실험래기 모델에서 뼈 전이를 조기에 감지하기 위한 기계 학습 알고리즘

요약

이 프로토콜은 유방암 뼈 전이의 쥐 모델에서 자기 공명 영상 (MRI) 및 양전자 방출 단층 촬영 /컴퓨터 단층 촬영 (PET/CT)에서 파생 된 이미징 매개 변수의 조합을 사용하여 기계 학습 알고리즘을 훈련하여 조기 전이성 질환을 감지하고 거식세포에 대한 후속 진행을 예측하도록 설계되었습니다.

초록

ML(기계 학습) 알고리즘은 다양한 기능을 모델에 통합하여 구성 성분을 초과하는 정확도로 분류 또는 회귀 작업을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표준 이미징 방법으로 관찰할 수 있는 이상이 발생하기 전에 쥐 모델에서 유방암 뼈 거산제의 성장을 예측하는 ML 알고리즘의 개발을 설명합니다. 이러한 알고리즘은 응시 시험 중에 정기적으로 누락되는 조기 전이성 질환(즉, 미세메타증)의 검출을 용이하게 할 수 있습니다.

적용된 전이 모델은 현장별이므로 쥐가 오른쪽 뒷다리에만 전이를 개발한다는 의미입니다. 이 모델의 종양-테이크 비율은 60%-80%로, 매크로메타제는 유도 후 30일 동안 동물의 하위 집합에서 자기 공명 영상(MRI) 및 양전자 방출 단층 촬영(PET/CT)에서 가시화되는 반면, 동물의 두 번째 하위 집합은 종양 성장을 나타내지 않습니다.

이전 시점에서 획득 한 화상 검사에서 시작하여 MRI에 의해 검출 된 조직 혈관화, PET /CT에 의한 포도당 대사 및 거식성 질환 의 예측을위한 가장 관련성이 있는 특징의 후속 결정등을 나타내는 특징의 추출을 설명합니다. 이러한 특징은 다음 모델 평균 신경망으로 공급 (avNNet) 두 그룹 중 하나로 동물을 분류: 전이를 개발할 것입니다 하나 와 어떤 종양을 개발 하지 않습니다 다른. 또한 이 프로토콜은 전체 정확도, 감도, 특이성, 음수/긍정 예측 값, 가능성 비율 및 수신기 작동 특성의 개발과 같은 표준 진단 파라미터의 계산을 설명합니다. 제안된 프로토콜의 장점은 무제한 기능의 조정 가능한 조합으로 다양한 ML 알고리즘을 쉽게 학습하도록 쉽게 조정할 수 있기 때문에 유연성입니다. 또한 종양학, 감염 및 염증에 있는 다른 문제를 분석하기 위하여 이용될 수 있습니다.

서문

이 프로토콜의 목적은 MRI 및 PET/CT의 여러 기능 적 이미징 매개 변수를 모델 평균 신경망(avNNet) ML 알고리즘에 통합하는 것입니다. 이 알고리즘은 뼈 내의 거시적 변화가 아직 보이지 않는 초기 시점에서 유방암 뼈 전이의 쥐 모델에서 거시메타제의 성장을 예측합니다.

macrometastases의 성장 전에, 전파된 종양 세포의 골수 침입이 발생하며, 일반적으로 미세 전이성 질환^1,,2로지칭된다. 이러한 초기 침공은 전이성 질환의 초기 단계로 간주될 수 있지만, 통상적으로 기존의 스테이징 시험^3,,4에서 놓친다. 현재 사용 가능한 이미징 양식은 단독으로 사용될 때 골수 미세 침입을 검출할 수 없지만, 혈관화 및 대사 활동에 대한 정보를 산출하는 이미징 파라미터의 조합은 더 나은^5를수행하는 것으로 나타났다. 이러한 보완적인 이점은 다양한 이미징 매개 변수를 ML 알고리즘인 avNNet에 결합하여 얻을 수 있습니다. 이러한 avNNet은 눈에 보이는 전이가 나타나기 전에 뼈 거형 형성의 신뢰할 수있는 예측을 허용합니다. 따라서, 이미징 바이오마커를 avNNet에 통합하면 골수 미세 침공 및 초기 전이성 질환에 대한 대리 매개변수가 될 수 있다.

프로토콜을 개발하기 위해, 이전에 설명된 유방암 뼈 전이의 모델이 누드 쥐에서^6,7,,8을사용되었다.⁶ 이 모델의 장점은 동물이 오른쪽 뒷다리에만 뼈 전이를 개발한다는 것을 의미하는 사이트 특이성입니다. 그러나, 이 접근법의 종양 소요율은 60%-80%이므로 상당수의 동물이 연구 기간 동안 전이를 개발하지 않는다. MRI 및 PET/CT와 같은 이미징 모달을 사용하여 전이의 존재는 30일째부터 주사 후(PI)부터 검출할 수 있습니다. 이전 시점에서(예를 들어, 10 PI) 이미징은 전이성 질환을 일으킬 동물과 그렇지 않은 동물을 구별하지않는다(그림 1).

다음 프로토콜에 설명된 바와 같이 10PI일째에 획득한 기능성 이미징 매개변수에 대해 학습된 avNNet은 다음 ~3주 이내에 거시메타제의 성장을 안정적으로 예측하거나 배제합니다. 신경망은 서로 다른 계층 내에서 인공 노드를 결합합니다. 연구 프로토콜에서, 골수 혈액 공급 및 대사 활성을 위한 기능적인 화상 진찰 매개변수는 최상층을 나타내고, 악성종양의 예측은 상부 층을 나타낸다. 추가 중간 층에는 위쪽 레이어와 아래쪽 레이어모두에 연결된 숨겨진 노드가 포함됩니다. 서로 다른 노드 간의 연결 강도는 네트워크 학습 중에 업데이트되어 정확도가 높은^9로각각의 분류 작업을 수행합니다. 이러한 신경망의 정확도는 여러 모델의 출력을 평균화하여 더욱 증가할 수 있으며, 그 결과 avNNet^10이됩니다.

프로토콜

모든 치료 및 실험 절차는 동물 보호에 대한 국가 및 지역 법률에 따라 수행되었으며, 모든 동물 절차는 독일 프랑코니아 주 정부에 의해 승인되었습니다 (참조 번호 55.2 DMS-2532-2-228).

1. 누드 쥐의 오른쪽 뒷다리에 유방암 뼈 전이의 유도

참고 : 누드 쥐의 유방암 뼈 전이의 유도에 대한 자세한 설명은 다른 곳에서 출판되었습니다^6,,8. 가장 관련성이 가장 중요한 단계는 아래에 표시됩니다.

1. 배양 MDA-MB-231 RPMI-1640에 있는 인간적인 유방암 세포, 10% 태아 송아지 혈청으로 보충 (FCS). 세포를 표준 조건(37°C, 5%_CO2)으로유지하고 세포를 일주일에 2-3회 통과시한다.
2. 인산염 완충식식염(PBS)에 2mM EDTA로 거의 컨블릭 MDA-MB-231 세포를 세척한 다음 0.25%의 트립신으로 세포를 분리합니다. Neubauer의 챔버로 세포 농도를 결정하고 1.5 x 10⁵ 셀/200 μL의 농도에서 RPMI-1640의 200 μL에서 이를 재중단합니다.
3. 6-8주 된 누드 쥐를 사용하고 병원균이 없는 통제 조건(21°C ± 실온, 습도 60%, 12h 광진 리듬)에서 보관하십시오. 자동 사료와 물 광고 리비툼을 제공합니다.
4. 수술을 수행하기 전에 진통제 약물 (예 : Carprofen 4 mg / kg)을 피하하십시오. 이소플루란(1-1.5vol.%)/산소 혼합물을 2L/분의 유량으로 마취하여 쥐를 마취한다.
5. 수술의 경우 16배 배율로 수술 현미경을 사용하십시오.
6. 쥐의 오른쪽 잉구이 부위에서 2-3cm 컷을 수행합니다. 대퇴동맥(FA), 피상동맥(SEA), 내림차순 간동맥(DGA), 포라이트동맥(PA), 사페누아동맥(SA)을 포함한 올바른 영원 부위의 모든 동맥을 해부한다. FA에 두 개의 이동식 클립을 배치: 바다의 시작 부분에 하나의 근위, 다른 하나는 DGA의 시작 부분에 직접 근위.
7. 바다의 단면 부분을 리게이트합니다. SEA의 벽을 절단하고 바다에 0.3mm 직경의 바늘을 삽입합니다. 1.2단계에서 바늘에 세포 현탁액을 함유한 주사기를 연결한다. FA에서 분할 클립을 제거하고 대신 SA를 클립.
8. 1.2단계(1.5 x 10⁵ 셀/200 μL)에서 MDA-MB-231 세포 현탁액을 천천히 바다에 주입한다. 바늘을 제거하고 SEA를 리게이트하고 동맥 클립을 제거합니다. 수술 클립을 사용하여 상처를 닫고 마취를 종료합니다. 종양 크기와 통증의 증거를 평가하기 위해 매일 동물을 모니터링합니다.

2. 자기 공명 영상 (MRI)

참고: MRI 절차에 대한 자세한 설명은 베우얼 외^11을참조하십시오.

1. 전용 실험 스캐너(재료 표참조) 또는 적절한 동물 코일을 가진 인간 MR 시스템을 사용하여 MRI 10일 PI를 수행합니다.
2. 상기와 같이 이소플루란(1-1.5vol.%)/산소 혼합물로 쥐를 마취한다. 쥐의 꼬리 정맥에 카테터를 놓고 꼬리에 테이프를 놓습니다. 콘트라스트제를 포함하는 주사기를 연결한다(약 0.5mL에 0.1 mmol/kg Gd-DTPA).
3. 마취된 쥐를 MR 시스템에 배치합니다. 해부학 시퀀스(예: T2 가중 터보 스핀 에코 시퀀스)에서 오른쪽 뒷다리의 단위 대퇴골및 근접 경골을 찾아보겠습니다. TR = 8,654 ms; TE = 37 ms; 매트릭스 320 x 272; FOV = 65mm x 55mm; 슬라이스 두께 = 1mm; 스캔 시간 11:24 분).
4. 오른쪽 뒷다리의 단위 대퇴골과 근위 경골을 덮는 슬라이스를 결정하고 DCE-MRI 시퀀스를 시작합니다(예: 빠른 로우 앵글 샷 시퀀스; TR = 3.9 ms; TE = 0.88 ms; 매트릭스 = 256 x 216; FOV = 65 x 54 mm^2; 슬라이스 두께 = 1mm; 8 슬라이스; 100 시간 포인트; 스캔 시간 = 8:25 분). 30 초 후, 10 초의 기간 동안 조영제를 주입하기 시작합니다.
   참고: MRI 검사를 수행하는 총 시간은 동물 1인당 약 20분입니다.

3. 포지론 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 (PET/CT)

참고: PET 절차에 대한 자세한 설명은^청(12)을참조하십시오.

1. 전용 실험 스캐너를 사용하여 PET/CT 이미징 10일 PI를 수행합니다(재료 표참조).
2. 이미징 전에 동물을 금식 상태로 유지합니다. 2.2단계에서 설명된 대로 쥐를 마취시키고 위에서 설명한 바와 같이 꼬리 정맥에 카테터를 삽입한다.
3. 18F-플루오로옥시글루코스(18F-FDG)의 6MBq를 꼬리 정맥에 주입하고 트레이서가 제대로 분배할 수 있도록 ~30분 정도 기다린다. ¹⁸¹⁸
4. CT 획득(튜브 전압 = 80 kV, 튜브 전류 = 500 μA, 아이소트로픽 해상도 = 48.9 μm, 지속 시간 = 10분)을 수행한다.
5. 정적 PET 획득(아래/상부 차별 수준 = 350/650 keV; 타이밍 창 = 3.438 ns; 기간 = 15분)을 수행합니다.

4. 대체 이미징 전략

1. 뒷다리에 있는 MDA-MB-231 세포의 조기 평가를 위해, 생체 발광을 위한 1.5 x 10⁵ 표지된 세포/200 μL(즉, 루시페린을 발현하는 세포, MDA-MB-231-LUC¹³⁾또는 형광 이미징(즉, 녹색 또는 적색 형광 단백질, MDA-MB-231-GFP/RFP)을 접종한다.¹³ 종양 세포 접종 후 내 MDA-MB-231 세포를 검출하기 위해 전임상 광학 이미징을 위한 시스템을^{사용한다 14.}
2. MRI^7에필적하는 혈관의 형태학적 및 기능적 파라미터를 도출하기 위해 마이크로버블의 정맥 주입 후 전용 스캐너를 사용하여 실험 초음파를 수행한다.

5. MRI 분석

1. DCE^{플러그인(16)이} 있는 DICOM^{뷰어(15)를} 사용하고 상단 메뉴의"가져오기"버튼을 클릭하고, 2.4단계에서 MR 이미지가 포함된 DICOM 폴더를 선택하고 상단 메뉴에서"4D 뷰어"를클릭하여 DCE 시퀀스를 4D 모드로 로드합니다.
2. 1.5mm^2의대상 크기를 가진 원형 2차원 관심 영역(ROI)을 배치하고, 오른쪽 뒷다리의 근접 티비알 샤프트의 골수에, 바람직하게는 8개의 이미지로 구성된 시퀀스에서 이미지 번호 4 또는 5를 사용하는 것으로, 이러한 중심 이미지가 보다 안정적인 결과를 제공하기 때문에.
3. 상단 메뉴에서 DCE 플러그인을 시작하여"플롯 유형"필드에서"상대성 향상"을선택하고 각 필드에 이러한 숫자를 입력하여 시간 점 1에서 5까지의 기준 범위를 정의합니다. 각 버튼이 있는 .txt 파일로 분석을 내보내고 "DCEraw.txt"를 파일 이름으로 선택합니다.
4. RStudio^17을 열고 "파일"을 선택하여"파일"메뉴를 통해 제공된 DCE-Script.R파일을 로드합니다. "코드","실행 지역"을선택한 다음"모든 실행"을메뉴에서 선택하여 전체 스크립트를 실행합니다. 출력을 "ImagingFeatures.xlsx"라는 지정된 제공된 템플릿 파일에 복사합니다(그림2).
5. DICOM 뷰어에서는 동물의 후근육 내에 두 번째 ROI를 배치하고 5.2-5.4단계를 반복하여 정상화를 위해 근육 DCE 측정을 얻습니다. 스프레드시트 "ImagingFeatures.xlsx"내에서 각 골격 측정값은 정규화를 위해 각각의 근육 측정값으로 자동으로 나뉩니다.
6. 모든 동물에 대해 5.1-5.5 단계를 반복하고 스프레드시트를 완료합니다.

6. 애완 동물 / CT 분석

1. PET/CT 분석 소프트웨어를 열고"파일"을클릭한 다음"수동 가져오기"를클릭하여 3단계에서 얻은 데이터를 가져옵니다. ct.img.hd 및 pet.img.hdr 파일을 표시합니다. "를 클릭 "열고"모든 가져오기"를 선택합니다.
2. "일반분석"을선택하고 " OK"를 선택하여 데이터 집합을엽니다.
3. "ROI 정량화"를선택하고 "다음 "만들기",그리고"템플릿에서 ROI를 만듭니다". 오른쪽 뒷다리의 근접 티비알 샤프트의 골수에 약 4mm x 6mm의 2차원 ROI를 넣습니다.
4. "ROI(대상 1 오버레이)"를 선택하고 Bq/mL에서 평균, 최소 값 및 최대 값을 적어 둡니다.
5. 최대 표준화된 섭취량 값(SUV_최대값 계산): 주입된 활성으로 최대 값(Bq/mL)을 나누고 동물의 무게를 그램으로 곱합니다. 결과를 스프레드시트(그림2)에입력합니다.

7. 종양 복용 률 결정

1. 오른쪽 뒷다리의 종양 성장을 진단하려면 위에서 설명한 바와 같이 30PI일째에 MR 및 PET/CT 이미징을 반복하십시오.
   참고: 종양은 30일째 PI에 명확하게 표시되며, PET/CT의 SUV_최대값과 함께 MRI의 T2w-hyper강렬한 병변과 명확한 대비 향상을 특징으로 합니다. 이전 실험에 따르면, 동물의 60%-80%는 오른쪽 뒷다리에 전이를 개발할 것입니다.
2. 스프레드시트를 추가로 추가하여 "종양" 컬럼을 추가하고 전이를 제시하는 모든 동물에 대해 "1"을 입력하고, 눈에 보이는 종양 부담없이 모든 동물에 대해 "0"을 입력합니다(그림2). 스프레드시트를 다운로드 폴더 내에서 "ImagingFeatures.xlsx"로 저장합니다.

8. 기능 선택

1. 향후 종양 성장 예측을 위한 가장 관련성이 뛰어난 특징을 결정하기 위해 스프레드시트를 오픈 소스 데이터 시각화, 기계 학습 및 데이터 마이닝^{툴킷(18)으로}가져옵니다.
2. 데이터 메뉴에서 파일 하위 루틴을 오른쪽작업 공간으로 끌어서 두 번 클릭합니다. "폴더"아이콘을 클릭하고Folder파일 "ImagingFeatures.xlsx"를 선택하여 스프레드시트를 로드합니다. "내보내기"워크시트를 선택하고 대상 속성을 변수"종양"에할당합니다. "건너뛰기"기능을 동물번호(그림 3)에할당합니다.
3. 데이터 메뉴에서 "하위루틴"을 작업 공간으로 끌어서"파일"및"순위"하위 루틴을 연결합니다.
4. 아이콘을 두 번 클릭하여"순위"하위 루틴을 열고"정보 이득"알고리즘^19를선택합니다.
5. 5개의 획득된 매개 변수에서 추가 분석(SUV_최대,PE 및 AUC)을 위해 상위 3개 매개 변수를 사용합니다.
   참고: 이러한 매개 변수는 대사 활성(SUV_최대)및 조직 혈관화(PE 및 AUC)를 반영합니다.

9. ML 분석

1. RStudio 3.4.1^{1 17을} 열고 "파일" 메뉴를 통해 제공된 TrainModel.R-스크립트를로드합니다.
2. 입력하여 필요한 라이브러리를 설치합니다(이것은 한 번만 수행되어야 합니다): install.packages(c("카레트", "readxl", "pROC", "RcmdrPlugin.EZR", "ggplot2")))
3. 필요한 라이브러리를 로드하고 다운로드 폴더를 작업 디렉터리로 설정하려면 TrainModel.R 스크립트 내에서 3-5줄을 선택합니다.
4. 메뉴 내에서"코드"를클릭한 다음"선택한 줄 실행"을 클릭하여 선택한 코드를실행합니다.

10. avNNet ML 알고리즘 교육

1. avNNet 알고리즘을 학습하려면 TrainModel.R-Script에서 8-39 선을 선택합니다(9.1단계 참조).
2. 메뉴 내에서"코드"를클릭한 다음"선택한 줄 실행"을 클릭하여 선택한 코드를실행합니다.

11. ML 알고리즘의 결과 분석

1. 진단 정확도(민감도, 특이성, 양수 및 음수 예측 값 및 가능성 비율)의 표준 매개 변수를 평가하려면 TrainModel.R-Script에서 41-50선을 선택합니다.
2. 메뉴 내에서"코드"를클릭한 다음"선택한 줄 실행"을 클릭하여 선택한 코드를실행합니다.

12. 최종 모델의 수신기 작동 특성(ROC) 곡선과 구성 파라미터의 ROC 곡선 비교

1. DeLong의 테스트를 수행하여 모델의 ROC 곡선과 구성 매개 변수의 ROC 곡선을 비교하려면 TrainModel.R-Script에서 52-62 선을 선택합니다(9.1 단계 참조).
2. 메뉴 내에서"코드"를클릭한 다음"선택한 줄 실행"을 클릭하여 선택한 코드를실행합니다.

결과

쥐는 MDA-MB-231 유방암 세포의 수술 및 주입에서 빨리 회복하고 그 후에 10 및 30 PI(그림 1)에MR-및 PET/CT 화상 진찰을 복종하였다. 쥐의 오른쪽 근위 경골에 대한 대표적인 DCE 분석은 도 2A에제시된다. DCE 원시 측정값은"내보내기"버튼을 선택하고 "DCEraw.txt"를 파일 이름으로 선택하여 저장되었습니다.

동적 매개 변수, AUC, PE ?...

토론

ML 알고리즘은 여러 예측 기능을 결합된 모델에 통합하고 단독으로 사용할 때 별도의 구성 요소보다 높은 정확도를 얻는 데 사용되는 강력한 도구입니다. 그럼에도 불구하고 실제 결과는 몇 가지 중요한 단계에 따라 달라집니다. 첫째, 사용되는 ML 알고리즘은 다른 ML 알고리즘이 다른 결과를 산출하기 때문에 중요한 요소입니다. 이 프로토콜에 사용되는 알고리즘은 avNNet이지만 다른 유망한 알고리...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular Operating Microscope	Leica	NA
ClinScan MR System	Bruker	NA
DICOM Viewer	Horos	NA	www.horosproject.org
Excel: Spreadsheet	Microsoft	NA
FCS	Sigma	F2442-500ML
Gadovist	Bayer-Schering	NA
Inveon PET/CT	Siemens	NA
Inveon Research Workplace Software	Siemens Healthcare GmbH	NA
IVIS Spectrum	PerkinElmer	NA
MDA-MB-231 human breast cancer cells	American Type Culture Collection	N/A
Open-source data visualization, machine learning and data mining toolkit.	Orange3, University of Ljubljana	NA	https://orange.biolab.si/
RPMI-1640	Invitrogen/ThermoFisher	11875093
Trypsin	Sigma	9002-07-7
Vevo 3100	VisualSonics	NA