細胞にシグナルを送るためのラミニン-111のフラクタル微細構造の生成

要約

重合されていないLn1とは異なる方法で細胞にシグナルを送るフラクタル特性を持つLn1ポリマーを生成する3つの方法について説明します。

要約

ラミニン-111(Ln1)は、上皮系、筋肉系、神経系の細胞外マトリックスの重要な部分です。我々は以前、Ln1の微細構造が細胞へのシグナル伝達の仕方を変化させることを実証したが、これはおそらくLn1がネットワークに集合すると異なる接着ドメインが露出するためであろう。このプロトコルでは、重合されたLn1を発生させる3つの方法を記述する。

概要

成長因子やサイトカインとは異なり、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質は構造ネットワークに集合することができます。ECM機能障害は多くの疾患の重要な要素であるため、細胞がECM組成、微細構造、および生体力学からのシグナルを感知および伝達するメカニズムは、治療法開発の魅力的な標的です。これらのネットワークの微細構造が、これらのタンパク質が細胞にシグナルを伝達する仕組みに大きな役割を果たしていることを示唆する証拠が増えています。現在までに、ECMの微細構造と細胞機能とのこの連関は、コラーゲン^I1、フィブロネクチン²、およびフィブリン³について示されています。

ラミニン-111(Ln1)は、上皮細胞⁴、筋肉細胞⁵、神経細胞⁶に接触する細胞外マトリックスの重要な構造成分である三量体の十字型タンパク質です。乳腺では、Ln1は乳腺上皮細胞から乳汁産^{生細胞への}機能分化に必要であり^7,8,9、Ln1は腫瘍復帰の誘導に不可欠である^10,11。Ln1と他のラミニンは、筋肉における皮質アクチンネットワークの発達と筋膜の組織化^12,13、および神経細胞の移動と神経突起伸長¹³に必要である。このように、ラミニンが細胞にシグナルを送るメカニズムを理解することは、活発な研究分野です。

Ln1には、インテグリン、シンデカン、ジストログリカン、LBP-110、LamRなど、幅広い受容体に対する複数の接着ドメインが含まれています(図1A)^4,14。ラミニンα1のc末端球状ドメインを含むE8断片は、ジストログリカンとインテグリリンα6β1およびα3β1の結合に必要であり¹⁵、上皮細胞の機能分化に必要である^15,16。対照的に、短腕は異なる生物学的活性を示し¹⁷、ネットワーク形成後にこれらの異なるLn1ドメインを認識できることは、細胞の挙動を変化させる可能性があることを意味する。

我々は最近、高分子ネットワークに配列されたLn1がフラクタル特性(すなわち、複数の長さスケールにわたって自己相似な構造)を示すことを実証した¹⁸。フラクタルネットワークは、この配列を欠いているLn1と比較して、上皮細胞に対して異なるシグナルを伝達する¹⁹。このフラクタルネットワークは、特定のアセンブリ構造を示しており、ここで、長腕は、細胞¹⁸に優先的に曝露される。この異なる長腕表示の結果として、上皮細胞は、よく組織化されたタイトジャンクションとアクチンストレス線維の抑制を有する乳生産細胞に機能分化する¹⁹。

本稿では、Ln1長腕の高い表示を示す短腕-短腕結合相互作用からLn1ネットワークを生成する3つの方法、すなわち、1)酸性緩衝液による無細胞集合、2)糖タンパク質との共インキュベーション、または3)細胞表面ジストログリカンとの相互作用について述べる。これら3つの方法は、3つの非常に異なるメカニズムによって類似したラミニンの微細構造を生成するため、実験計画に柔軟性を持たせることができます。以前の研究では、これら3つの方法が生物学的頑健性を表す可能性があることが示唆されています:乳腺上皮では、細胞表面のジストログリカン、糖タンパク質、または人工的に構造化されたラミニンのいずれかが機能分化を誘導することができます¹⁹。したがって、研究者は研究対象に基づいてこれらの方法から選択することができます:細胞膜中のジストログリカンがフラクタルネットワークに正しい重合を誘導するため、ジストログリカン発現細胞はLn-1微細構造に対する感受性を示さない^19,20。ラミニンと糖タンパク質の混合物であるマトリゲル²¹は、Ln-1の最も経済的な供給源であり、ジストログリカンノックアウト乳腺細胞を分化させるのに必要な微細構造を提供する²⁰が、ロットごとにばらつきのあるタンパク質の複雑な混合物を含んでいる。PolyLMは、この機能を提供する最もクリーンで還元主義的なシステムですが、マトリゲル¹⁹と比較して、乳腺細胞の分化を誘導するコストが高く、有効性が低くなります。

これら3つの方法は、拡散制限凝集^18,19に特徴的なフラクタルネットワーク構造を有し、複数の実験系^22,23,24,25において凝集したラミニンと比較して生物活性の変化を示す。これらの方法を用いた今後の研究により、上皮分化に必要な受容体とシグナル伝達を同定し、腫瘍などの異常な微小環境²⁰の細胞において正常な細胞-マトリックス相互作用を回復させることが決定される可能性がある。

プロトコル

1.解凍して分注するlaminin-111

注:精製されたラミニン-111は市販されていますが(通常、マトリゲルとして販売されているEHSマトリックスから精製されています)、すべての供給源が無傷の非分解タンパク質を提供するわけではありません。

1. Ln1を調達し、流戮サイズ排除クロマト^{グラフィー26} またはポリアクリルアミドゲル電気泳動²⁶を行うことにより、Ln1が分解されていないことを確認する。変性Ln1は337 kDa、197 kDa、177 kDaのバンドを持ち、ネイティブLn1は711 kDaのシングルバンドを持つ必要があります。
2. Ln1を冷蔵庫の氷上で一晩解凍し、低タンパク質結合チップと滅菌技術を使用して、低タンパク質吸着性微量遠心チューブ(通常、培養オーバーレイの場合は100 μg/チューブ、コーティングの場合は10 μgで分注)に分注します²⁷。アリコートを凍結し、-80°Cで保存してください。

2. 低pH緩衝液を用いたラミニン重合

1. polyLM重合バッファーの作製:1 mM CaCl₂ と20 mM酢酸ナトリウムを超純水で秤量し、混合します。次に、HClまたは酢酸を使用してpHを4.0に調整します。0.2μmフィルターに通した滅菌フィルターを使用し、4°Cで保存します。
2. コントロール重合バッファーの作製:必要に応じて、1 mM CalCl₂ と 20 mM Tris を混合し、10 N HCl または 12 N NaOH を使用して pH を 7.0 に調整します。0.2μmフィルターに通した滅菌フィルターを使用し、4°Cで保存します。
   注: プロトコルはここで一時停止できます。
3. 必要な数のLn-1アリコートを冷蔵庫で一晩解凍します。
4. 滅菌細胞培養技術を用いて、適切なバッファー(ステップ2.1のpolyLM重合バッファーまたはステップ2.2のコントロール重合バッファーのいずれか)を最終濃度100 μg/mLのラミニンアリコートに添加し(すなわち、0.5 mLを50 μgアリコートに添加)、ピペッティングで穏やかに混合します。
5. 蛍光標識ラミニンを可視化に使用する場合は、再溶解し、1:50 wt/wt比(例:2 μg/100 μg)で添加し、ピペッティングで穏やかに混合します。
   注:細胞接着の基質としてラミニンを使用する場合は、手順2.6〜2.8に従います。
6. 適切な緩衝液で希釈した直後に、ラミニンを培養プラスチックまたはガラス器具に転写し、37°Cの細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。 カバーガラスをコーティングする場合は、平衡液滴が得られる程度に十分な容量を添加し(通常、13 mmの丸いカバーガラスには50 μLを使用)、加湿したチャンバーで37°Cで一晩保管してください。
7. 滅菌技術²⁷を使用して、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
8. 液体を慎重に取り除きます。表面を完全に乾かさないでください。
   注:乳タンパク質誘導のために細胞を覆うためにラミニンを使用する場合は、手順2.9-2.12に従います。
9. 乳腺上皮細胞を培養します。2% FBS、0.01 mg/mLインスリン、0.005 μg/mL EGF、0.05 mg/mLゲンタマイシン、および0.05 g/mLノルモシンを添加したDMEM-F12で、MepGジストログリカンノックイン(DgKI)またはMepGジストログリカンノックアウト細胞(DgKO)を培養します。
10. ラミニン刺激用のDgKOおよびDgKI細胞を10,500細胞/^cm2 でウェルプレートまたはカバーガラス底皿に播種します
11. 希釈したラミニンを細胞培養インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
12. polyLM アリコートは 2,000 x g で 20 分間遠心分離しますが、タンパク質実体のサイズが小さく、効果的に回収するにはより高速な速度が必要であるため、LM は中性 pH 20,000 x g で 20 分間遠心分離します。
13. 滅菌技術²⁷を用いて、上清を穏やかに除去し、3 μg/mLのプロラクチン、2.8 μMのヒドロコルチゾン、および5 μg/mLのインスリンを添加したDMEM-F12の適切な量の誘導培地に再懸濁する
14. 細胞培養培地にラミニンを直ちに移し、細胞を刺激します。50-800 μg/mL Ln1で細胞を刺激することに成功しました

3. 単離糖蛋白質を用いたラミニン重合

1. 組換えニドゲン-1とLn1を冷蔵庫の氷上で一晩静かに解凍します。
2. 細胞培養培地中でLn1とニドゲン-1を1:1 wt/wtの比率で混合し、タンパク質結合の少ないチップとチューブを使用し、滅菌法を使用します。細胞培養培地中の純粋なLn1をコントロールとして使用します。
3. 可視化に蛍光標識ラミニンを使用する場合は、再溶解し、1:50 wt/wt 比(例:2 μg/100 μg)で添加します。ピペッティングで静かに混合します。
4. Ln1-ニドゲンをインキュベートするか、Ln1を細胞培養インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
5. Ln1-ニドゲン共重合体を2,000 x g で30分間遠心分離し、コントロールLn1を20,000 x g で30分間遠心分離します。
6. 上清を静かに除去し、細胞培養培地に最終濃度100〜800μgの総タンパク質/mLになるまで再懸濁します。
7. 直ちに細胞を刺激するために使用するか、カバーガラスに移し、加湿した細胞培養インキュベーターで37°Cで一晩接着させます。
8. カバーガラスから培地を取り出し、カバーガラスを1x PBSで洗浄した後、10%ホルマリン(PBS中の4%ホルムアルデヒド)で室温で15分間固定します。

4. ジストログリカン発現細胞を用いたラミニン重合

1. 乳腺上皮細胞を培養します。2% FBS、0.01 mg/mLインスリン、0.005 μg/mL EGF、0.05 mg/mLゲンタマイシン、および0.05 g/mLノルモシンを添加したDMEM-F12で、MepGジストログリカンノックイン(DgKI)またはMepGジストログリカンノックアウト細胞(DgKO)を培養します。
2. 増殖速度の違いにより、DgKI細胞は5,000細胞/^cm2、DgKO細胞は8,000細胞/^cm2 で播種します。加湿インキュベーターで37°Cで培養し、培地を2〜3日ごとに交換し、厳格な滅菌技術を使用して4〜5日ごとに継代します。適切な増殖速度を確保するために、血球計算盤または自動セル^{カウンター27} で細胞を注意深くカウントします。
3. 10,500細胞/^cm2 のラミニン刺激用播種細胞をウェルプレートまたはカバーガラス底皿に入れ、2日間培養し、DgKI細胞を用いてフラクタルLn1細胞およびDgKO細胞をネガティブコントロールとして作製した。Ln-1を冷蔵庫の氷上で穏やかに一晩解凍し、3 μg/mLのプロラクチン、2.8 μMのヒドロコルチゾン、および5 μg/mLのインスリンを添加したDMEM-F12の誘導培地と混合します。35 mmのディッシュには、50〜800 μgのLn1を含む1 mLの誘導媒体を使用します。
4. 蛍光Ln1を使用する場合は、50:1のwt/wt比で混合します。
5. 細胞から培地を取り除き、3 μg/mLのプロラクチン、2.8 μMのヒドロコルチゾン、および5 μg/mLのインスリンを添加したDMEM-F12のラミニンおよび誘導培地で覆います
6. 細胞を2日間培養した後、10%ホルマリンで固定します。

5. 光学顕微鏡によるラミニン微細構造の解析

1. 固定サンプルを採取し、1x PBSで室温で5分間3回洗浄します。
2. 0.5% Triton X-100、3% ウシ血清アルブミン、10% ヤギ血清、40 μg/mL 抗マウスブロッキング抗体フラグメントを含む 1x PBS でサンプルを室温で 1 時間ブロッキングし、透過処理します。
   注意: Triton X-100は危険です。手袋と目の保護具を着用して取り扱い、適切に廃棄してください。
3. 抗ラミニン抗体を希釈率1:100で1x PBSと0.5% Triton X-100および3% BSAを混合し、加湿チャンバー内で室温で2時間、または4°Cで一晩サンプルに添加します(通常は、底部にウェットラボワイプを入れたチップボックスを使用します)。
4. 一次抗体を除去し、0.5% Triton X-100 および 3% BSA を含む 1x PBS で 3 回洗浄します。
5. 0.5% Triton X-100 および 3% BSA を含む 1x PBS のサンプルに適切な二次抗体を 1:500 に希釈して添加し、加湿チャンバー内で暗所の室温でインキュベートします。
6. 二次抗体を除去し、0.5% Triton X-100および3% BSAを含む1x PBSで3回洗浄します。
7. 細胞を含むサンプルの場合は、6 μM のファロイジンを添加して 45 分間添加した後、0.5% Triton X-100 と 3% BSA を含む PBS で 3 回洗浄し、続いて PBS で 3 回洗浄します。その後、0.1 μg/mL DAPI in PBSで5分間染色します。
8. 必要に応じてサンプルを取り付けます。
9. 高分解能共焦点顕微鏡を用いたln-1構造の画像化液浸対物レンズ(水浸プランアポクロマート40X/1.1NAまたは油浸プランアポクロマート63X/1.4NA)を備えたレーザー走査型顕微鏡を使用してください。

6. 箱の計数次元によるlamininの構造物の性格描写

1. Matlab ツールボックスまたは ImageJ で使用可能なボックス計数次元アルゴリズムを使用して、フラクタル特性を解析します。これらの手法は、ラミニンのイメージを閾値とし、Ln1 を含むボックスの数とボックスのサイズを比較した対数対数プロットにプロットします。これらのパラメータ間の関係の傾きはボックスカウント次元であり、非フラクタルジオメトリの次元は0、1、または2になり、フラクタルジオメトリは非整数次元²⁸になります。
   注:酸処理、糖タンパク質処理、およびDgKI細胞付着Ln1はすべて、ボックスカウントフラクタル次元が~1.7であるのに対し、コントロールLn1のフラクタル次元は2.0です。

7. 電子顕微鏡によるラミニンコンストラクトのキャラクタリゼーション

1. ラミニンを細胞培養培地に再懸濁し、湿度の高い37°Cの環境で90分間シリカウエハーに吸着させます。
2. マトリックスを pH 7.2 の 0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液中の 2.5% グルタルアルデヒドで固定します。
   注意: グルタルアルデヒドは危険であり、手袋と目の保護具を着用してドラフトで取り扱い、有害廃棄物として処分する必要があります。
3. pH 7.2 の 0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液中の 1% 四酸化オスミウム中の後置マトリックス。
   注意: 四酸化オスミウムは危険であり、手袋と目の保護具を使用してドラフトで取り扱い、適切に廃棄する必要があります。カコジル酸は危険であり、手袋と目の保護具を使用してドラフトで取り扱い、適切に廃棄する必要があります。.
4. pH 7.2のカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄します。
5. エタノールの濃度を上げて脱水します。
6. スパッタリングコートマトリックスは、金の薄い層でコーティングされます。
7. 走査型電子顕微鏡を用いた画像。

結果

ラミニン-111は、短腕の末端に3つの自己組織化ドメインを持つ三量体タンパク質です(図1A)。適切に処理すると、短いアームは六方格子に重合し(図1B、1C)、より大きな空間スケールで拡散限界凝集フラクタル特性を示します(図2)。カルシウム含有中性pH緩衝液中でインキュベートしたラミニンは、抗Ln1抗体(

ディスカッション

ラミニンは、上皮系、筋肉系、神経系におけるECMの重要な要素であり、in vitroでは、細胞の機能分化の調節に重要な役割を果たすことが示されています。細胞に示されるラミニンの構造が、そのシグナル伝達と結果として生じる細胞表現型を調節することを示す証拠が増えており^15,16、したがって、Ln1微細構造を制御する方法は、これらの分野で働?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
Anti-Laminin primary antibody	Sigma Aldrich	L9393
Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody	Thermo	A32731
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418
CaCl2	Sigma Aldrich	C4901 or similar
Cell Culture Incubator	Thermo	Heracell 150 or similar
Centrifuge for microcentrifuge tubes	Eppendorf	5418 or similar
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 or equivalent
Coverslips	Thermo	25CIR-1 or similar
DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red	Thermo	11330107
EGF (Epidermal Growth Factor)	Sigma Aldrich	11376454001
Fluorescently Labeled Laminin	Cytoskeleton Inc	LMN02
Gentamicin	VWR	VWRV0304-10G
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
HCl	Sigma Aldrich	320331 or similar
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888-5G
Insulin	Sigma Aldrich	16634-50mg
MepG Dystroglycan Knockout Cells	LBNL	N/A
NaOH	Sigma Aldrich	S8045 or similar
Normocin	Invivogen	ant-nr-1
Osmium Tetroxide	Sigma Aldrich	75633
Ovine Prolactin	Los Angeles Biomedical Research Institute	Ovine Pituitary Prolactin
Phalloidin	Thermo	A22287
Phosphate Buffered Saline	Thermo	10010023 or similar
Purified Laminin-111	Sigma Aldrich	L2020-1MG
Recombinant human Nidogen-1, carrier free	R&D systems	2570-ND-050
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	S2889 or similar
Sodium Cacodylate	Sigma Aldrich	C0250
Sterile filters	Millipore	SLGP033RS or similar
Tris	Sigma Aldrich	252859 or similar
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Ultra-low protein binding tubes	VWR	76322-516, 76322-522 or similar
Ultrapure water	Thermo	15230253 or similar