Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

Zusammenfassung

Dies ist eine Methode, um "scarinant" rekombinante Vaknie-Viren mit Host-Range-Auswahl und visuelle Identifizierung von rekombinanten Viren zu generieren.

Zusammenfassung

Das Vaccinia-Virus (VACV) war maßgeblich an der Ausrottung des Variolavirus (VARV), des Erregers der Pocken, aus der Natur beteiligt. Seit seiner ersten Verwendung als Impfstoff wurde VACV als Vektor für therapeutische Impfstoffe und als onkolytisches Virus entwickelt. Diese Anwendungen nutzen das leicht zu manipulierende Genom und das breite Host-Sortiment von VACV als hervorragende Plattform, um rekombinante Viren mit einer Vielzahl von therapeutischen Anwendungen zu erzeugen. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um rekombinante VACV zu erzeugen, einschließlich Markerauswahlmethoden und transient dominante Selektion. Hier stellen wir eine Verfeinerung einer Hostrange-Auswahlmethode in Verbindung mit der visuellen Identifizierung rekombinanter Viren vor. Unsere Methode nutzt den selektiven Druck, der von der antiviralen Proteinkinase R (PKR) des Wirts erzeugt wird, gekoppelt mit einem fluoreszierenden Fusionsgen, das mCherry-tagged E3L, einen von zwei VACV PKR-Antagonisten, exzessiiert. Die Kassette, einschließlich des Gens von Interesse und der mCherry-E3L Fusion, wird von Sequenzen flankiert, die aus dem VACV-Genom abgeleitet sind. Zwischen dem Gen von Interesse und mCherry-E3L ist eine kleinere Region, die identisch mit den ersten 150 Nukleotiden des 3' Arms ist, um homologe Rekombination und Verlust des mCherry-E3L-Gens nach der Selektion zu fördern. Wir zeigen, dass diese Methode eine effiziente, nahtlose Erzeugung von rVACV in einer Vielzahl von Zelltypen ermöglicht, ohne dass eine Arzneimittelauswahl oder ein umfangreiches Screening auf mutierte Viren erforderlich ist.

Einleitung

Das Vaccinia-Virus (VACV) war entscheidend für die erste erfolgreiche Tilgung eines menschlichen Erregers, des Variolavirus (VARV), aus der Natur. Seit der Ausrottung des Variola-Virus sind Poxviren einschließlich VACV weiterhin nützliche therapeutische Viren für die Human- und Tiermedizin. Beispielsweise hat ein VACV-basierter Tollwutvirus-Impfstoff die Übertragung von sylvatischer Tollwut in Europa¹ und den Vereinigten Staaten sehr wirksam verhindert². In jüngerer Zeit haben rekombinante Poxviren, die eine Vielzahl von Anti-Tumor-Molekülen (z. B. einkettige Antikörper oder menschliches Erythropoietin) exzieren, ermutigende Erfolge als onkolytische Wirkstoffe^{gesehen 3,4,5}. VACV ist als Vektor besonders attraktiv, da es leicht für genetische Manipulationen geeignet ist, ein breites Wirtsspektrum besitzt und unter einer Vielzahl von Bedingungen stabil ist, was einen einfachen Transport und eine mögliche Lebensfähigkeit des Impfstoffs im Feld^6,7ermöglicht. Während mehrere Techniken entwickelt wurden, um rekombinante VACV für Laborexperimente und Impfstoffgenerierung zu erzeugen, haben aktuelle Strategien zur Generierung dieser Viren bemerkenswerte Einschränkungen.

Aufgrund des Nutzens von VACV wurden mehrere Strategien zur Erzeugung rekombinanter Viren entwickelt. Die erste Strategie verwendet homologe Rekombination, um eine Kassette mit dem Transgen und einem wählbaren Markergen wie einem Antibiotikaresistenzgen einzuführen. Die Kassette wird flankiert von zwei Nukleotiden (nt) oder größeren Armen, die das Gen an einen bestimmten Ort im viralen Genom leiten, der dann stabil durch Doppel-Crossover-Ereignisse^8,9,10integriert wird. Diese Strategie ist schnell und effizient; Es führt jedoch zu zusätzlichem genetischem Material in Form des Markergens, das unerwartete Effekte hervorrufen kann. Darüber hinaus gibt es eine praktische Obergrenze für die Anzahl der Transgene, die durch die Anzahl der verfügbaren eindeutigen wählbaren Marker begrenzt eingeführt werden können. Transient dominante Selektionsstrategien (TDS) haben dieses Problem angegangen, indem sie die Erzeugung von "scarless" rekombinanten Viren erleichtert haben¹¹. Mit dieser Strategie werden ein Plasmid, das ein mutiertes VACV-Gen und ein wählbares Markergen enthält, in das virale Genom integriert, jedoch ohne zusätzliche flankierende VACV-DNA. Dieser Ansatz führt zu einer transienten Integration des gesamten Plasmids und zur Duplizierung des VACV-Gens als Folge der Integration durch ein einziges Crossover-Ereignis. Dieses Zwischenprodukt ist stabil, solange es unter Selektionsdruck aufrechterhalten wird, was eine Anreicherung dieses Konstrukts ermöglicht. Wenn die Auswahl entfernt wird, ermöglicht die VACV-Duplikation ein zweites Crossover-Ereignis, das zur Entfernung des Plasmids und der anschließenden Bildung des Wildtyps (Wt) oder des rekombinanten Virus im Verhältnis von ungefähr 50:50 führt. Während TDS rekombinante Viren erzeugt, ohne dass die stämmige Einführung fremder DNA erforderlich ist, müssen mehrere Virusklone durch Sequenzierungsanalyse auf die erwartete Mutation untersucht werden, ein potenziell zeitaufwändiger und kostspieliger Schritt.

Hier stellen wir einen Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Poxviren vor, der die besten Aspekte jedes dieser Ansätze kombiniert, ähnlich einem Ansatz, der für die Replikation inkompetent modifizierte Impfung Ankara^12,13,14beschrieben wurde. Diese Strategie kombiniert visuelle und Host-Bereichs-Auswahl, um schnell rekombinante Viren durch Doppel-Crossover-Ereignisse zu erzeugen, und anschließend das wählbare Markergen durch homologe Rekombination zu beseitigen. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle Generierung von Mutanten, die durch homologe Rekombination vermittelt werden, mit der "scarless" Natur von TDS-Ansätzen, ohne einen nachfolgenden Screening-Schritt zu erfordern, um Wildtyp- und mutierte Viren zu unterscheiden. Unsere Methode verwendet auch die Auswahl des Wirtsbereichs anstelle der Antibiotikaauswahl, wodurch das Risiko chemisch induzierter phänotypischer Veränderungen in der Zelllinie eliminiert wird. Für diesen Ansatz haben wir uns entschieden, den Wirt antivirale Proteinkinase R (PKR) als selektives Mittel zur Erzeugung rekombinanter VACV zu verwenden. PKR wird in den meisten Zelltypen als inaktives Monomer ausgedrückt¹⁵. Bei Bindung von doppelsträngiger RNA (dsRNA) an den N-terminalen dsRNA-bindenden Domänen dimerisiert PKR und wird¹⁶autophosphoryliert. Diese aktive Form von PKR phosphoryliert die Alpha-Untereinheit des eukaryotischen Initiationsfaktors 2 (eIF2), was letztlich die Abgabe von Initiator Methionyl-tRNA an das Ribosom hemmt, wodurch die intrazelluläre Translation verhindert und die Replikation vieler Virusfamilien weitgehend hemmt^17,18.

Als Reaktion auf die breite und starke antivirale Aktivität von PKR haben viele Viren mindestens eine Strategie entwickelt, um die PKR-Aktivierung zu verhindern. Die meisten Poxviren exprimieren zwei PKR-Antagonisten, die von den E3L- und K3L-Genen in VACV kodiert werden und PKR durch zwei unterschiedliche Mechanismen antagonisieren¹⁹. E3 verhindert die PKR-Homodimerisierung durch Bindung doppelsträngiger RNA^20,21, während K3 als Pseudosubstratinhibitor wirkt, indem es direkt an aktivierte PKR bindet und dadurch die Wechselwirkung mit seinem Substrat eIF2-²²hemmt. Wichtig ist, dass diese beiden PKR-Antagonisten PKR nicht unbedingt von allen Arten hemmen. Zum Beispiel hemmte der K3-Homolog des Schafpockenvirus PKR stark von Schafen, während der Schafpocken-E3-Homolog keine nennenswerte PKR-Hemmung zeigte^23,24. In dieser Studie stellen wir eine Methode zur Verwendung von PKR-vermitteltem selektiven Druck in Kombination mit Fluoreszenzauswahl vor, um ein VACV-Rekombinant zu erzeugen, das für E3L und K3L (VC-R4) gelöscht wurde und sich in PKR-fähigen Zellen, die von verschiedenen Arten stammen, nicht replizieren kann. Dieses rekombinante Virus bietet einen ausgezeichneten Hintergrund für die schnelle Generierung rekombinanter Viren, die Gene unter Kontrolle des nativen E3L-Promotors exezieren.

Protokoll

1. Generieren des Rekombinationsvektors

1. Design-Primer, um die Auswahlkassette zu generieren. Entwerfen Sie jedes einzelne Amplikon mit überlappenden Sequenzen mit benachbarten Amplikonen und dem Vektor, um die isotherme enzymatische Montage von DNA-Molekülen, auch Gibson-Montage genannt, mit einem von mehreren Online-Primer-Design-Tools zu erleichtern.
   HINWEIS: Dieses Protokoll kann auch mit herkömmlichen, auf Einschränkungen endonukleasebasierten Klonierungsmethoden abgeschlossen werden. In diesem Fall können Sie Primer mit den entsprechenden Einschränkungssites anstelle von überlappenden Sequenzen entwerfen.
2. Mit den in Schritt 1.1 entworfenen Primern verstärken die PCR die folgenden Elemente in der Reihenfolge von 5' bis 3'(Abbildung 1):500 Nukleotide der VACV-Genomregion 5' von E3L (5' Arm), EGFP oder dem Gen von Interesse, 150 Nukleotide aus der VACV-Genomregion sofort 3' e3L (kurzer 3'-Arm), ein synthetischer Früh-/Spät-Poxvirus-Promotor²⁵, das mCherry-E3L-Fusionsgen und 500 Nukleotide aus der VACV-Genomregion 3' von E3L einschließlich des kurzen 3'-Arms (langer 3'-Arm).
   1. In einem PCR-Rohr die Reagenzien in folgender Reihenfolge für jedes Amplikon hinzufügen: 17 l DNase-freies Wasser, 1,2 l pro Primer (Anfangskonzentration = 10 Endkonzentration = 0,5 m), 5 l 5x PCR-Reaktionspuffer, Vorlagen-DNA (10 ng für Amplicons, verstärkt aus Plasmiden: EGFP- und E/L-Promoter-mCherry-E3L-Kassette; 100 ng für Amplicons, verstärkt aus viraler genomischer DNA: 5' und 3' Arme) und 0,5 l DNA-Polymerase. Passen Sie das Wasservolumen für ein Endreaktionsvolumen von 50 l an.
      HINWEIS: Die Konzentration der Vorlagen-DNA sollte empirisch bestimmt werden, aber wir beginnen in der Regel mit 10 ng/Reaktion.
   2. Legen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler, und schmelzen Sie die DNA bei 98 °C für 30 s, und verwenden Sie dann 25 Runden eines dreistufigen PCR-Protokolls: 98 °C für 5 s, 55 °C für 10 s und 72 °C für 1 min.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die Schmelztemperatur basierend auf dem vom Hersteller vorgeschlagenen Tm für jeden Primersatz. Bestimmen Sie die geeignete Verlängerungszeit basierend auf der Länge jedes Amplicons (1 Minute/kb).
3. Visualisieren Sie die Amplifikationsprodukte auf einem 1% Agarose-Gel. Fügen Sie jedem DNA-Produkt 10 l und jedem Bohrspeicher 2 l Ladepuffer hinzu und laufen Sie bei 8 V/cm für 1 h.
4. Gel reinigen jedes Amplicon mit einem DNA-Gel-Extraktionskit und dem Herstellerprotokoll. Elute die Amplicons aus der Säule durch Zugabe von 50 l DNase freies Wasser und sofort Zentrifugieren.
5. Linearisieren Sie den pUC19 Klonvektor mit EcoRI Endonuklease-Verdauung. Zu einem Röhrchen 1 g pUC19, Wasser zu einem Volumen von 17 l, 2 l Reaktionspuffer und 1 l (20 Einheiten) EcoRIhinzufügen. Bei 37 °C für 1 h inkubieren.
   1. Visualisieren Sie die Amplifikationsprodukte auf einem 1% Agarose-Gel lauf bei 8 V/cm für 1 h. Verbrauchen Sie das Band aus dem Gel, und reinigen Sie das Produkt mit dem DNA-Gel-Extraktionskit, wie in Schritt 1.4 beschrieben.
6. Ligate alle einzelnen, gelgereinigten Amplicons und den linearisierten Vektor mit einem Master-Mix-Kit.
   1. Zu einem PCR-Rohr, fügen Sie 0,2 pmol linearisierte pUC19 und jeder Amplicon (5' Arm, EGFP, kurze 3' Arm, E / L Promoter-mCherry-E3L Kassette, 3'arm). Fügen Sie DNase-freies Wasser zu einem Endvolumen von 10 l hinzu, und fügen Sie dann 10 L DNA-Baugruppen-Master-Mix hinzu. Proben bei 50 °C für 1 h inkubieren.
7. Chemisch kompetente E. coli mit 2 l des montierten Produkts aus Schritt 1.6 wie zuvor beschrieben^26,27transformieren. Platte 100 l der transformierten Zellen auf LB-Agaroseplatten, die 100 g/ml Ampicillin enthalten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
8. Wählen Sie gut isolierte Kolonien und übertragen Sie einzelne Kolonien in Röhren, die Luria-Brühe mit 100 g/ml Ampicillin enthalten. Die Röhren über Nacht bei 37 °C bebrüten, während sie bei 225 U/min schütteln.
9. Isolieren Sie die Plasmide aus der Nachtkultur mit einem Plasmid-Miniprep-Kit. Überprüfen Sie die Konzentration und Reinheit der DNA mit einem Spektralphotometer. Ein A260/A280-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0 ist akzeptabel.
10. Reichen Sie die Plasmide für die Sanger-Sequenzierung ein, um festzustellen, ob das gewünschte Klonprodukt korrekt ist. Bewahren Sie die DNA bei -20 °C auf.

2. Generierung des rekombinanten Virus

1. Infizieren Sie eine konfluente Monoschicht geeigneter Zellen mit dem Virus, das bei einer Vielzahl von Infektionen von 1,0 (MOI = 1,0) in einer 6-Well-Platte rekombiniert werden soll. Inkubieren Sie die infizierten Zellen bei 37 °C und 5%_CO2 für 1 h. Dann das Medium ansaugen und durch frisches DMEM ersetzen. Inkubieren Sie die infizierten Zellen bei 37 °C und 5%_CO2.
   HINWEIS: Für die Replikation eignen sich kompetente Viren wie ein Impfvirus ohne K3L²², eine Zelllinie wie die europäische Kaninchennierenzelllinie RK13 (ATCC #CCL-37) oder BSC-40 ist geeignet. Für die Replikation mangelhafter Viren, wie das in diesem Papier beschriebene Virus, das sowohl die PKR-Antagonisten E3L als auch K3L enthält, ist jedoch eine ergänzende Zelllinie erforderlich, die diese beiden Gene in Trans- oder PKR-Knock-down- oder Knock-out-Zellen exprozisiert.
2. Transfetiere die infizierten Zellen mit 500 ng des Vektors, der in Schritt 1.10 erzeugt und validiert wurde, mit einem kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenz nach dem Herstellerprotokoll. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%_CO2 für 48 h.
   HINWEIS: Wenn ein Impfvirus verwendet wird, das sowohl E3L als auch K3L enthält, wird der von PKR vermittelte selektive Druck die Auswahl rekombinierter Viren antreiben und die Expression des mCherry-E3L-Fusionsproteins in diesen Zellen aufrechterhalten. Auf Wunsch sollte es auch möglich sein, PCR nur den Einsatz zu verstärken, der für die Transfektion anstelle des gesamten Plasmids verwendet werden soll.
3. 48 Stunden nach der Infektion, Ernten Sie die infizierte Monolayer. In einigen Fällen können die Zellen durch Pipetten geerntet werden, aber wenn sie noch fest anhaften, ernten Sie sie mit einem Zellschaber. Die Zellen dreimal einfrieren und die Lysate dann für 15 s bei 50% Amplitude beschallen. Bewahren Sie dieses Lysat bei -80 °C auf, bis es einsatzbereit ist.
4. Das in Schritt 2.3 geerntete Lysat in Schritt 2.3 von 10^-1 bis 10^-6 wird seriell 10-fach verdünnt, indem 120 l des Lysats zu 1080 l DMEM (10^-1)addiert und dann 120 l dieser Verdünnung zu 1080 l DMEM (10^-2) addiert und dieser Prozess vier weitere Male wiederholt wird. Fügen Sie 1 ml jeder Verdünnung zu einem individuellen, konfluenten Brunnen einer PKR-kompetenten Zelllinie, in diesem Fall RK13-Zellen, hinzu.
   1. Inkubieren Sie die infizierten Zellen bei 37 °C und 5%_CO2 für 1 h. Dann das Medium ansaugen und durch frische DMEM-Inkubation der infizierten Zellen bei 37 °C und 5%_CO2ersetzen.
5. 24 bis 48 Stunden nach der Infektion, identifizieren rekombinante Viren durch Fluoreszenzmikroskopie. Plaques von rekombinanten Viren drücken rote Fluoreszenz durch Integration des mCherry-E3L-Fusionsgens aus (Abbildung 2). Wenn zunächst ein Virus ohne PKR-Inhibitoren verwendet wurde, enthalten alle Plaques rekombinantes Virus.
6. Plaque reinigen rekombinante Viren dreimal auf RK13-Zellen. Nach der letzten Runde der Plaquereinigung sollten alle Plaques rote Fluoreszenz ausdrücken.
7. Infizieren Sie eine konfluente 6-Well-Platte von RK13-Zellen, die die VACV-PKR-Inhibitoren E3L und K3L (RK13+E3L+K3L-Zellen²⁸) mit dem plaquegereinigten roten Fluoreszenzvirus ab Schritt 2.6 exzieren. Ziel für ca. 50-100 Plaques pro Brunnen.
   HINWEIS: Diese Zellen liefern die VACV PKR-Antagonisten trans und lindern den PKR-vermittelten selektiven Druck, das mCherry-E3L-Fusionsgen aufrechtzuerhalten, wodurch die "scarless" Generation des rekombinanten Virus gefördert wird.
8. Identifizieren Sie kollabierte Viren mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem EVOS2-Mikroskop und einem GFP-Filterwürfel (Erregung: 470/22, Emission: 525/50) und einem RFP-Filterwürfel (Erregung: 531/40, Emission: 593/40).
   ANMERKUNG: Die Häufigkeit, mit der das mCherry-E3L-Fusionsgen verloren geht, beträgt etwa 2,5 % (Tabelle 2). Wenn EGFP nicht als Markergen enthalten ist, sind Plaques von mutierten Viren, die das mCherry-E3L-Fusionsgen verloren haben, farblos.
9. Plaque reinigen nur grün (VC-R4) oder farblose Plaques (E3L) dreimal auf RK13 +E3L+K3L Zellen. Stellen Sie sicher, dass keine Plaques rot fluoreszieren.
10. Bestätigen Sie den Verlust von mCherry-E3L und das Vorhandensein der erwarteten Mutation durch PCR- und Sanger-Sequenzierung.
    HINWEIS: Wenn das Gen oder die Mutation von Interesse keine PKR-hemmende Aktivität hat, müssen rekombinante Viren auf RK13+E3L+K3L-Zellen oder einer gleichwertigen PKR-hemmenden oder PKR-mangelhaften Zelllinie angebaut werden (Abbildung 3).

Ergebnisse

Wir verwendeten das in Abbildung 1 dargestellte Verfahren, um einen VACV zu erzeugen, der sowohl die PKR-Antagonisten E3L als auch K3L fehlte, indem wir E3L durch EGFP in einem Virus ersetzten, das bereits für K3L (vP872) gelöscht wurde. Abbildung 2 zeigt rote fluoreszierende Plaques in PKR-kompetenten RK13-Zellen, die auf eine virale Expression von mCherry-E3L hinweisen, sowie EGFP, ausgedrückt in RK13+E3L+K3L-Zellen, die den Verlust von E3L und den Zusammen...

Diskussion

Hier stellen wir eine Variation einer transienten Markerauswahlstrategie ³² vor, um rekombinante Impfstoffviren zu erzeugen, ohne fremde DNA im endgültigen rekombinanten Virus zu speichern. Unsere Strategie verwendet selektiven Druck, der vom antiviralen Protein PKR des Wirts vermittelt wird, anstatt andere Formen des selektiven Drucks wie Antibiotika. Die Verwendung von antiviralen Wirtsgenen eliminiert die Möglichkeit chemisch induzierter phäkotypischer Veränderungen in den Zellen oder ein e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	High-fidelity polymerase used in PCR
Ampicillin	ThermoFisher Scientific	11593027	Bacterial selective agent
Disposable Cell Scrapers	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging system	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Transfection reagent
Luria Bertani (LB) Broth	Gibco	10855021	Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kit	NEB	T1020L	Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kit	NEB	T1010L	Miniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110	Sonicator for virus lysates
RK13 cells	ATCC	CCL-37	Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture plates	VWR	10062-892	Cell culture plates