Geração rápida e perfeita de vírus de varíola recombinante usando faixa de host e seleção visual

Resumo

Este é um método para gerar vírus de vaccinia recombinante "sem scarless" usando seleção de alcance de host e identificação visual de vírus recombinantes.

Resumo

O vírus da vaccinia (VACV) foi fundamental na erradicação do vírus variola (VARV), o agente causador da varíola, da natureza. Desde sua primeira utilização como vacina, o VACV tem sido desenvolvido como vetor para vacinas terapêuticas e como um vírus oncolítico. Essas aplicações aproveitam o genoma facilmente manipulado do VACV e a ampla gama de hospedeiros como uma excelente plataforma para gerar vírus recombinantes com uma variedade de aplicações terapêuticas. Vários métodos foram desenvolvidos para gerar VACV recombinante, incluindo métodos de seleção de marcadores e seleção dominante transitória. Aqui, apresentamos um refinamento de um método de seleção de alcance de host, juntamente com a identificação visual de vírus recombinantes. Nosso método aproveita a pressão seletiva gerada pelo hospedeiro da proteína antiviral kinase R (PKR) juntamente com um gene de fusão fluorescente expressando mCherry-tagged E3L, um dos dois antagonistas VACV PKR. O, incluindo o gene de interesse e a fusão mCherry-E3L é ladeado por seqüências derivadas do genoma VACV. Entre o gene de interesse e mCherry-E3L é uma região menor que é idêntica aos primeiros ~150 nucleotídeos do braço de 3', para promover a recombinação homóloga e a perda do gene mCherry-E3L após a seleção. Demonstramos que este método permite uma geração eficiente e perfeita de rVACV em uma variedade de tipos de células sem exigir seleção de medicamentos ou triagem extensiva para vírus mutantes.

Introdução

O vírus da vaccinia (VACV) foi fundamental para a primeira erradicação bem sucedida de um patógeno humano, o vírus variola (VARV), da natureza. Desde o extermínio do vírus variola, os vírus da varíola, incluindo o VACV, continuam a ser vírus terapêuticos úteis para a medicina humana e animal. Por exemplo, uma vacina contra o vírus da raiva baseada em VACV tem sido muito eficaz na prevenção da transmissão da raiva silvestre na Europa¹ e nos Estados Unidos². Mais recentemente, os vírus da varíola recombinantes que expressam uma variedade de moléculas antitumorais (por exemplo, anticorpos de cadeia única ou eritropoietina humana) têm visto sucesso encorajador como agentes oncolíticos^3,4,5. O VACV é particularmente atraente como vetor porque é facilmente passível de manipulação genética, possui uma ampla gama de hospedeiros, e é estável sob uma variedade de condições, permitindo fácil transporte e viabilidade vacinal no campo^6,7. Embora várias técnicas tenham sido desenvolvidas para gerar VACV recombinante para experimentos laboratoriais e geração de vacinas, as estratégias atuais para gerar esses vírus têm limitações notáveis.

Devido à utilidade do VACV, várias estratégias para gerar vírus recombinantes foram desenvolvidas. A primeira estratégia emprega recombinação homóloga para introduzir um incluindo o transgene e um gene marcador selecionável, como um gene de resistência a antibióticos. O é ladeado por dois ~500 nucleotídeos (nt) ou braços maiores direcionando o gene para um local específico no genoma viral, que é então integrado por eventos de crossover duplo^8,9,10. Essa estratégia é rápida e eficiente; no entanto, resulta em material genético extra na forma do gene marcador que pode produzir efeitos inesperados. Além disso, há um limite superior prático para o número de transgenes que pode ser introduzido limitado pelo número de marcadores selecionáveis únicos disponíveis. As estratégias transitórias de seleção dominante (TDS) abordaram essa questão facilitando a geração de vírus recombinantes "sem carro"¹¹. Usando essa estratégia, um plasmídeo contendo um gene VACV mutante e um gene marcador selecionável são integrados ao genoma viral, mas sem dna vacv adicional. Esta abordagem resulta na integração transitória de todo o plasmídeo e duplicação do gene VACV como resultado da integração por um único evento de crossover. Este intermediário é estável desde que seja mantido sob pressão de seleção, permitindo o enriquecimento deste construto. Quando a seleção é removida, a duplicação vacv permite um segundo evento de crossover que resulta na remoção do plasmídeo e posterior formação do tipo selvagem (wt) ou do vírus recombinante em uma razão aproximada de 50:50. Enquanto o TDS gera vírus recombinantes sem exigir a introdução estável de DNA estranho, vários clones de vírus devem ser rastreados para a mutação esperada por meio da análise de sequenciamento, um passo potencialmente demorado e caro.

Aqui, apresentamos uma abordagem para a geração de porcavírus recombinantes combinando os melhores aspectos de cada uma dessas abordagens, semelhante a uma abordagem que foi descrita para a replicação incompetente da vaccinia modificada Ancara^12,,13,14. Essa estratégia combina a seleção visual e de alcance do host para gerar rapidamente vírus recombinantes por eventos de crossover duplo e, posteriormente, eliminar o gene marcador selecionável por recombinação homóloga. Esta abordagem permite a rápida geração de mutantes mediados pela recombinação homóloga, com a natureza "sem brilho" das abordagens TDS, ao mesmo tempo em que não requer um passo de triagem subsequente para distinguir vírus selvagens e mutantes. Nosso método também utiliza a seleção da faixa do hospedeiro no lugar da seleção de antibióticos, eliminando o risco de alterações pheotípicas quimicamente induzidas na linha celular. Para esta abordagem, optamos por usar o host antiviral protein kinase R (PKR) como agente seletivo para gerar VACV recombinante. PKR é expresso como um monômero inativo na maioria dos tipos de células¹⁵. Ao vincular o RNA de dupla revasão (dsRNA) nos domínios n-terminal de ligação de dsRNA, o PKR dimeriza e é autofosforilado¹⁶. Esta forma ativa de PKR fosforila a subunidade alfa do fator de iniciação eucariótica 2 (eIF2), inibindo, em última análise, a entrega do iniciador methionyl-tRNA ao ribossomos, impedindo assim a tradução intracelular e inibindo amplamente a replicação de muitas famílias de vírus^17,18.

Em resposta à ampla e potente atividade antiviral do PKR, muitos vírus desenvolveram pelo menos uma estratégia para impedir a ativação do PKR. A maioria dos vírus da varíola expressa dois antagonistas PKR, codificados pelos genes E3L e K3L no VACV, que antagonizam o PKR através de dois mecanismos distintos¹⁹. O E3 previne a homodimerização do PKR vinculando o RNA de dupla recadenação^20,21, enquanto o K3 atua como um inibidor pseudosubstrato, vinculando-se diretamente ao PKR ativado e, assim, inibindo a interação com o seu substrato eIF2α²². É importante ressaltar que esses dois antagonistas pkr não necessariamente inibem o PKR de todas as espécies. Por exemplo, o homolog K3 do vírus da ovelhapox inibiu fortemente o PKR das ovelhas, enquanto o homolog sheeppox E3 não mostrou uma inibição considerável de PKR^23,24. Neste estudo, apresentamos um método para usar a pressão seletiva mediada por PKR combinada com a seleção de fluorescência para gerar um REcombinante VACV excluído para E3L e K3L (VC-R4), que não pode se replicar em células competentes pkr derivadas de espécies diversas. Este vírus recombinante fornece um excelente fundo para a geração rápida de vírus recombinantes que expressam genes sob controle do promotor Nativo E3L.

Protocolo

1. Gerar o vetor de recombinação

1. Projete primers para gerar o de seleção. Projete cada amplicon individual com seqüências sobrepostas com amplicons vizinhos e o vetor para facilitar a montagem enzimática isotérmica de moléculas de DNA, também chamada de montagem gibson, usando qualquer uma das várias ferramentas de design de primer on-line.
   NOTA: Este protocolo também pode ser concluído usando métodos tradicionais de clonagem baseadaem endonuclease. Nesse caso, os primers de design com os locais de restrição apropriados em vez de com seqüências sobrepostas.
2. Utilizando os primers projetados na etapa 1.1, o PCR amplifica os seguintes elementos em ordem de 5' a 3'(Figura 1): ~500 nucleotídeos da região genômica VACV 5' do braço E3L (5'), EGFP ou o gene de interesse, ~150 nucleotídeos da região genômica VACV imediatamente 3' de E3L (braço curto de 3'),um promotor de poxvirus precoce/tardio sintético²⁵, o gene de fusão mCherry-E3L, e ~500 nucleotídeos da região genômica VACV 3' de E3L, incluindo o braço curto de 3' (braço longo de 3').
   1. Em um tubo PCR, adicione os reagentes na seguinte ordem para cada amplicon: 17 μL de água livre de DNase, 1,2 μL de cada primer (concentração inicial = 10 μM, concentração final = 0,5 μM), 5 μL de tampão de reação PCR de 5x, DNA do modelo (10 ng para amplicons amplificados a partir de plasmídeos: EGFP e E/L promotor-mCherry-E3L cassete; 100 ng para amplicons amplificados a partir de DNA genômico viral: 5' e 3' braços), e 0,5 μL de DNA polimerase. Ajuste o volume de água adicionado para um volume de reação final de 50 μL.
      NOTA: A concentração do DNA do modelo deve ser empiricamente determinada, mas geralmente começamos com 10 ng/reação.
   2. Coloque o tubo em um termociclador e derreta o DNA a 98 °C por 30 s e use 25 rodadas de um protocolo PCR de três etapas: 98 °C para 5 s, 55 °C para 10 s e 72 °C para 1 min.
      NOTA: Determine a temperatura de fusão com base no Tm sugerido pelo fabricante para cada conjunto de primer. Determine o tempo de extensão apropriado com base no comprimento de cada amplicon (1 minuto/kb).
3. Visualize os produtos de amplificação em um gel de agarose de 1%. Adicione 10 μL de cada produto de DNA e 2 μL de tampão de carga para cada poço, e execute a 8 V/cm por 1 h.
4. O gel purifica cada amplicon usando um kit de extração de gel de DNA e o protocolo do fabricante. Eluie os amplicons da coluna adicionando 50 μL de água livre de DNase e imediatamente centrifugando.
5. Linearize o vetor de clonagem pUC19 utilizando digestão de endonuclease EcoRI. A um tubo, adicione 1 μg de pUC19, água a um volume de 17 μL, 2 L de tampão de reação e 1 μL (20 unidades) de EcoRI. Incubar a 37 °C por 1h.
   1. Visualize os produtos de amplificação em um gel de agarose de 1% executado a 8 V/cm por 1 h. Excise a banda do gel e purifique o produto usando o kit de extração de gel de DNA conforme descrito na etapa 1.4.
6. Ligatodos os amplicons individuais, purificados em gel e o vetor linearizado usando um kit de mistura mestre.
   1. Em um tubo PCR, adicione 0,2 pmol de pUC19 linearizado e cada amplicon (braço de 5', EGFP, braço curto de 3'', E/L promoter-mCherry-E3L, 3'arm). Adicione água livre de DNase a um volume final de 10 μL e, em seguida, adicione 10 μL de mistura mestre de montagem de DNA. Incubar amostras a 50 °C por 1 h.
7. Transforme e. coli quimicamente competente com 2 μL do produto montado a partir da etapa 1.6 como descrito anteriormente^26,27. Placa de 100 μL das células transformadas em placas de agarose LB contendo ampicillina de 100 μg/mL. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
8. Escolha colônias bem isoladas e transfira colônias individuais para tubos contendo caldo luria com ampicillina de 100 μg/mL. Incubar os tubos durante a noite a 37 °C enquanto agita a 225 rpm.
9. Isole os plasmídeos da cultura durante a noite usando um miniprep plasmídeo. Verifique a concentração e pureza do DNA usando um espectrofotômetro. Uma razão A260/A280 entre 1,8 e 2,0 é aceitável.
10. Envie os plasmídeos para sequenciamento de Sanger para determinar se o produto de clonagem desejado está correto. Armazene o DNA a -20 °C.

2. Gerar o vírus recombinante

1. Infectar uma monocamada confluente de células adequadas com o vírus a ser recombinada em uma multiplicidade de infecção de 1,0 (MOI = 1,0) em uma placa de 6 poços. Incubar as células infectadas a 37 °C e 5% de CO₂ por 1 h. Em seguida, aspirar o meio e substituí-lo por DMEM fresco. Incubar as células infectadas a 37 °C e 5% de CO₂.
   NOTA: Para a replicação, é apropriado para a replicação de vírus competentes, como um vírus de vacinação que não tenha K3L²², uma linha celular como a linha europeia de células renais de coelho RK13 (ATCC #CCL-37) ou BSC-40. No entanto, para a replicação de vírus deficientes, como o vírus descrito neste artigo, sem ambos os antagonistas PKR E3L e K3L, uma linha celular complementar expressando esses dois genes em células trans ou PKR knock-down ou knock-out são necessárias.
2. Transfect as células infectadas com 500 ng do vetor gerado e validado na etapa 1.10 utilizando um reagente de transfecção comercialmente disponível seguindo o protocolo do fabricante. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂ por 48 h.
   NOTA: Se o uso de um vírus de vaccinia sem E3L e K3L, a pressão seletiva mediada por PKR conduzirá a seleção de vírus recombinados e manterá a expressão da proteína de fusão mCherry-E3L nessas células. Se desejar, também deve ser possível amplificar apenas a inserção para uso para transfecção em vez de todo o plasmídeo.
3. 48 horas após a infecção, colher a monocamada infectada. Em alguns casos, as células podem ser colhidas por pipetting, mas se ainda estiverem firmemente aderidas, colhe-as com um raspador de células. Congele as células três vezes e, em seguida, sônica os lisatos por 15 s a 50% de amplitude. Guarde este lysate a -80 °C até estar pronto para usar.
4. Diluir em série 10 vezes o lysato colhido na etapa 2.3 de 10^-1 a 10^-6 adicionando 120 μL do lysate a 1080 μL de DMEM (10^-1), e depois adicionando 120 μL desta diluição a 1080 μL de DMEM (10^-2), e repetindo este processo mais quatro vezes. Adicione 1 mL de cada diluição a um indivíduo, confluente bem de uma linha celular competente PKR, neste caso células RK13.
   1. Incubar as células infectadas a 37 °C e 5% de CO₂ por 1 h. Em seguida, aspirar o meio e substituí-lo por dmem fresco Incubar as células infectadas a 37 °C e 5% CO₂.
5. 24 a 48 horas após a infecção, identificar vírus recombinantes por microscopia de fluorescência. Placas de vírus recombinantes expressam fluorescência vermelha devido à integração do gene de fusão mCherry-E3L(Figura 2). Se um vírus desprovido de inibidores de PKR foi usado inicialmente, todas as placas conterão vírus recombinante.
6. Placa purifica vírus recombinantes três vezes em células RK13. Após a rodada final de purificação da placa, todas as placas devem expressar fluorescência vermelha.
7. Infectar uma placa de 6 poços confluente de células RK13 expressando os inibidores DE PKR VACV E3L e K3L (células RK13+E3L+K3L²⁸) com o vírus fluorescing vermelho purificado da placa do passo 2.6. Aponte para aproximadamente 50-100 placas por poço.
   NOTA: Essas células fornecem os antagonistas do VACV PKR em trans e aliviam a pressão seletiva mediada pelo PKR para manter o gene de fusão mCherry-E3L, promovendo assim a geração "sem carro" do vírus recombinante.
8. Identificar vírus colapsados por microscopia de fluorescência usando um microscópio EVOS2, e um cubo de filtro GFP (Excitação: 470/22, Emissão: 525/50) e um cubo de filtro RFP (Excitação: 531/40, Emissão: 593/40).
   NOTA: A frequência em que o gene de fusão mCherry-E3L é perdido é de aproximadamente 2,5%(Tabela 2). Se o EGFP não for incluído como um gene marcador, placas de vírus mutantes que perderam o gene de fusão mCherry-E3L serão incolores.
9. Placa purificar placas verdes (VC-R4) ou incolores (E3L) três vezes em células RK13+E3L+K3L. Certifique-se de que nenhuma placa fluoresce vermelho.
10. Confirme a perda de mCherry-E3L e a presença da mutação esperada pelo sequenciamento PCR e Sanger.
    NOTA: Se o gene ou mutação de interesse não tiver atividade inibitória de PKR, os vírus recombinantes devem ser cultivados em células RK13+E3L+K3L ou em uma linha celular deficiente de PKR equivalente(Figura 3).

Resultados

Utilizou-se o procedimento diagramado na Figura 1 para gerar um VACV sem antagonistas PKR E3L e K3L, substituindo E3L por EGFP em um vírus já excluído para K3L (vP872). A Figura 2 apresenta placas fluorescentes vermelhas em células RK13 competentes do PKR indicativas de expressão viral de mCherry-E3L, bem como EGFP expressas em células RK13+E3L+K3L confirmando a perda de E3L e o colapso do marcador de seleção mCherry-E3L. A Figura 3<...

Discussão

Aqui apresentamos uma variação de uma estratégia transitória de seleção de marcadores ³² para gerar vírus de vaccinia recombinantes sem reter DNA estranho no vírus recombinante final. Nossa estratégia usa pressão seletiva mediada pelo PKR de proteína antiviral hospedeira em vez de outras formas de pressão seletiva, como antibióticos. O uso de genes antivirais hospedeiros elimina a possibilidade de alterações pheotípicas quimicamente induzidas nas células, ou aumento do risco de mu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	High-fidelity polymerase used in PCR
Ampicillin	ThermoFisher Scientific	11593027	Bacterial selective agent
Disposable Cell Scrapers	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging system	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Transfection reagent
Luria Bertani (LB) Broth	Gibco	10855021	Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kit	NEB	T1020L	Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kit	NEB	T1010L	Miniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110	Sonicator for virus lysates
RK13 cells	ATCC	CCL-37	Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture plates	VWR	10062-892	Cell culture plates