JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Это метод для создания "безшрамов" рекомбинантных вирусов vaccinia с использованием выбора хоста и визуальной идентификации рекомбинантных вирусов.

Аннотация

Вирус Вакцинии (VACV) сыграл важную роль в искоренении вируса вариолы (VARV), возбудителя оспы, от природы. С момента своего первого использования в качестве вакцины, VACV был разработан в качестве переносчика терапевтических вакцин и в качестве онколитического вируса. Эти приложения используют легко управляемый геном VACV и широкий диапазон хост в качестве выдающейся платформы для создания рекомбинантных вирусов с различными терапевтическими приложениями. Для создания рекомбинантного VACV было разработано несколько методов, включая методы выбора маркеров и переходный доминирующий выбор. Здесь мы представляем уточнение метода выбора диапазона хоста в сочетании с визуальной идентификацией рекомбинантных вирусов. Наш метод использует селективное давление, генерируемое принимающей противовирусной протеиной киназы R (PKR) в сочетании с флуоресцентным геном синтеза, выражающим mCherry-tagged E3L, один из двух антагонистов VACV PKR. Кассета, включая интересуемый ген и слияние mCherry-E3L, окружена последовательностями, полученными из генома VACV. Между геном интереса и mCherry-E3L находится меньшая область, идентичная первым нуклеотидам 3' руки, чтобы способствовать гомологионной рекомбинации и потере гена mCherry-E3L после отбора. Мы демонстрируем, что этот метод позволяет эффективное, бесшовное генерации rVACV в различных типах клеток, не требуя отбора лекарств или тщательного скрининга на вирусы-мутанты.

Введение

Вирус Ваккиния (VACV) сыграл важную роль в первом успешном искоренении патогена человека, вируса вариолы (VARV), от природы. С момента уничтожения вируса вариолы, поксвирусы, включая VACV, продолжают быть полезными терапевтическими вирусами как для медицины человека, так и для животных. Например, вакцина против бешенства на основе VACV была очень эффективной в предотвращении передачи сильватического бешенства в Европе1 и Соединенных Штатах2. Совсем недавно, рекомбинантные поксвирусы, выражающие различные противоопухолевые молекулы (например, одноцепные антитела или человеческий эритропоэтин) видели обнадеживающий успех, как онколитические агенты3,4,5. VACV особенно привлекателен в качестве вектора, потому что он легко поддается генетическим манипуляциям, обладает широким диапазоном хостов, и он стабилен в различных условиях, что позволяет легко транспортировать и жизнеспособность вакцины в поле6,7. Хотя было разработано несколько методов для создания рекомбинантных VACV для лабораторных экспериментов и создания вакцин, нынешние стратегии создания этих вирусов имеют заметные ограничения.

Из-за полезности VACV, несколько стратегий для создания рекомбинантных вирусов были разработаны. Первая стратегия использует гомологию рекомбинации для введения кассеты, включая трансген и выбираемый ген маркера, такой как ген устойчивости к антибиотикам. Кассета окружена двумя нуклеотидами (nt) или более крупными руками, направляющими ген к определенному участку в вирусном геноме, который затем прочно интегрируется двойными событиями кроссовера8,,9,,10. Эта стратегия является быстрой и эффективной; однако, это приводит к дополнительному генетическому материалу в виде гена маркера, который может привести к неожиданным эффектам. Кроме того, существует практический верхний предел числа трансгенов, который может быть введен ограниченным числом уникальных доступных маркеров. Переходный доминирующий выбор (TDS) стратегии рассмотрели этот вопрос путем облегчения генерации "безшрамов" рекомбинантных вирусов11. Используя эту стратегию, плазмида, содержащая мутантный ген VACV и выбираемый ген маркера, интегрирована в вирусный геном, но без дополнительного флангового ДНК VACV. Такой подход приводит к переходной интеграции всей плазмиды и дублированию гена VACV в результате интеграции одним событием кроссовера. Этот промежуточный является стабильным до тех пор, пока он поддерживается под давлением отбора, что позволяет обогащать эту конструкцию. При удалении выбора дублирование VACV позволяет второе событие кроссовера, что приводит к удалению плазмиды и последующему образованию либо дикого типа (WT) или рекомбинантного вируса в приблизительном соотношении 50:50. В то время как TDS генерирует рекомбинантные вирусы, не требуя стабильного внедрения чужеродных ДНК, несколько клонов вирусов должны быть проверены на ожидаемую мутацию путем секвенирования анализа, потенциально отнимающего много времени и дорогостоящий шаг.

Здесь мы представляем подход к генерации рекомбинантных поксвирусов, сочетающих лучшие аспекты каждого из этих подходов, похожий на подход, который был описан для репликации некомпетентных модифицированных vaccinia Анкара12,13,14. Эта стратегия сочетает в себе визуальный выбор диапазона и диапазона хоста для быстрого генерации рекомбинантных вирусов путем двойного кроссовера событий, а затем устранить выбираемый ген маркера гомологической рекомбинации. Такой подход позволяет быстрое поколение мутантов, опосредованное гомологичным рекомбинацией, с "безшрамным" характером подходов TDS, не требуя при этом последующего этапа скрининга для различения вирусов дикого типа и мутантов. Наш метод также использует выбор диапазона хоста вместо выбора антибиотиков, устраняя риск химически индуцированных фенотипических изменений в клеточной линии. Для этого подхода мы решили использовать противовирусную протеину киназы R (PKR) в качестве селективного агента для создания рекомбинантного VACV. PKR выражается как неактивный мономер в большинстве типов клеток15. При связывании двухцепочечной РНК (dsRNA) в N-терминалd dsRNA-связывающих доменов, PKR димеризирует и аутофосфорилируется16. Эта активная форма PKR фосфорилаты альфа-субъединицу эукариотического фактора инициации 2 (eIF2), в конечном счете, препятствуя доставке инициатора метионил-ТРНА к рибосоме, тем самым предотвращая внутриклеточный перевод и широко препятствуя репликации многих вирусных семейст. 17,18.

В ответ на широкую и мощную противовирусную активность PKR, многие вирусы разработали по крайней мере одну стратегию для предотвращения активации PKR. Большинство поксвирусов выражают два антагониста PKR, кодируемого генами E3L и K3L в VACV, которые антагонизируют PKR через два различных механизма19. E3 предотвращает гомемеризацию PKR путем связывания двухцепочечной РНК20,21, в то время как K3 действует как ингибитор псевдосубстрата, связывая непосредственно с активированным PKR и тем самым препятствуя взаимодействию с его субстратом eIF2 '22. Важно отметить, что эти два антагонистов PKR не обязательно подавляют PKR от всех видов. Например, Гомолог K3 от вируса овцеводческой оспы сильно ингибирует PKR от овец, в то время как овчарка E3 омолог не показал значительного торможения PKR23,24. В этом исследовании мы представляем метод использования PKR-опосредованного селективного давления в сочетании с выбором флуоресценции для создания рекомбинантного VACV, удаленного для E3L и K3L (VC-R4), который не может реплицироваться в компетентных клетках PKR, полученных из различных видов. Этот рекомбинантный вирус обеспечивает отличный фон для быстрого поколения рекомбинантных вирусов, выражающих гены под контролем родного E3L-промоутера.

протокол

1. Создание вектор рекомбинации

  1. Дизайн грунтовки для создания выбора кассеты. Дизайн каждого отдельного амплекона с перекрывающимися последовательностями с соседними амплеонами и вектором для облегчения изетермальной ферментативной сборки молекул ДНК, также называемой гибсон сборки, используя любой из нескольких онлайн грунтовые инструменты дизайна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол также может быть завершен с использованием традиционных методов клонирования на основе ограничения. В этом случае проектные праймеры с соответствующими местами ограничения, а не с перекрывающимися последовательностями.
  2. Используя грунтовки, разработанные в шаге 1.1, ПЦР усиливают следующие элементы в порядке от 5' до 3'(Рисунок 1):500 нуклеотидов геномной области VACV 5' E3L (5' рука), EGFP или ген интереса, 150 нуклеотидов из геномной области VACV сразу 3' E3L (короткая 3' рука), синтетический ранний/поздний предостереженный промоутер25, ген синтеза mCherry-E3L и 500 нуклеотидов из геномной области VACV 3' E3L, включая короткую 3' руку (длинная 3' рука).
    1. В трубке ПЦР добавьте реагенты в следующем порядке для каждого ампликона: 17 л свободной воды DNase, 1,2 л каждой грунтовки (начальная концентрация - 10 мкм, окончательная концентрация 0,5 мкм), 5 л 5-x пЦР-буфера реакции, шаблон ДНК (10 нг для амплидонов, усиленных плазмидами: EGFP и E/L промоутер-mCherry-E3L кассета; 100 нг для ампликонов, усиленных из вирусной геномной ДНК: 5' и 3'рукоятки) и 0,5 л ДНК полимера. Отрегулируйте объем добавленной воды для окончательного объема реакции 50 Зл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация ДНК шаблона должна быть эмпирически определена, но мы обычно начинаем с 10 нг/реакции.
    2. Поместите трубку (ы) в термоциклер, и растопить ДНК на 98 градусов по Цельсию в течение 30 с, а затем использовать 25 раундов трехступенчатого протокола ПЦР: 98 градусов по Цельсию для 5 с, 55 градусов по Цельсию для 10 с, и 72 C в течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите температуру плавления на основе предложенного производителем ТМ для каждого набора грунтовки. Определить соответствующее время продления на основе длины каждого амблона (1 минута/кб).
  3. Визуализируйте продукты усиления на 1% агарозный гель. Добавьте 10 кЛ каждого продукта ДНК и 2 л погрузочного буфера к каждой скважине, и бегите на уровне 8 В/см в течение 1 ч.
  4. Гель очищает каждый ампромсон с помощью комплекта для извлечения геля ДНК и протокола производителя. Выясните ампликоны из колонны, добавив 50 зл DNase свободной воды и сразу же центрифугирования.
  5. Линейная линия pUC19 клонирования вектор с помощью EcoRI эндонуклеазы пищеварения. В трубку добавьте 1 мкг pUC19, воды в объеме 17 Л, 2 л реакционного буфера и 1 кЛ (20 единиц) EcoRI. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
    1. Визуализируйте продукты усиления на 1% агарозный гель работать на 8 V/cm в течение 1 ч. Акциз полосы из геля, и очистить продукт с помощью комплекта экстракта геля ДНК, как описано в шаге 1.4.
  6. Ligate все отдельные, гель очищенных ампликонов и линейный вектор с помощью комплекта мастер смеси.
    1. К трубке ПЦР добавьте 0,2 моль линейного pUC19 и каждый ампликон (5' рука, EGFP, короткая 3' рука, E/L промоутер-mCherry-E3L кассета, 3'рука). Добавьте воду dNase free в окончательный объем в 10 зл, а затем добавьте 10 кЛ мастер-микса сборки ДНК. Инкубировать образцы при 50 градусах по Цельсию на 1 ч.
  7. Преобразуйте химически компетентную кишечную палочку с 2 зл и собранным продуктом со ступени 1.6, как уже говорилосьранее, 26,,27. Плита 100 л transformed клеток на пластинах агарозы LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллин. Инкубировать тарелки на ночь при 37 градусах Цельсия.
  8. Выберите хорошо изолированные колонии и перенесите отдельные колонии в трубки, содержащие бульон Лурии с 100 мкг/мл ампициллин. Инкубировать трубки на ночь при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 225 об/мин.
  9. Изолировать плазмиды от ночной культуры с помощью плазмидного мини-комплекта. Проверьте концентрацию и чистоту ДНК с помощью спектрофотометра. Соотношение A260/A280 между 1,8 и 2,0 приемлемо.
  10. Отправить плазмиды для секвенирования Сэнгера, чтобы определить, является ли желаемый продукт клонирования правильным. Храните ДНК при -20 градусах Цельсия.

2. Генерация рекомбинантного вируса

  1. Заразить сопливый монослой подходящих клеток с вирусом, который будет рекомбинированным при многообразии инфекции 1,0 (MOI No 1.0) в 6-хорошей пластине. Инкубировать инфицированные клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 1 ч. Затем аспирируйте среду и заменить его свежим DMEM. Инкубировать инфицированные клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для репликации компетентных вирусов, таких как вирус вакцины, который не хватает K3L22, клеточной линии, такие как европейская линия клеток кролика почки RK13 (ATCC #CCL-37) или BSC-40 является целесообразным. Однако для репликации дефицитных вирусов, таких как вирус, описанный в этой работе, не хватает как PKR антагонистов E3L и K3L, дополняющая клеточная линия, выражающая эти два гена в транс или PKR нокдаун или нокаут клетки не требуется.
  2. Трансфект инфицированных клеток с 500 нг вектора, генерируемых и проверенных в шаге 1.10 с использованием коммерчески доступного трансфекционного реагента в соответствии с протоколом производителя. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании вируса вакциноза не хватает как E3L и K3L, PKR-опосредованного селективного давления будет стимулировать выбор рекомбинированных вирусов и поддерживать экспрессию белка синтеза mCherry-E3L в этих клетках. При желании, она также должна быть возможность ПЦР усилить только вставку для использования для трансфекции вместо всей плазмиды.
  3. 48 часов после инфекции, урожай инфицированных монослой. В некоторых случаях, клетки могут быть собраны путем pipetting, но если они по-прежнему плотно придерживаются, урожай их с помощью клеточного скребок. Заморозить-оттепель клетки три раза, а затем sonicate lysates в течение 15 с при 50% амплитуды. Храните этот лизат при -80 градусов до готовности к использованию.
  4. Последовательно 10 раз разбавить лисат, собранный в шаге 2,3 от 10-1 до 10-6, добавив 120 л лисата до 1080 л DMEM (10-1), а затем добавить 120 л этого разбавления до 1080 л DMEM (10-2), и повторение этого в четыре раза. Добавьте 1 мл каждого разбавления к отдельному, сольствуя хорошо PKR компетентной клеточной линии, в данном случае клетки RK13.
    1. Инкубировать инфицированные клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 1 ч. Затем аспирировать среду и заменить его свежим DMEM инкубировать инфицированных клеток при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
  5. От 24 до 48 часов после инфекции, выявление рекомбинантных вирусов с помощью флуоресценционной микроскопии. Таблички от рекомбинантных вирусов выражают красную флуоресценцию из-за интеграции гена синтеза mCherry-E3L(рисунок 2). Если вирус, лишенный ингибиторов PKR был использован первоначально, все бляшки будут содержать рекомбинантный вирус.
  6. Бляшки очищают рекомбинантные вирусы три раза на клетках RK13. После заключительного раунда очистки бляшек, все бляшки должны выразить красную флуоресценцию.
  7. Заразите конное 6-ну хорошо пластины КЛЕТОк RK13, выражающие ингибиторы VACV PKR E3L и K3L (RK13-E3L-K3L клетки28) с зубной налет-очищенный красный флуоресценции вируса от шага 2.6. Цель для примерно 50-100 бляшек на скважину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки обеспечивают ANtagonists VACV PKR в транс и облегчить PKR-опосредованного селективного давления для поддержания мЧерри-E3L синтеза гена, тем самым способствуя "безшрамов" поколения рекомбинантного вируса.
  8. Определите разрушаемые вирусы с помощью флуоресценции с помощью микроскопа EVOS2 и кубика фильтра GFP (Excitation: 470/22, Излучение: 525/50) и кубик фильтра RFP (Возбуждение: 531/40, Выброс: 593/40).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частота, с которой теряется ген синтеза mCherry-E3L, составляет примерно 2,5%(таблица 2). Если EGFP не включен в качестве гена маркера, бляшки от мутантных вирусов, которые потеряли ген синтеза mCherry-E3L, будут бесцветными.
  9. Табличка очищает только зеленый (VC-R4) или бесцветные бляшки (E3L) три раза на клетках RK13-E3L-K3L. Убедитесь, что никакие бляшки не флуоресцирует красный цвет.
  10. Подтвердите потерю mCherry-E3L и наличие ожидаемой мутации пЦР и секвенированием Sanger.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ген или мутация интереса не имеет PKR ингибирующей активности, рекомбинантные вирусы должны быть выращены на RK13'E3L-K3L клеток или эквивалентНых PKR-ингибируется или PKR недостаточной клеточной линии (Рисунок 3).

Результаты

Мы использовали процедуру диаграммы на рисунке 1 для создания VACV не хватает как PKR антагонистов E3L и K3L, заменив E3L с EGFP в вирус, уже удалены для K3L (vP872). На рисунке 2 показаны красные флуоресцентные бляшки в компетентных клетках PKR RK13, свидетельствующая о виру...

Обсуждение

Здесь мы представляем вариации переходного маркера стратегии выбора 32 для создания рекомбинантных вирусов vaccinia без сохранения чужеродных ДНК в окончательном рекомбинантный вирус. Наша стратегия использует селективное давление при посредничестве принимающей противови?...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Этот проект был профинансирован Национальными институтами здравоохранения (AI114851) в СР.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 Master MixNEBM0492LHigh-fidelity polymerase used in PCR
AmpicillinThermoFisher Scientific11593027Bacterial selective agent
Disposable Cell ScrapersThermoFisher Scientific08-100-242Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging systemThermoFisher ScientificAMAFD2000Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFPThermoFisherAMEP4651GFP Cube
EVOS Light Cube, RFPThermoFisherAMEP4652RFP Cube
GenJetSignaGen LaboratoriesSL100489Transfection reagent
Luria Bertani (LB) BrothGibco10855021Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kitNEBT1020LGel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kitNEBT1010LMiniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop OneThermoFisher ScientificND-ONE-WSpectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master MixNEBE2621LIsothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 SonicatorQsonicaQ500-110Sonicator for virus lysates
RK13 cellsATCCCCL-37Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture platesVWR10062-892Cell culture plates

Ссылки

  1. Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
  2. Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
  3. Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
  4. Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
  5. Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
  6. Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
  7. COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
  8. Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
  9. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
  10. Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
  11. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
  12. Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
  13. Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
  14. Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
  15. Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
  16. Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes. Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).
  17. Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
  18. Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
  19. Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
  20. Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
  21. Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
  22. Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
  23. Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
  24. Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
  25. Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
  26. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).
  27. Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
  28. Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
  29. Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
  30. Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
  31. Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
  32. Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159RE3L mCherry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены