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要約

このプロトコルは、早期転移性疾患を検出し、マクロ転移へのその後の進行を予測するために、乳癌骨転移のラットモデルにおける磁気共鳴画像(MRI)および陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影(PET/CT)に由来する画像化パラメータを組み合わせて使用する機械学習アルゴリズムを訓練するように設計された。

要約

機械学習 (ML) アルゴリズムを使用すると、さまざまな機能をモデルに統合して、その構成要素を超える精度で分類または回帰タスクを実行できます。このプロトコルは、標準的なイメージング法で異常が観察される前に、ラットモデルにおける乳癌骨マクロメタスターゼの成長を予測するMLアルゴリズムの開発を記述する。このようなアルゴリズムは、ステージング検査中に定期的に見逃される早期転移性疾患(すなわち微小転移)の検出を容易にすることができる。

適用された転移モデルは部位特異的であり、ラットは右後ろ足だけで転移を発症することを意味する。モデルの腫瘍取り率は60%~80%で、マクロメタスターゼは誘導の30日後に動物のサブセット中の磁気共鳴画像(MRI)および陽電子放出断層撮影(PET/CT)で見えるようになり、動物の第2サブセットは腫瘍増殖を示さない。

このプロトコルは、早期に取得した画像検査から始まり、MRIによって検出された組織血管化、PET/CTによるグルコース代謝、およびマクロ転移性疾患の予測に最も関連する特徴のその後の決定を示す特徴の抽出を記述する。これらの特徴は、モデル平均ニューラルネットワーク(avNNet)に供給され、動物を転移を発症するグループと腫瘍を発症しない2つのグループのいずれかに分類します。このプロトコルは、全体的な精度、感度、特異性、負/正の予測値、尤度比、および受信機動作特性の開発など、標準の診断パラメータの計算についても説明します。提案されたプロトコルの利点は、機能の無制限の調整可能な組み合わせで異なるMLアルゴリズムの多くを訓練するために容易に適応することができるので、その柔軟性です。さらに、腫瘍学、感染、炎症の異なる問題を分析するために使用することができます。

概要

このプロトコルの目的は、MRIおよびPET/CTの複数の機能的イメージングパラメータをモデル平均ニューラルネットワーク(avNNet)MLアルゴリズムに統合することです。このアルゴリズムは、骨内の巨視的変化がまだ見えない早期の時点で乳癌骨転移のラットモデルにおけるマクロ転移の成長を予測する。

マクロメタスターゼの増殖に先立ち、骨髄浸潤性腫瘍細胞の浸潤が起こり、一般に微小転移性疾患11,22と呼ばれる。この初期の侵入は転移性疾患の初期段階と考えられるが、通常は従来の段階試験33,44の間に見逃される。現在利用可能な撮像様式では単独で使用した場合に骨髄微小浸潤を検出することはできないが、血管化と代謝活性に関する情報を得る画像化パラメータの組み合わせが、より良い5を行うことが示されている。この補完的な利点は、異なるイメージングパラメータをMLアルゴリズムであるavNNetに組み合わせることによって達成されます。このようなavNNetは、目に見える転移が存在する前に、骨マクロメタスターゼ形成の信頼性の高い予測を可能にする。したがって、イメージングバイオマーカーをavNNetに統合することは、骨髄微小浸潤および早期転移性疾患の代理パラメータとして役立つ可能性がある。

プロトコルを開発するために、ヌードラットにおける乳癌骨転移の以前に説明したモデルを66、7、87,8を使用した。このモデルの利点は、その部位特異性であり、動物が右後肢だけで骨転移を発症することを意味する。しかし、このアプローチの腫瘍取り率は60%~80%であるため、かなりの数の動物が研究中に転移を起こすわけではありません。MRIやPET/CTなどの画像化モダリティを用いて、30日目からインジェクション後に転移の存在が検出可能である。初期の時点(例えば、10PI)イメージングでは、転移性疾患を発症する動物とそうでない動物を区別しない(図1)。

10日目に取得した機能的イメージングパラメータについて訓練されたavNNetは、以下のプロトコルに記載されているように、マクロメタスターゼの増殖を以下の〜〜3週間以内に確実に予測または除外する。ニューラルネットワークは、異なる層内の人工的なノードを組み合わせます。研究プロトコルにおいて、骨髄血液供給および代謝活性のための機能的イメージングパラメータは最下層を表し、悪性腫瘍の予測は最上層を表す。追加の中間層には、上部レイヤーと下部レイヤーの両方に接続されている非表示ノードが含まれます。異なるノード間の接続の強度は、高精度9でそれぞれの分類タスクを実行するために、ネットワークのトレーニング中に更新されます。このようなニューラルネットワークの精度は、複数のモデルの出力を平均化することによってさらに向上することができ、その結果、avNNet10.

プロトコル

すべてのケアおよび実験手順は、動物保護に関する国内および地域の法律に従って行われ、すべての動物の手順は、ドイツのフランコニア州政府によって承認されました(参照番号55.2 DMS-2532-2-228)。

1. 裸ラットの右後ろ足における乳癌骨転移の誘導

注:ヌードラットにおける乳癌骨転移の誘導の詳細な説明は、他の6,88を出版しています。最も関連する手順を以下に示します。

  1. 培養MDA-MB-231ヒト乳癌細胞をRPMI-1640において、10%の胎児子牛血清(FCS)を補った。細胞を標準条件(37°C、5%CO2)2で保管し、週に2~3回通過します。
  2. リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で2 mM EDTAで近コンフルエントMDA-MB-231細胞を洗浄し、0.25%トリプシンで細胞を取り外します。ノイバウアーのチャンバで細胞濃度を決定し、1.5 x 105 細胞/200 μLの濃度でRPMI-1640の200 μLで再中断します。
  3. 6-8週齢のヌードラットを使用し、病原体を含まない制御条件下(21°C±2 °C室温、湿度60%、明暗リズム12時間)オートクレーブ飼料と水のアドリビタムを提供しています。
  4. 手術を行う前に、鎮痛薬(例えば、カルプロフェン4mg/kg)を皮下注射する。ラットをイオブルラン(1~1.5 vol)/酸素混合物を流速2 L/minで麻酔します。
  5. 手術には、16倍の倍率の手術用顕微鏡を使用してください。
  6. ラットの右のイングイナル領域で2〜3cmの切り傷を行います。大腿動脈(FA)、表在性上頭動脈(SEA)、下降性分膜動脈(DGA)、大窩動脈(PA)、および伏陰動脈(SA)を含む右のりぐるい領域のすべての動脈を解剖する。FA に 2 つのリムーバブル クリップを配置します: 1 つは SEA の先頭に近く、もう 1 つは DGA の先頭に直接近位です。
  7. SEA の遠位部分をリゲートします。SEAの壁の切断を実行し、海に直径0.3ミリメートルの針を挿入します。ステップ1.2から細胞懸濁液を含む注射器を針に接続します。FAから遠位クリップを取り外し、代わりにSAをクリップします。
  8. ステップ1.2(1.5 x 105 細胞/200 μL)からMDA-MB-231細胞懸濁液をゆっくりとSEAに注入します。針を取り外し、SEAをリゲートし、動脈クリップを取り外します。外科用クリップを使用して傷口を閉じ、麻酔を終了します。動物を毎日監視して、腫瘍の大きさと痛みの証拠を評価します。

2. 磁気共鳴画像法(MRI)

注:MRI手順の詳細については、Bäuerleら11を参照してください。

  1. 専用の実験用スキャナー( 材料表を参照)または適切な動物コイルを備えたヒトMRシステムを使用して、MRI 10日間PIを実行します。
  2. 上述のようにイオブルラン(1~1.5 vol.%)/酸素混合物でラットを麻酔します。ラットの尾静脈にカテーテルを置き、尾部にテープを貼ります。造影剤を含む注射器(約0.5 mLの0.1 mmol/kg Gd-DTPA)を接続します。
  3. 麻酔ラットをMRシステムに配置します。解剖学的シーケンス(例えば、T2加重ターボスピンエコーシーケンス)で右後肢の遠位大腿骨および近位脛骨を見つける。TR = 8,654 ミリ秒;TE = 37 ミリ秒。行列320 x 272;FOV = 65 mm x 55 mm;スライスの厚み = 1 mm;スキャン時間 11:24 分)。
  4. 右後ろ足の遠位大腿骨と近位脛骨を覆うスライスを決定し、DCE-MRIシーケンス(例えば、高速低角度ショットシーケンス)を開始します。TR = 3.9 ミリ秒TE = 0.88 ミリ秒。行列 = 256 x 216;FOV = 65 x 54 mm2;スライスの厚み = 1 mm;8スライス。100のタイムポイント。スキャン時間 = 8:25分)。30sの後、10sの期間にわたって造影剤を注入し始める。
    注:MRI検査の所要時間は、動物1匹につき約20分です。

3. ポジトロン放射断層撮影/コンピュータ断層撮影(PET/CT)

注:PETの手順の詳細については、Al.12のChengを参照してください。

  1. 専用の実験用スキャナを使用して、PET/CTイメージングを10日間PIで行います( 資料表を参照)。
  2. 画像撮影の前に動物を断食してください。ステップ2.2に記載されているようにラットを麻酔し、上述のように尾静脈にカテーテルを挿入する。
  3. 18 F-フル18オロデオキシグルコース(18F-FDG)の6 MBqを尾静脈に注入し、トレーサーが適切に分配できるように〜30分待ちます。
  4. CT取得(チューブ電圧= 80 kV、チューブ電流= 500 μA、等方性分解能= 48.9 μm、持続時間= 10分)を実行します。
  5. 静的 PET 取得を実行します (下/上の判別レベル = 350/650 keV;タイミング ウィンドウ = 3.438 ns;期間 = 15 分)。

4. 代替画像戦略

  1. 後ろ足のMDA-MB-231細胞の早期評価のために、 インオキュレート1.5 x 10 5 標識細胞/200 μLの生物発光 (すなわち、ルシフェリンを発現する細胞、 MDA-MB-231-LUC13)または蛍光イメージング (すなわち、緑色または赤色の蛍光タンパク質を発現する細胞、 MDA-MB-231-GFP/RFP13)。腫瘍細胞接種後のMDA-MB-231細胞を検出するための前臨床光学イメージング用システムを使用する。
  2. マイクロバブルの静脈内注入後に専用スキャナーを用いて実験超音波を行い、MRI7に匹敵する血管形成の形態学的および機能的パラメータを導出する。

5. MRI分析

  1. DCEプラグイン16でDICOMビューア15を使用し、トップメニューの「インポート」ボタンをクリックし、ステップ2.4からMR画像を含むDICOMフォルダを選択し、トップメニューの「4Dビューア」をクリックして、DCEシーケンスを4Dモードでロードします。
  2. 目標サイズが1.5mm2の円形の2次元領域(ROI)を配置し、2右後脚の脛骨近軸の骨髄に、これらの中心画像がより安定した結果を提供するので、8つの画像からなるシーケンスから画像番号4または5を使用するのが好ましい。
  3. 上部メニューからDCEプラグインを起動し、「プロットタイプ」フィールドで「相対エンハンスメント」を選択し、それぞれのフィールドにこれらの数字を入力して、時間ポイント1から5までのベースライン範囲を定義します。分析をそれぞれのボタンを使用して .txt ファイルとしてエクスポートし、ファイル名として "DCEraw.txt" を選択します。
  4. RStudio17 を開き、提供されている DCE-Script.R ファイルを読み込む場合は、[ファイル] メニューの [ファイルを開く] を選択します。[コード]、次に [実行領域]、および [すべて実行] を選択して、スクリプト全体を実行します。出力を "ImagingFeatures.xlsx" という名前のテンプレート ファイルにコピーします (図 2)。
  5. DICOM ビューアで、動物の背筋内に 2 番目の ROI を配置し、ステップ 5.2 ~ 5.4 を繰り返して、正規化のために筋肉 DCE 測定を取得します。スプレッドシート「ImagingFeatures.xlsx」内では、それぞれの骨の測定値は正規化のためにそれぞれの筋肉の測定値で自動的に分割されます。
  6. すべての動物に対してステップ 5.1 ~ 5.5 を繰り返し、スプレッドシートを完成させます。

6. ペット/CT分析

  1. PET/CT解析ソフトウェアを開き、手順3で取得したデータをインポートするには、「ファイル」をクリックし、続いて「手動インポート」をクリックします。ct.img.hd ファイルと pet.img.hdr ファイルをマークします。[開く] をクリックし、[すべてインポート] を選択します。
  2. データセットを開くには、 "一般分析" を選択し、続いて " OK " を選択します。
  3. "ROI 定量" を選択し、続いて "作成" を選択し、 "テンプレートから ROI を作成する " を選択します。右後ろ足の近位脛骨シャフトの骨髄に約4mm x 6mmの2次元ROIを入れる。
  4. 「ROI (ターゲット 1 オーバーレイ)」を選択し、平均値、最小値、最大値を Bq/mL に書き留めます。
  5. 最大標準化された取り込み値(SUVMax)を計算する: 最大値(Bq/mL)を注入されたアクティビティで割り、グラム単位で動物の重量で結果を乗算します。結果をスプレッドシートに入力します (図 2)。

7. 腫瘍取り込み率の決定

  1. 右後ろ足の腫瘍の成長を診断するには、上記のように30日目PIに対してMRおよびPET/CTイメージングを繰り返す。
    注:腫瘍は30日目PIではっきりと見え、PET/ CTで明らかに高いSUVマックス と共に、MRIでT2w過敏性病変と明確なコントラスト強化を特徴とします。これまでの実験によれば、動物の60~80%が右後足に転移を起用する。
  2. 追加の「腫瘍」列を追加してスプレッドシートを完成させ、転移を示すすべての動物に「1」、目に見える腫瘍負担のないすべての動物に「0」と入力します(図2)。スプレッドシートをダウンロード フォルダー内に "ImagingFeatures.xlsx" として保存します。

8. 機能の選択

  1. 今後の腫瘍の成長予測に最も関連性の高い機能を決定するには、オープンソースのデータビジュアライゼーション、機械学習、およびデータマイニングツールキット18にスプレッドシートをインポートします。
  2. [データ] メニューの [ファイル] サブルーチンを右側のワークスペースに描画し、ダブルクリックします。[フォルダ] アイコンをクリックし、ファイル "ImagingFeatures.xlsx" を選択して、スプレッドシートを読み込みます。[エクスポート] ワークシートを選択し、ターゲット属性を変数 "腫瘍" に割り当てます。動物番号に "スキップ" 機能を割り当てます (図 3)。
  3. [データ] メニューの [ランク] サブルーチンをワークスペースに描画し、"ファイル" および "ランク" サブルーチンを接続します。
  4. アイコンをダブルクリックして "ランク" サブルーチンを開き、 "情報取得" アルゴリズム19を選択します。
  5. 取得した 5 つのパラメーターから、上位 3 つの値を使用して、さらに分析を行います (SUVの最大値、PE、および AUC)。
    注: これらのパラメーターは代謝活性 (SUV最大) および組織血管化 (PE および AUC) を反映します。

9. ML分析

  1. RStudio 3.4.117 を開き、提供された TrainModel.R-Script を 「ファイル」メニューから読み込みます。
  2. 必要なライブラリをインストールする (これは一度だけ行う必要があります) を入力します。
  3. 必要なライブラリをロードし、ダウンロード フォルダを作業ディレクトリとして設定するには、TrainModel.R スクリプト内の 3 ~ 5 行目を選択します。
  4. 選択したコードを実行するには、メニューの [コード] をクリックし、[選択した行を実行]をクリックします。

10. avNNet ML アルゴリズムのトレーニング

  1. avNNet アルゴリズムをトレーニングするには、TrainModel.R-スクリプトから 8 ~ 39 行目を選択します (ステップ 9.1 を参照)。
  2. 選択したコードを実行するには、メニューの [コード] をクリックし、[選択した行を実行]をクリックします。

11. ML アルゴリズムの結果の分析

  1. 診断精度 (感度、特異性、正と負の予測値、および尤度比) の標準パラメーターを評価するには、TrainModel.R-Script から 41 ~ 50 の線を選択します。
  2. 選択したコードを実行するには、メニューの [コード] をクリックし、[選択した行を実行]をクリックします。

12. 最終モデルのレシーバ動作特性(ROC)曲線とその構成パラメータのROC曲線との比較

  1. DeLong のテストを実行して、モデルの ROC カーブとその構成パラメータの ROC カーブを比較するには、TrainModel.R-Script から 52 – 62 のラインを選択します (ステップ 9.1 を参照)。
  2. 選択したコードを実行するには、メニューの [コード] をクリックし、[選択した行を実行]をクリックします。

結果

ラットはMDA-MB-231乳癌細胞の手術および注射から素早く回復し、その後、10日目および30日目にMR-およびPET/CTイメージングを行った(図1)。ラットの右近位脛種の代表的なDCE分析を 図2Aに示す。DCE の未加工の測定値は、[エクスポート] ボタンを選択し、ファイル名として [DCEraw.txt] を選択して保存されました。

動的パ?...

ディスカッション

ML アルゴリズムは、複数の予測機能を組み合わせたモデルに統合し、単独で使用した場合に個別の構成要素を超える精度を得るために使用される強力なツールです。それにもかかわらず、実際の結果はいくつかの重要なステップに依存します。まず、使用される ML アルゴリズムは、異なる ML アルゴリズムによって異なる結果が得られるため、重要な要素です。このプロトコルで使用される?...

開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。資金提供者は研究の設計に何の役割も持っていなかった。データの収集、分析、または解釈に含まれる。原稿の執筆、または結果を公表する決定に含まれる。

謝辞

この研究はドイツ研究財団(DFG、共同研究センターCRC 1181、サブプロジェクトZ02;とZ02;)優先プログラムμBoneは、スキャンデバイス(INST 410/77-1 FUGGおよびINST 410/93-1 FUGG)、フリードリヒ・アレクサンダー大学アーランゲン・ニュルンベルクの新興フィールドイニシアチブ(EFI)「ビッグテラ」による追加サポートを含むBA 4027/10-1とBO 3811をプロジェクトします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Binocular Operating MicroscopeLeicaNA
ClinScan MR SystemBrukerNA
DICOM ViewerHorosNAwww.horosproject.org
Excel: SpreadsheetMicrosoftNA
FCSSigmaF2442-500ML
GadovistBayer-ScheringNA
Inveon PET/CTSiemensNA
Inveon Research Workplace SoftwareSiemens Healthcare GmbHNA
IVIS SpectrumPerkinElmerNA
MDA-MB-231 human breast cancer cellsAmerican Type Culture CollectionN/A
Open-source data visualization, machine learning and data mining toolkit.Orange3, University of LjubljanaNAhttps://orange.biolab.si/
RPMI-1640Invitrogen/ThermoFisher11875093
TrypsinSigma9002-07-7
Vevo 3100VisualSonicsNA

参考文献

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