Алгоритмы машинного обучения для раннего обнаружения метастазов костей в экспериментальной модели крыс

Резюме

Этот протокол был разработан для обучения алгоритма машинного обучения для использования комбинации параметров визуализации, полученных из магнитно-резонансной томографии (МРТ) и позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) в крысиной модели метастазов в кости рака молочной железы для выявления ранних метастатических заболеваний и прогнозирования последующего прогрессирования макрометастазы.

Аннотация

Алгоритмы машинного обучения (ML) позволяют интеграцию различных функций в модель для выполнения задач классификации или регрессии с точностью, превышающей ее составляющие. Этот протокол описывает разработку алгоритма ML для прогнозирования роста макрометастазы костей молочной железы в крысиной модели до того, как какие-либо аномалии можно будет наблюдать стандартными методами визуализации. Такой алгоритм может способствовать выявлению ранних метастатических заболеваний (т.е. микрометастаза), которые регулярно пропускаются во время постановочных обследований.

Прикладная модель метастазов специфична для сайта, что означает, что у крыс метастазы развиваются исключительно в правой задней ноге. Скорость опухоли модели составляет 60%-80%, при этом макрометастасы становятся видимыми в магнитно-резонансной томографии (МРТ) и позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии (ПЭТ/КТ) в подмножестве животных через 30 дней после индукции, в то время как второй подмножество животных не имеет роста опухоли.

Начиная с изображений, полученных в более ранний момент времени, этот протокол описывает экстракции особенностей, которые указывают на васкуляризацию тканей обнаружены МРТ, метаболизм глюкозы ПЭТ / КТ, и последующее определение наиболее актуальных особенностей для прогнозирования макрометастатического заболевания. Эти функции затем подается в модели усредненные нейронной сети (avNNet), чтобы классифицировать животных в одну из двух групп: одна, которая будет развиваться метастазы, а другой, который не будет развиваться каких-либо опухолей. Протокол также описывает расчет стандартных диагностических параметров, таких как общая точность, чувствительность, специфичность, отрицательные/позитивные прогностический значения, коэффициенты вероятности и развитие операционной характеристики приемника. Преимуществом предлагаемого протокола является его гибкость, поскольку он может быть легко адаптирован для обучения множеству различных алгоритмов ML с регулируемыми комбинациями неограниченного числа функций. Кроме того, он может быть использован для анализа различных проблем в онкологии, инфекции и воспаления.

Введение

Целью данного протокола является интеграция нескольких функциональных параметров визуализации из МРТ и ПЭТ/КТ в алгоритм M МЛ, усредненные по модели нейронной сети (avNNet). Этот алгоритм предсказывает рост макрометастазы в крысиной модели метастазов костей рака молочной железы в раннее время, когда макроскопические изменения внутри кости еще не видны.

До роста макрометастазы происходит вторжение костного мозга в рассеянные опухолевые клетки, обычно называемые микрометастатическим^{заболеванием 1,,2.} Это первоначальное вторжение можно считать ранним шагом в метастатических заболеваний, но, как правило, пропустили во время обычных^{постановочных обследований 3,4}. Хотя имеющиеся в настоящее время методы визуализации не могут обнаружить микроинвазивность костного мозга при использовании в одиночку, было показано, что сочетание параметров изображения, дать информацию о васкуляризации и метаболической^{активности, было}показано, что работает лучше 5 . Это дополнительное преимущество достигается путем объединения различных параметров изображения в avNNet, который является алгоритмом ML. Такой avNNet позволяет надежно прогнозировать образование макрометастазы костей до того, как побудут видны метастазы. Таким образом, интеграция биомаркеров изображений в avNNet может служить в качестве суррогатного параметра микроинвазивности костного мозга и ранних метастатических заболеваний.

Для разработки протокола была использована ранее описанная модель метастазов костей рака молочной железы у^{обнаженных крыс 6,,7,,8.} Преимуществом этой модели является ее специфичность сайта, а это означает, что животные развивают костлявые метастазы исключительно в правой задней ноге. Тем не менее, уровень опухоли принять этот подход составляет 60%-80%, так что значительное число животных не развиваются какие-либо метастазы во время исследования. Используя такие методы визуализации, как МРТ и ПЭТ/КТ, наличие метастазов обнаруживается с 30-го дня после внравия (PI). В более ранние моменты времени (например, 10 PI) визуализация не проводит различия между животными, которые будут развиваться метастатические заболевания и те не будут (Рисунок 1).

AvNNet, обученный функциональным параметрам изображения, приобретенным на 10-й день PI, как описано в следующем протоколе, надежно предсказывает или исключает рост макрометастазы в течение следующих 3 недель. Нейронные сети объединяют искусственные узлы в разных слоях. В протоколе исследования функциональные параметры визуализации кровоснабжения костного мозга и метаболической активности представляют нижний слой, в то время как предсказание злокачественности представляет верхний слой. Дополнительный промежуточный слой содержит скрытые узлы, которые соединены как с верхним, так и с нижним слоем. Сила соединений между различными узлами обновляется во время тренировки сети для выполнения соответствующей задачи классификации с высокой точностью^9. Точность такой нейронной сети может быть дополнительно увеличена за счет усреднения выходов нескольких моделей, в результате чего avNNet¹⁰.

протокол

Все процедуры по уходу и экспериментам проводились в соответствии с национальным и региональным законодательством об охране животных, и все процедуры по защите животных были утверждены правительством штата Франкония, Германия (справочный номер 55.2 DMS-2532-2-228).

1. Индукция метастазов костей рака молочной железы в правой задней ноге обнаженных крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание индукции метастазов кости рака молочной железы в обнаженных крыс была опубликована в другом месте^6,8. Наиболее актуальные шаги представлены ниже.

1. Культура MDA-MB-231 раковых клеток молочной железы человека в RPMI-1640, дополненный 10% фетальной сыворотки теленка (FCS). Держите клетки в стандартных условиях (37 градусов по Цельсию, 5% CO₂) и пролетая клетки 2-3 раза в неделю.
2. Вымойте почти слияние клеток MDA-MB-231 с 2 мМ ЭДТА в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), а затем отсоедините клетки с 0,25% трипсина. Определите концентрацию клеток с помощью камеры Нойбауэра и будем повторно использовать их в 200 МКЛ RPMI-1640 при концентрации 1,5^{х 10 5} клеток/200 МКЛ.
3. Используйте 6-8 недельных обнаженных крыс и держите их под патогенными, контролируемыми условиями (21 градус по Цельсию ± 2 градуса комнатной температуры, 60% влажности и 12 ч светло-темного ритма). Предложение автоклавированных кормов и воды объявление libitum.
4. Перед операцией вводите обезболивающее препарат (например, карпрофен 4 мг/кг) подкожно. Анестезировать крыс с изофлураном (1-1,5 воль. %) / кислородной смеси со скоростью потока 2 л / мин. Проверьте анестезию глубины ног щипать.
5. Для операции используйте операционный микроскоп с 16-х увеличением.
6. Выполните 2-3 см вырезать в правой паховой области крысы. Рассекаете все артерии в правой паховой области, включая бедренную артерию (FA), поверхностную эпигастрическую артерию (SEA), нисходящую геникулярную артерию (DGA), поплитаную артерию (PA) и сафенозную артерию (SA). Поместите два съемных клипа на FA: один проксимальный к началу SEA, а другой непосредственно проксимальный к началу DGA.
7. Ligate дистальной части SEA. Выполните разрез стены SEA и вставьте иглу диаметром 0,3 мм в SEA. Подключите шприц, содержащий подвесную клетку, от шага 1.2 к игле. Удалите дистальный клип из FA и клип SA вместо.
8. Медленно ввишать подвеску клетки MDA-MB-231 из шага 1.2 (1.5^{x 10 5} клеток/200 L) в SEA. Удалите иглу, лигат SEA, и удалить артерии клипы. Закройте рану хирургическими зажимами и прекратите анестезию. Мониторинг животных ежедневно, чтобы оценить размер опухоли и любые доказательства боли.

2. Магнитно-резонансная томография (МРТ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробного описания процедур МРТ, пожалуйста, см.¹¹

1. Выполните МРТ 10 дней PI с помощью специального экспериментального сканера (см. Таблица материалов)или человеческой системы MR с соответствующей катушки животных.
2. Обезболить крысу изофлураном (1-1,5 вол.%) /кислородной смесью, как описано выше. Поместите катетер в хвостовую вену крысы и приклеив его к хвосту. Подключите шприц, содержащий контрастное вещество (0,1 ммоль/кг Gd-DTPA примерно в 0,5 мл).
3. Поместите анестезировалую крысу в систему MR. Найдите дистальной бедренной кости и проксимальной голени правой задней ноги в анатомические последовательности (например, T2-взвешенный турбо спина эхо последовательности; ТР 8654 мс; ТЭ No 37 мс; матрица 320 x 272; FOV 65 мм x 55 мм; толщина ломтика 1 мм; время сканирования 11:24 мин).
4. Определите ломтики, покрывающие дистальной бедренной кости и проксимальной голени правой задней ноги и начать DCE-MRI последовательности (например, быстрый низкий угол выстрела последовательности; ТР 3,9 мс; ТЭ 0,88 мс; матрица No 256 x 216; FOV 65 x 54 мм²; толщина ломтика 1 мм; 8 ломтиков; 100 очков времени; время сканирования 8:25 мин). После 30 с, начать инъекционные контрастного агента в течение периода времени 10 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время для проведения МРТ-обследования составляет около 20 минут на животное.

3. Позитронно-эмиссионная томография/компьютерная томография (ПЭТ/КТ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробного описания процедур ПЭТ, пожалуйста, смотрите Чэн на al.¹².

1. Выполните ПЭТ/КТ визуализацию 10 дней PI с помощью специального экспериментального сканера (см. Таблицу материалов).
2. Держите животных поститься до изображения. Обезботь крысу, как описано в шаге 2.2 и вставить катетер в хвостовой вены, как описано выше.
3. Ввись 6 MBq ¹⁸F-Fluorodeoxyglucose⁽¹⁸F-FDG) в хвостовую вену и подождите 30 мин, чтобы позволить трассировщику правильно распределить.
4. Выполните приобретение КТ (напряжение трубки 80 кВ, ток трубки 500 ЗА, изотропное разрешение 48,9 мкм, продолжительность 10 мин).
5. Выполните статическое приобретение ПЭТ (нижний/верхний дискриминационный уровень - 350/650 кВ; тайминг-окно - 3,438 н; продолжительность - 15 мин).

4. Альтернативные стратегии визуализации

1. Для ранней оценки клеток MDA-MB-231 в задней ноге, привить 1,5 х 10^{5 помеченных} клеток /200 МКЛ для биолюминесценции (т.е. клеток, выражаюющих люциферин, MDA-MB-231-LUC^{13) или флуоресценции}изображений (т.е. клетки, выражаюющие зеленый или красный флуоресцентный белок, MDA-MB-231-GFP/RFP¹³). Используйте систему для доклинковой оптической визуализации для обнаружения интраоссозных клеток MDA-MB-231 после прививки опухолевых^{клеток 14}.
2. Выполните экспериментальное УЗИ с помощью специального сканера после внутривенной инъекции микробузы для получения морфологических и функциональных параметров васкуляризации, сопоставимых с МРТ^7.

5. МРТ-анализ

1. Используйте DICOM viewer¹⁵ с DCE Plugin^{16 и} загрузите последовательность DCE в 4D-режиме,нажавкнопку «Импорт» в верхнем меню, выбрав папку DICOM, содержащую MR-изображения из шага 2.4, инажав «4D Viewer»в верхнем меню.
2. Поместите круговую 2-мерную область интереса (ROI), с целевым размером 1,5^{мм 2}, в проксимальной области костного мозга вала правой задней ноги, предпочтительно с помощью изображений номера 4 или 5 из последовательности, состоящей из 8 изображений, так как эти центральные изображения обеспечивают более стабильные результаты.
3. Запустите плагин DCE из верхнего меню, выберите«Относительноеулучшение» в поле«Типучастка» и определите базовый диапазон от точек времени 1 до 5, введя эти числа в соответствующие поля. Экспорт анализа в качестве файла .txt с соответствующей кнопкой и выбрать "DCEraw.txt" в качестве названия файла.
4. Откройте RStudio^{17 и} загрузите предоставленный файл DCE-Script.R через меню«Файл»,выбрав«Открытый файл». Запустите весь скрипт, выбрав «Code », затем« Run Region»,а затем «Run All» из меню. Копирование вывода в предоставленный файл шаблона под названием "ImagingFeatures.xlsx"(рисунок 2).
5. В DICOM зрителя, место второй рентабельности инвестиций в задней мышцы животного и повторить шаги 5,2-5,4 для получения мышц DCE измерений для целей нормализации. В электронной таблице "ImagingFeatures.xlsx" соответствующие измерения костей автоматически делятся соответствующими измерениями мышц для целей нормализации.
6. Повторите шаги 5.1-5.5 для всех животных и заполуйте электронную таблицу.

6. ПЭТ/КТ-анализ

1. Откройте программное обеспечение для анализа ПЭТ/КТ и импортуте данные, полученные в шаге3,нажав кнопку «Файл », а затем«ручнойимпорт». Отметь файлы ct.img.hd и pet.img.hdr. Нажмите"Открыть"и выберите" Импортировать все".
2. Откройте наборы данных, выбрав"Общий анализ",а затем"OK".
3. Выберите "ROI Квантификация", а затем" Создать", а затем "Создать рентабельность инвестиций из шаблона". Поместите двухмерную рентабельность инвестиций примерно 4 мм х 6 мм в проксимальный грудной вал костного мозга правой задней ноги.
4. Выберите"ROIs (целевая накладка 1)" и запишите средние, минимальные и максимальные значения в Bq/mL.
5. Рассчитайте максимальное стандартизированное значение поглощения (SUV_max):разделите максимальное значение (Bq/mL) на впрыскиваемую активность и умножьте результат на вес животного в граммах. Введите результат в электронную таблицу(рисунок 2).

7. Определение скорости опухоли

1. Чтобы диагностировать рост опухоли в правой задней ноге, повторите МРТ и ПЭТ/ КТ изображения на день 30 PI, как описано выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли будут хорошо видны на день 30 PI и функция T2w-гиперинтенсивных поражений и четкое повышение контрастности в МРТ, наряду с четко повышенным внедорожник_макс в ПЭТ / КТ. Согласно предыдущим экспериментам, 60%-80% животных будут развиваться метастазы в правой задней ноге.
2. Завершите электронную таблицу, добавив дополнительный столбец "Tumor" и введите "1" для каждого животного, которое представляет метастазы, и "0" для каждого животного без видимого бремениопухоли (рисунок 2). Сохраните электронную таблицу как "ImagingFeatures.xlsx" в папке Загрузки.

8. Выбор функций

1. Чтобы определить наиболее релевантные функции для прогнозирования будущего роста опухоли, импортируем электронную таблицу в визуализацию данных с открытым исходным кодом, машинное обучение и инструментарий для^{сбора данных 18.}
2. Нарисуйте подпрограмму файлов из меню Data в рабочее пространство справа и дважды щелкните его. Загрузите электронную таблицу, нажав на значок"Folder"и выбрав файл "ImagingFeatures.xlsx". Выберите лист«Экспорт»и назначьте целевой атрибут переменной«Опухоль». Присвоитьфункцию"Пропустить" номеру животного(рисунок 3).
3. Нарисуйтеподпрограмму «Rank» из меню Data в рабочее пространство и соедините подпрограммы«Файл»и «Rank», нарисовав грань между ними.File
4. Откройтеподпрограмму«Rank», дважды нажав на значок, и выберите алгоритм«Информационнаяприбыль»¹⁹.
5. Из пяти приобретенных параметров используйте тройку лидеров для дальнейшего анализа (SUV_max,PE и AUC).
   Примечание: Эти параметры отражают метаболическую активность (SUV_max)и васкуляризацию тканей (PE и AUC).

9. Анализ ML

1. Откройте RStudio 3.4.1¹⁷ и загрузите предоставленный TrainModel.R-Script черезменю «Файл».
2. Установка необходимых библиотек (это нужно сделать только один раз) путем ввода: install.packages (c ("caret", "readxl", "pROC", "RcmdrPlugin.EZR", "ggplot2"))
3. Чтобы загрузить необходимые библиотеки и установить папку Загрузки в качестве рабочего каталога, выберите строки 3-5 в скрипте TrainModel.R.
4. Вы запустите выбранный код, нажав" Код" в меню, а затем "Вы запустите выбранную строку (ы)".

10. Обучение алгоритму avNNet ML

1. Для обучения алгоритму avNNet выберите строки 8-39 из TrainModel.R-Script (см. шаг 9.1).
2. Вы запустите выбранный код, нажав" Код" в меню, а затем "Вы запустите выбранную строку (ы)".

11. Анализ результатов алгоритма ML

1. Для оценки стандартных параметров диагностической точности (чувствительность, специфичность, положительные и отрицательные прогнозные значения и коэффициенты вероятности) выберите линии 41-50 из TrainModel.R-Script.
2. Вы запустите выбранный код, нажав" Код" в меню, а затем "Вы запустите выбранную строку (ы)".

12. Сравнение кривой операционной характеристики приемника окончательной модели (ROC) с кривыми ROC ее составных параметров

1. Для выполнения тестов DeLong для сравнения кривой ROC модели с кривыми ROC составляющих параметров выберите линии 52-62 из TrainModel.R-Script (см. шаг 9.1).
2. Вы запустите выбранный код, нажав" Код" в меню, а затем "Вы запустите выбранную строку (ы)".

Результаты

Крысы быстро оправились от операции и инъекции клеток рака молочной железы MDA-MB-231, а затем подверглись МРА- и ПЭТ/ КТ изображений в дни 10 и 30 PI (Рисунок 1). Представитель DCE анализ правой проксимальной голени крысы представлен на рисунке 2A. Необработанные из?...

Обсуждение

Алгоритмы ML являются мощными инструментами, используемыми для интеграции нескольких прогностический элемент в комбинированную модель и получения точности, превышающей точность отдельных компонентов при использовании в одиночку. Тем не менее, фактический результат зависит от нескол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular Operating Microscope	Leica	NA
ClinScan MR System	Bruker	NA
DICOM Viewer	Horos	NA	www.horosproject.org
Excel: Spreadsheet	Microsoft	NA
FCS	Sigma	F2442-500ML
Gadovist	Bayer-Schering	NA
Inveon PET/CT	Siemens	NA
Inveon Research Workplace Software	Siemens Healthcare GmbH	NA
IVIS Spectrum	PerkinElmer	NA
MDA-MB-231 human breast cancer cells	American Type Culture Collection	N/A
Open-source data visualization, machine learning and data mining toolkit.	Orange3, University of Ljubljana	NA	https://orange.biolab.si/
RPMI-1640	Invitrogen/ThermoFisher	11875093
Trypsin	Sigma	9002-07-7
Vevo 3100	VisualSonics	NA