법을 사용하여 완료할 수도 있습니다. 이 경우 겹치는 시퀀스가 아닌 적절한 제한 사이트를 사용하여 프라이머를 디자인합니다.
2. 1.1단계에서 설계된 프라이머를 사용하여, PCR은 5'에서 3'까지의 순서대로 다음 원소를증폭(그림 1):5'의 VACV 게놈 영역의 ~500뉴클레오티드E3'의 E3L(5' 암), EGFP 또는 관심 유전자, ~150 VACV 게놈 영역에서 즉시 3' E3L(short 3' arm), 합성 조기/후기 수프바이러스 프로모터^25,mCherry-E3L 융합 유전자, 및 짧은 3' 암(long 3' arm)을 포함하는 E3L의 VACV 게놈 영역 으로부터의 ~500 뉴클레오티드.
   1. PCR 튜브에, 각 앰플리코에 대해 다음 순서로 시약을 추가하십시오: DNase 자유물 17 μL, 각 프라이머의 1.2 μL(초기 농도 = 10 μM, 최종 농도 = 0.5 μM), 5 μL의 5x PCR 반응 완충제, 템플릿 DNA (플라스미드로부터 증폭된 앰플리코에 대한 10 ng: EGFP 및 E/L 프로모터-mCherry-E3L 카세트; 바이러스 성 게놈 DNA로부터 증폭된 앰플리몬의 경우 100 ng: 5' 및 3' 무기), 및 0.5 μL의 DNA 중합체. 50 μL의 최종 반응 용적에 대해 첨가 된 물의 양을 조정하십시오.
      참고 : 템플릿 DNA의 농도는 경험적으로 결정되어야하지만, 우리는 일반적으로 10 ng / 반응으로 시작합니다.
   2. 튜브를 열사이클러에 넣고, DNA를 30초 동안 98°C에서 녹인 다음, 3단계 PCR 프로토콜의 25라운드를 사용한다: 5s용 98°C, 10초동안 55°C, 72°C1분.
      참고: 각 프라이머 세트에 대해 제조업체가 제안한 Tm을 기준으로 용융 온도를 결정합니다. 각 앰플리곤(1분/kb)의 길이를 기준으로 적절한 연장 시간을 결정합니다.
3. 증폭 제품을 1% 아가로즈 젤로 시각화합니다. 각 DNA 생성물의 10 μL과 2 μL의 로딩 버퍼를 각 우물에 추가하고 1 시간 동안 8V / cm에서 실행하십시오.
4. 겔은 DNA 겔 추출 키트와 제조업체의 프로토콜을 사용하여 각 앰플리폰을 정화합니다. DNase 자유 물 50 μL을 추가하고 즉시 원심 분리하여 기둥에서 앰플리칸을 다루하십시오.
5. EcoRI 엔도너클레스 소화를 사용하여 pUC19 클로닝 벡터를 선형화합니다. 튜브에 pUC19 1 μg, 물 17 μL, 반응 버퍼 2 L 및 EcoRI1 μL (20 단위)을 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양한다.
   1. 1%의 아가로즈 겔에 1%의 아가로즈 겔이 1h에 대해 실행하여 겔로부터 밴드를 소비하고, 1.4단계에서 설명한 바와 같이 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 제품을 정제한다.
6. 마스터 믹스 키트를 사용하여 모든 개별, 겔 정제 앰플리온 및 선형화된 벡터를 리게이트.
   1. PCR 튜브에, 선형화된 pUC19 및 각 앰플리코(5' 암, EGFP, 짧은 3' 암, E/L 프로모터-mCherry-E3L 카세트, 3'arm)의 0.2 pmol을 추가합니다. DNase 자유 물을 최종 부피 10 μL에 추가한 다음 DNA 어셈블리 마스터 믹스 10 μL을 추가합니다. 1 시간 동안 50 °C에서 샘플을 배양하십시오.
7. 앞서 설명한 대로 1.6단계에서 조립된 제품의 2 μL로 화학적으로 유능한 대장균을 ^변환,27.26 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 아가로즈 플레이트에 형질전환된 세포의 플레이트 100 μL. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
8. 잘 고립 된 식민지를 선택하고 100 μg / mL ampicillin루리아 국물을 포함하는 튜브에 개별 식민지를 전송합니다. 225 rpm에서 흔들면서 37 °C에서 밤새 튜브를 배양합니다.
9. 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 밤새 배양으로부터 플라스미드를 분리합니다. 분광광도계를 사용하여 DNA의 농도와 순도를 확인합니다. 1.8과 2.0 사이의 A260/A280 비율은 허용됩니다.
10. Sanger 시퀀싱용 플라스미드를 제출하여 원하는 복제 제품이 올바른지 확인합니다. DNA를 -20°C에 저장합니다.

2. 재조합 바이러스 생성

1. 6웰 플레이트에서 1.0(MOI = 1.0)의 감염의 복합성에서 재결합될 바이러스와 적합한 세포의 동시 단층을 감염시다. 감염된 세포를 37°C 및 5%_CO2에서 1시간 동안 배양한다. 그런 다음 매체를 흡인하고 신선한 DMEM으로 교체하십시오. 감염된 세포를 37°C 및 5%_CO2에서배양한다.
   참고: K3L^22가결여된 백시니아 바이러스와 같은 복제 유능한 바이러스의 경우, 유럽 토끼 신장 세포주 RK13(ATCC #CCL-37) 또는 BSC-40과 같은 세포주가 적절하다. 그러나, 본 논문에 기재된 바이러스와 같은 복제 결핍 바이러스의 경우, PKR 길항제 E3L 및 K3L이 모두 결여되어 있으며, 트랜스 또는 PKR 녹아웃 또는 녹아웃 세포에서 이들 두 유전자를 발현하는 보완적인 세포주가 요구된다.
2. 감염된 세포를 500 ng의 벡터로 트랜스펙트하여 제조자의 프로토콜에 따라 시판되는 형질감염 시약을 사용하여 1.10단계에서 생성및 검증하였다. 세포를 37°C및 5%_CO2에서 48시간 동안 배양한다.
   참고: E3L 및 K3L이 모두 결여된 백시니아 바이러스를 사용하는 경우, PKR-매개 선택적 압력은 재결합된 바이러스의 선택을 유도하고 이들 세포에서 mCherry-E3L 융합 단백질의 발현을 유지한다. 원하는 경우, 전체 플라스미드 대신에 형질전환에 사용할 인서트만PCR증폭이 가능해야 한다.
3. 48 시간 감염 후, 감염된 단층을 수확. 어떤 경우에는 피펫팅으로 세포를 수확 할 수 있지만 여전히 단단히 부착된 경우 셀 스크레이퍼로 수확하십시오. 세포를 세 번 동결 해동한 다음 50 % 진폭에서 15 s용 용해액을 초음파 처리합니다. 사용 준비가 될 때까지 이 용해액을 -80°C에서 보관하십시오.
4. 10배 연속적으로 10배 희석된 용해액을^10-1 에서^{10-6 단계로} 희석하여 용해물의 120 μL을 DMEM(10-1)에 1080 μL에 첨가하고, 이 희석의 1080 μL을 DMEM(10-2)의 1080 μL에 추가함으로써, 이 과정을 4회 더 반복한다.^-1-2 PKR 유능한 세포주, 이 경우 RK13 세포의 개별, 수렴웰에 각 희석의 1 mL을 추가한다.
   1. 감염된 세포를 37°C 및 5%_CO2에서 1시간 동안 배양한다. 그런 다음 배지를 흡인하고 37 °C 및 5 %_CO2에서감염된 세포를 인큐베이션 하는 신선한 DMEM으로 대체합니다.
5. 24 48 시간 감염 후, 형광 현미경 검사법에 의해 재조합 바이러스를 식별합니다. 재조합 바이러스로부터의 플라크는 mCherry-E3L 융합 유전자의 통합으로 인해 적색 형광을 발현한다(도2). PKR 억제제가 없는 바이러스가 처음에 사용된 경우, 모든 플라크는 재조합 바이러스를 함유할 것이다.
6. 플라크는 RK13 세포에 재조합 바이러스를 세 번 정화한다. 플라크 정화의 최종 라운드 후, 모든 플라크는 빨간색 형광을 표현해야한다.
7. 2.6단계에서 플라크 정제 된 적색 형광 바이러스로 VACV PKR 억제제 E3L 및 K3L (RK13 + E3L + K3L 세포^28)을발현하는 RK13 세포의 동시 6 웰 플레이트를 감염시다. 우물 당 약 50-100 개의 플라크를 목표로합니다.
   참고: 이들 세포는 트랜스에서 VACV PKR 길항제를 제공하고 mCherry-E3L 융합 유전자를 유지하기 위해 PKR 매개 선택적 압력을 완화하여 재조합 바이러스의 "무분별한" 생성을 촉진시킨다.
8. EVOS2 현미경을 사용하여 형광 현미경 검사법에 의해 붕괴 된 바이러스를 식별하고, GFP 필터 큐브 (흥분 : 470 / 22, 방출 : 525 /50) 및 RFP 필터 큐브 (흥분 : 531/40, 방출 : 593 /40).
   참고: mCherry-E3L 융합 유전자가 손실되는 빈도는 약 2.5%입니다(표2). EGFP가 마커 유전자로 포함되지 않는 경우, mCherry-E3L 융합 유전자를 잃은 돌연변이 바이러스로부터의 플라크는 무색일 것이다.
9. RK13+E3L+K3L 세포에 녹색 전용(VC-R4) 또는 무색 플라크(E3L)를 세 번 정화합니다. 플라크가 빨간색으로 번광되지 않도록 하십시오.
10. mCherry-E3L의 손실 과 PCR 및 Sanger 시퀀싱에 의한 예상 돌연변이의 존재를 확인합니다.
    참고: 관심 있는 유전자 또는 돌연변이가 PKR 억제 활성을 갖지 않는 경우, 재조합 바이러스는 RK13+E3L+K3L 세포 또는 동등한 PKR 억제 또는 PKR 결핍 세포주에서 성장해야한다(그림 3).

결과

그림 1에서 다이어그램으로 된 절차를 사용하여 이미 K3L(vP872)에 대해 삭제된 바이러스에서 E3L을 EGFP로 대체하여 PKR 길항제 E3L및 K3L이 결여된 VACV를 생성했습니다. 도 2는 MCherry-E3L의 바이러스 발현을 나타내는 PKR 유능한 RK13 세포에서 적색 형광 플라크뿐만 아니라 RK13+E3L+K3L 세포에서 발현된 EGFP를 나타내며, mCherry-E3L 선택 마커의 붕괴 및 E3L의 붕괴를 확?...

토론

여기서 우리는 최종 재조합 바이러스에서 외래 DNA를 유지하지 않고 재조합 백시니아 바이러스를 생성하기 위한 과도 마커 선택 ^{전략(32)의} 변이를 제시한다. 우리의 전략은 항생제와 같은 선택적 압력의 그밖 양식 보다는 오히려 호스트 항바이러스 단백질 PKR에 의해 중재된 선택적인 압력을 이용합니다. 숙주 항 바이러스 유전자의 사용은 세포에 화학적으로 유도 된 현상형 변화...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	High-fidelity polymerase used in PCR
Ampicillin	ThermoFisher Scientific	11593027	Bacterial selective agent
Disposable Cell Scrapers	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging system	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Transfection reagent
Luria Bertani (LB) Broth	Gibco	10855021	Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kit	NEB	T1020L	Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kit	NEB	T1010L	Miniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110	Sonicator for virus lysates
RK13 cells	ATCC	CCL-37	Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture plates	VWR	10062-892	Cell culture plates