Algoritmi di apprendimento automatico per il rilevamento precoce delle metastasi ossee in un modello di ratto sperimentale

Riepilogo

Questo protocollo è stato progettato per addestrare un algoritmo di apprendimento automatico per utilizzare una combinazione di parametri di imaging derivati dalla risonanza magnetica (RMI) e dalla tomografia a emissione di positroni (PET/CT) in un modello di ratto delle metastasi ossee del cancro al seno per rilevare la malattia metastatica precoce e prevedere la successiva progressione alle macrometastasi.

Abstract

Gli algoritmi di apprendimento automatico (ML) consentono l'integrazione di diverse funzionalità in un modello per eseguire attività di classificazione o regressione con una precisione superiore ai relativi componenti. Questo protocollo descrive lo sviluppo di un algoritmo ML per prevedere la crescita delle macrometastasi ossee del cancro al seno in un modello di ratto prima che eventuali anomalie siano osservabili con metodi di imaging standard. Tale algoritmo può facilitare la diagnosi della malattia metastatica precoce (cioè la micrometastasi) che viene regolarmente persa durante gli esami di messa in scena.

Il modello di metastasi applicato è specifico del sito, il che significa che i ratti sviluppano metastasi esclusivamente nella gamba posteriore destra. Il tasso di acquisizione del tumore del modello è del 60%-80%, con macrometastasi che diventano visibili nella risonanza magnetica (RMI) e nella tomografia a emissione di positroni/TC (PET/CT) in un sottoinsieme di animali 30 giorni dopo l'induzione, mentre un secondo sottoinsieme di animali non presenta crescita tumorale.

Partendo dagli esami delle immagini acquisiti in un momento precedente, questo protocollo descrive l'estrazione di caratteristiche che indicano la vascolarizzazione del tessuto rilevata dalla risonanza magnetica, il metabolismo del glucosio da PET/CT e la successiva determinazione delle caratteristiche più rilevanti per la previsione della malattia macrometastatica. Queste caratteristiche vengono poi indotta in una rete neurale media del modello (avNNet) per classificare gli animali in uno dei due gruppi: uno che svilupperà metastasi e l'altro che non svilupperà alcun tumore. Il protocollo descrive anche il calcolo dei parametri diagnostici standard, come l'accuratezza complessiva, la sensibilità, la specificità, i valori predittivi negativi/positivi, i rapporti di probabilità e lo sviluppo di una caratteristica operativa del ricevitore. Un vantaggio del protocollo proposto è la sua flessibilità, in quanto può essere facilmente adattato per addestrare una pletora di diversi algoritmi ML con combinazioni regolabili di un numero illimitato di funzionalità. Inoltre, può essere utilizzato per analizzare diversi problemi in oncologia, infezione, e l'infiammazione.

Introduzione

Lo scopo di questo protocollo è integrare diversi parametri di imaging funzionale da RMI e PET/CT in un algoritmo ML di rete neurale media (avNNet) basato su modelli. Questo algoritmo prevede la crescita delle macrometastasi in un modello di ratto di metastasi ossee del cancro al seno in un momento precoce, quando i cambiamenti macroscopici all'interno dell'osso non sono ancora visibili.

Prima della crescita delle macrometastasi, si verifica un'invasione del midollo osseo delle cellule tumorali diffuse, comunemente indicata come malattia micrometastatica^1,2. Questa invasione iniziale può essere considerata un primo passo nella malattia metastatica, ma in genere viene persa durante gli esami di staging^{convenzionali 3,4}. Sebbene le modalità di imaging attualmente disponibili non siano in grado di rilevare la microinvasione del midollo osseo quando vengono utilizzate da sole, è stato dimostrato che una combinazione di parametri di imaging che producono informazioni sulla vascolarizzazione e sull'attività^{metabolica ha dimostrato di ottenere prestazioni migliori 5}. Questo vantaggio complementare si ottiene combinando diversi parametri di imaging in un avNNet, che è un algoritmo ML. Tale avNNet consente la previsione affidabile della formazione di macrometastasi ossee prima della presente di eventuali metastasi visibili. Pertanto, l'integrazione dei biomarcatori di imaging in un avNNet potrebbe servire come parametro surrogato per la microinvasione del midollo osseo e la malattia metastatica precoce.

Per sviluppare il protocollo, è stato utilizzato un modello precedentemente descritto di metastasi ossee per cancro al seno nei ratti nudi^6,7,8. Il vantaggio di questo modello è la sua site-specificità, il che significa che gli animali sviluppano metastasi ossee esclusivamente nella gamba posteriore destra. Tuttavia, il tasso di tumore-prendere di questo approccio è 60%-80%, quindi un numero considerevole di animali non sviluppano metastasi durante lo studio. Utilizzando modalità di imaging come MRe e PET/CT, la presenza di metastasi è rilevabile dal giorno 30 postinjection (PI). In precedenza, l'imaging (ad esempio, 10 PI) non distingue tra gli animali che svilupperanno malattie metastatiche e quelli non lo faranno (Figura 1).

Un avNNet addestrato sui parametri di imaging funzionale acquisiti il giorno 10 PI, come descritto nel seguente protocollo, predice o esclude in modo affidabile la crescita delle macrometastasi entro le seguenti 3 settimane. Reti neurali combinano nodi artificiali all'interno di diversi livelli. Nel protocollo di studio, i parametri di imaging funzionale per l'afflusso di sangue del midollo osseo e l'attività metabolica rappresentano lo strato inferiore, mentre la previsione della malignità rappresenta lo strato superiore. Un livello intermedio aggiuntivo contiene nodi nascosti connessi sia al livello superiore che a quello inferiore. La forza delle connessioni tra i diversi nodi viene aggiornata durante il training della rete per eseguire la rispettiva attività di classificazione con alta precisione⁹. La precisione di tale rete neurale può essere ulteriormente aumentata calcolando la media delle uscite di diversi modelli, con conseguente avNNet¹⁰.

Protocollo

Tutte le procedure di cura e di sperimentazione sono state eseguite in conformità con la legislazione nazionale e regionale in materia di protezione degli animali, e tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal governo statale della Franconia, Germania (numero di riferimento 55.2 DMS-2532-2-228).

1. Induzione di metastasi ossee da cancro al seno nella gamba posteriore destra di ratti nudi

NOTA: Una descrizione dettagliata dell'induzione di metastasi ossee di cancro al seno nei ratti nudi è stata pubblicata altrove^6,8. I passaggi più rilevanti sono presentati di seguito.

1. Cultura MDA-MB-231 cellule di cancro al seno umano in RPMI-1640, integrato con 10% siero di vitello fetale (FCS). Mantenere le cellule in condizioni standard (37 gradi centigradi, 5% CO₂) e passare le cellule 2-3 volte alla settimana.
2. Lavare le cellule MDA-MB-231 quasi confluenti con 2 mM EDTA in salina tamponata fosfato (PBS), quindi staccare le cellule con 0,25% di metapsina. Determinare la concentrazione cellulare con una camera di Neubauer e risunderle in 200 L di RPMI-1640 ad una concentrazione di 1,5 x^{10 5} cellule/200 L.
3. Usa ratti nudi di 6-8 settimane e tienili in condizioni controllate e senza agenti patogeni (21 gradi centigradi ± temperatura ambiente 2 gradi centigradi, 60% di umidità e ritmo chiaro-scuro di 12 h). Offrire mangimi autoclaved e acqua ad libitum.
4. Prima di eseguire l'intervento chirurgico, iniettare un farmaco analgesico (ad esempio, Carprofen 4 mg/kg) sottocutaneamente. Anestetizzare i ratti con un isoflurane (1–1,5 vol. %) miscela di ossigeno ad una velocità di flusso di 2 L/min. Controllare la profondità anestetica pizzicando.
5. Per la chirurgia, utilizzare un microscopio operativo con ingrandimento 16x.
6. Eseguire un taglio di 2-3 cm nella regione inguinale destra del ratto. Dizionare tutte le arterie nella regione inguinale destra, compresa l'arteria femorale (FA), l'arteria epigastrica superficiale (SEA), l'arteria genicolare discendente (DGA), l'arteria popliteale (PA) e l'arteria safenosa (SA). Posizionare due clip rimovibili sulla FA: una prossima all'inizio del SEA e un'altra direttamente prossima all'inizio della DGA.
7. Ligate la parte distale del SEA. Eseguire un taglio della parete della SEA e inserire un ago di 0,3 mm di diametro nel SEA. Collegare una siringa contenente la sospensione cellulare dal punto 1.2 all'ago. Rimuovere la clip distatale dalla FA e ritagliare la SA.
8. Iniettare lentamente la sospensione delle cellule MDA-MB-231 dal punto 1.2 (1,5 x^{10 5} celle/200 L) nel SEA. Rimuovere l'ago, ligare il SEA, e rimuovere le clip dell'arteria. Chiudere la ferita utilizzando clip chirurgiche e terminare l'anestesia. Monitorare gli animali ogni giorno per valutare le dimensioni del tumore e qualsiasi prova di dolore.

2. Risonanza magnetica (GG)

NOTA: per una descrizione dettagliata delle procedure di risonanza magnetica, vedere b'uerle et al.¹¹.

1. Eseguire la risonanza magnetica 10 giorni PI utilizzando uno scanner sperimentale dedicato (vedi Tabella dei materiali) o un sistema MR umano con una bobina animale appropriata.
2. Anestesizzare il ratto con un isoflurane (1–1,5 vol. %) /miscela di ossigeno come descritto sopra. Posizionare un catetere nella vena della coda del ratto e nastro adesivo alla coda. Collegare una siringa contenente l'agente di contrasto (0,1 mmol/kg Gd-DTPA in circa 0,5 mL).
3. Posizionare il ratto anetizzato nel sistema MR. Individuare il femore distale e la tibia prossimale della gamba posteriore destra in una sequenza anatomica (ad esempio, sequenza di eco turbo ponderata T2; TR - 8.654 ms; TE - 37 ms; matrice 320 x 272; FOV - 65 mm x 55 mm; spessore della sezione : 1 mm; tempo di scansione 11:24 min).
4. Determinare le fette che coprono il femore distale e la tibia prossimale della gamba posteriore destra e iniziare la sequenza DCE-MRI (ad esempio, sequenza di scatto ad angolo basso veloce; TR - 3,9 ms; TE - 0,88 ms; matrice : 256 x 216; FOV - 65 x 54 mm²; spessore della sezione : 1 mm; 8 fette; 100 punti di tempo; tempo di scansione : 8:25 min). Dopo 30 s, iniziare a iniettare l'agente di contrasto per un periodo di tempo di 10 s.
   NOTA: Il tempo totale per eseguire un esame di risonanza magnetica è di circa 20 min per animale.

3. Tomografia a emissione di positroni/tomografia computerizzata (PET/CT)

NOTA: per una descrizione dettagliata delle procedure PET, vedere Cheng all'al.¹².

1. Eseguire l'imaging PET/CT 10 giorni PRIMA utilizzando uno scanner sperimentale dedicato (vedere Tabella dei materiali).
2. Tenere gli animali digiunti prima dell'imaging. Anestetizzare il ratto come descritto al punto 2.2 e inserire un catetere nella vena della coda come descritto sopra.
3. Iniettare 6 MBq ^{di 18}F-Fluorodeoxyglucosio (¹⁸F-FDG) nella vena della coda e attendere 30 min per consentire al tracciante di distribuirsi correttamente.
4. Eseguire un'acquisizione di TC (tensione del tubo 80 kV, corrente del tubo , 500 1, risoluzione isotropica , 48,9 m, durata , 10 min).
5. Eseguire un'acquisizione di PET statica (livello discriminatorio inferiore/superiore: 350/650 keV; finestra di temporizzazione : 3,438 ns; durata 15 min).

4. Strategie di imaging alternative

1. Per una valutazione precoce delle cellule MDA-MB-231 nella gamba posteriore, inoculato 1,5 x^{10 5 cellule etichettate} /200 L per la bioluminescenza (cioè, cellule che esprimono luciferina, MDA-MB-231-LUC¹³) o imaging a fluorescenza (cioè cellule che esprimono proteine fluorante verdi o rosse, MDA-MB-231-GFP/RFP¹³). Utilizzare il sistema per l'imaging ottico preclinico per rilevare le cellule MDA-MB-231 infrazioni per il tumore dopo l'inoculazione^{delle cellule tumorali 14}.
2. Eseguire ultrasuoni sperimentali utilizzando uno scanner dedicato dopo l'iniezione endovenosa di microbolle per derivare parametri morfologici e funzionali della vascolarizzazione paragonabili alla risonanza magnetica⁷.

5. Analisi della risonanza magnetica

1. Utilizzare un visualizzatore DICOM¹⁵ con un dcE Plugin¹⁶ e caricare la sequenza DCE in modalità 4D facendo clic sul pulsante "Importa" nel menu superiore, selezionando la cartella DICOM contenente le immagini MR del passaggio 2.4 e facendo clic su "Visualizzatore 4D" nel menu in alto.
2. Posizionare una regione di interesse circolare bidimensionale (ROI), con una dimensione di destinazione di 1,5 mm², nel midollo osseo dell'albero tibiale prossimale della gamba posteriore destra, preferibilmente utilizzando i numeri di immagine 4 o 5 della sequenza costituita da 8 immagini, poiché queste immagini al centro forniscono risultati più stabili.
3. Avviare il plug-in DCE dal menu in alto, selezionare "Miglioramentorelativo " nel campo "Tipo distampa " e definire l'intervallo di base dai punti di riferimento 1 a 5 digitando questi numeri nei rispettivi campi. Esportare l'analisi come file .txt con il rispettivo pulsante e scegliere "DCEraw.txt" come nome del file.
4. Aprire RStudio¹⁷ e caricare il file DCE-Script.R fornito tramite il menu "File" selezionando "Apri file". Eseguire l'intero script selezionando "Code", quindi "Run Region" e quindi "Run All" dal menu. Copiare l'output nel file modello fornito denominato "ImagingFeatures.xlsx" (Figura 2).
5. Nel visualizzatore DICOM, posizionare un secondo ROI all'interno del muscolo posteriore dell'animale e ripetere i passaggi 5.2–5.4 per ottenere le misurazioni del MDD muscolare ai fini della normalizzazione. All'interno del foglio di calcolo "ImagingFeatures.xlsx", le rispettive misurazioni ossee vengono automaticamente divise per le rispettive misurazioni muscolari ai fini della normalizzazione.
6. Ripetere i passaggi da 5.1 a 5.5 per tutti gli animali e completare il foglio di calcolo.

6. Analisi PET/CT

1. Aprire il software di analisi PET/CT e importare i dati ottenuti nel passaggio 3 facendo clic su "File", seguito da "Importazione manuale". Contrassegnare i file ct.img.hd e pet.img.hdr. Fare clic su"Apri " e selezionare "Importa tutto".
2. Aprire i set di dati selezionando "Analisi generale", seguita da "OK".
3. Selezionare "ROI Quantificazione", seguita da "Crea", e quindi "Crea un ROI da un modello". Inserire un ROI bidimensionale di circa 4 mm x 6 mm nel midollo osseo dell'albero tibiale prossimale della gamba posteriore destra.
4. Selezionare "ROIs (Target 1 overlay)" e annotare i valori media, minimo e massimo in Bq/mL.
5. Calcolare il valore massimo standardizzato di assorbimento (SUV_max): Dividere il valore massimo (Bq/mL) per l'attività iniettata e moltiplicare il risultato per il peso dell'animale in grammi. Immettere il risultato nel foglio di calcolo (Figura 2).

7. Determinazione del tasso di recupero del tumore

1. Per diagnosticare la crescita del tumore nella gamba posteriore destra, ripetere l'imaging MR e PET/CT il giorno 30 PI, come descritto sopra.
   NOTA: I tumori saranno chiaramente visibili il giorno 30 PI e presentano lesioni T2w-iperintense e un chiaro miglioramento del contrasto nella risonanza magnetica, insieme a un SUV max chiaramente_elevato in PET/CT. Secondo gli esperimenti precedenti, il 60%-80% degli animali svilupperà metastasi nella gamba posteriore destra.
2. Completare il foglio di calcolo aggiungendo una colonna "Tumor" aggiuntiva e immettere "1" per ogni animale che presenta metastasi e "0" per ogni animale senza onere tumorale visibile (Figura 2). Salvare il foglio di calcolo come "ImagingFeatures.xlsx" all'interno della cartella Download.

8. Selezione delle caratteristiche

1. Per determinare le funzionalità più rilevanti per la previsione della crescita futura del tumore, importare il foglio di calcolo in un toolkit di visualizzazione dei dati open source, apprendimento automatico e data mining¹⁸.
2. Disegnare la subroutine File dal menu Dati nell'area di lavoro a destra e fare doppio clic su di essa. Caricare il foglio di calcolo facendo clicsull'icona"Cartella" e selezionando il file "ImagingFeatures.xlsx". Selezionare il fogliodi lavoro" Esporta " e assegnare l'attributo target alla variabile "Tumor". Assegnare la funzione "Skip" al numero di animali (Figura 3).
3. Disegnare la subroutine "Rank" dal menu Dati nell'area di lavoro e collegare le subroutine "File" e "Rank" disegnando una linea tra di esse.
4. Aprire la subroutine "Rank" facendo doppio clic sulla relativa icona e selezionare l'algoritmo "Information Gain"¹⁹.
5. Dai cinque parametri acquisiti, utilizzare i primi tre per ulteriori analisi (SUV_max, PE e AUC).
   Nota: Questi parametri riflettono l'attività metabolica (SUV_max)e la vascolarizzazione dei tessuti (PE e AUC).

9. Analisi ML

1. Aprire RStudio 3.4.1¹⁷ e caricare TrainModel.R-Script fornito tramite il menu" File".
2. Installare le librerie necessarie (questa operazione deve essere eseguita una sola volta) digitando: install.packages(c("caret", "readxl", "pROC", "RcmdrPlugin.E'R", "ggplot2"))
3. Per caricare le librerie necessarie e impostare la cartella Download come directory di lavoro, selezionare le righe da 3 a 5 all'interno dello script TrainModel.R.
4. Eseguire il codice selezionato facendo clic su "Codice" all'interno del menu, quindi su "Esegui righe selezionate".

10. Training di un algoritmo AVNNet ML

1. Per eseguire il training di un algoritmo avNNet, selezionare le righe da 8 a 39 da TrainModel.R-Script (vedere il passaggio 9.1).
2. Eseguire il codice selezionato facendo clic su "Codice" all'interno del menu, quindi su "Esegui righe selezionate".

11. Analisi dei risultati dell'algoritmo ML

1. Per valutare i parametri standard di accuratezza diagnostica (sensibilità, specificità, valori predittivi positivi e negativi e rapporti di probabilità), selezionare le righe 41-50 da TrainModel.R-Script.
2. Eseguire il codice selezionato facendo clic su "Codice" all'interno del menu, quindi su "Esegui righe selezionate".

12. Confronto della curva ROC (Receiver Operating Characteristic) del modello finale con le curve ROC dei suoi parametri costitutivi

1. Per eseguire i test di DeLong per confrontare la curva ROC del modello con le curve ROC dei relativi parametri costitutivi, selezionare le linee 52-62 da TrainModel.R-Script (vedere il passaggio 9.1).
2. Eseguire il codice selezionato facendo clic su "Codice" all'interno del menu, quindi su "Esegui righe selezionate".

Risultati

I ratti si sono ripresi rapidamente dall'intervento chirurgico e dall'iniezione delle cellule del cancro al seno MDA-MB-231 e sono stati quindi sottoposti a imaging MR e PET/CT nei giorni 10 e 30 PI (Figura 1). Un'analisi DCE rappresentativa della tibia prossimale destra di un ratto è presentata nella Figura 2A. Le misurazioni non prime DCE sono state salvate selezionando il pulsante"Esporta"e scegliendo "DCEraw.txt" come nome del file.

Discussione

Gli algoritmi ML sono potenti strumenti utilizzati per integrare diverse funzionalità predittive in un modello combinato e ottenere una precisione che supera quella dei suoi costituenti separati quando vengono utilizzati da soli. Ciò nonostante, il risultato effettivo dipende da diversi passaggi critici. In primo luogo, l'algoritmo ML utilizzato è un fattore cruciale, perché diversi algoritmi ML producono risultati diversi. L'algoritmo utilizzato in questo protocollo è un avNNet, ma altri algoritmi promettenti inclu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular Operating Microscope	Leica	NA
ClinScan MR System	Bruker	NA
DICOM Viewer	Horos	NA	www.horosproject.org
Excel: Spreadsheet	Microsoft	NA
FCS	Sigma	F2442-500ML
Gadovist	Bayer-Schering	NA
Inveon PET/CT	Siemens	NA
Inveon Research Workplace Software	Siemens Healthcare GmbH	NA
IVIS Spectrum	PerkinElmer	NA
MDA-MB-231 human breast cancer cells	American Type Culture Collection	N/A
Open-source data visualization, machine learning and data mining toolkit.	Orange3, University of Ljubljana	NA	https://orange.biolab.si/
RPMI-1640	Invitrogen/ThermoFisher	11875093
Trypsin	Sigma	9002-07-7
Vevo 3100	VisualSonics	NA