植物の抽出物と分率から新しい抗菌分子と抗バイオフィルム分子を同定し、齲蝕を予防する体系的アプローチ

要約

天然物は、新薬および治療薬の開発の有望な出発点を表しています。しかし、化学的多様性が高いため、植物から新しい治療化合物を見つけることは困難で時間のかかる作業です。植物抽出物および分画から抗菌分子および抗バイオフィルム分子を同定するための簡便なアプローチを説明する。

要約

天然物は、構造的に異なる物質を提供し、無数の生物学的活動を提供します。しかし、植物からの活性化合物の同定と分離は、複雑な植物マトリックスと時間のかかる分離および同定手順のために困難です。そこで、潜在的に活性な分子の単離および同定を含む植物由来の天然化合物をスクリーニングするための段階的アプローチが提示される。それは植物材料のコレクションを含みます。粗抽出物の調製と分画;クロマトグラフィーおよび分光法(UHPLC-DAD-HRMSおよびNMR)の分析および化合物同定のためのアプローチ;バイオアッセイ(抗菌および抗バイオフィルム活性;選択された治療で治療された唾液ペリクルおよび初期グルカンマトリックスへの細菌の「接着強度」);データ分析を行います。モデルは簡単で、再生可能で、複数の化合物、濃度および処置ステップのハイスループットスクリーニングを一貫して制御することができる。得られたデータは、最も活性な抽出物および/または画分を含む製剤、分子の単離、微生物細胞およびバイオフィルム内の特定の標的への分子のモデリングを含む、将来の研究のための基礎を提供する。例えば、齲蝕原性バイオフィルムを制御する1つの標的は、細胞外マトリックスのグルカンを合成する レンサ球菌変異体 グルコシルトランスファーーゼの活性を阻害するものである。これらの酵素の阻害は、バイオフィルムの蓄積を防ぎ、その毒性を低下させる。

概要

社会で使用される医学の最も初期のモデルは、天然物(NP)に基づいていました。それ以来、人間は、薬物¹に変換することができる自然界の新しい化学物質を探しています。この探索は、民族植物スクリーニング^1、2、3の技術と方法の継続的な改善を引き起こした。NPは構造的に多様な物質の豊富な供給源を提供し、代替療法やアジュバント療法の開発に役立つ幅広い生物学的活動を提供しています。しかし、固有の複雑な植物マトリックスは、活性化合物の分離と同定を困難で時間のかかる作業⁴にします。

NPsベースの薬物または製剤は、口腔に影響を与えるいくつかの状態を予防および/または治療するために使用することができます, 歯科用虫歯を含む⁴.世界的に最も流行している慢性疾患の一つである齲蝕は、糖が豊富な食生活と微生物のバイオフィルム(歯垢)の相互作用に由来し、歯面に形成され、微生物代謝に由来する有機酸によって生じる脱灰化につながり、治療しなければ、歯の損失^5,6を引き起....

プロトコル

1. 植物材料の回収

1. 植物材料
   1. コレクションが行われる国の遺伝的遺産へのアクセスを規制する電子プラットフォーム上の植物材料へのアクセスを記録します。例えば、ブラジルでは、遺伝的遺産と関連する伝統的知識の管理のための国家システムに登録する - SisGen (ウェブサイト https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx)。
   2. 目的の植物材料(例えば、葉、茎、根、花、果実)のサンプルを収集します。物質が生殖または栄養段階で収集された場合に登録します。
   3. 収集パラメータ(日付、ジオリファレンス、年間平均気温、平均湿度率)を記録します。
   4. サンプルを正確に特定し、分類学者は真正性を確認する必要があります。
2. 植物サンプル安定化および貯蔵
   1. コレクションの直後に、個々のビニール袋またはフラスコに植物器官を分ける。
   2. (i)液体窒素中で直ちに凍結し、(ii)循環式エアーオーブン(40°C)で脱水するか、または(iii)凍結乾燥により試料を凍結乾燥させることにより、潜在的な酵素反応を不活性化する。
   3. 安定した材料は、室温または冷凍庫で密閉された袋に保管し、使用するまで(-20または-80°C、保管期間または使用目的に応じて) 保管してください。
   4. 分析用ミル(組織の種類や入手可能性に応じてナイフまたは....

結果

我々は、植物抽出物および分画の生物学的活性をスクリーニングする体系的なアプローチを用いて、新しい抗齲虫療法の可能性のある活性分子を同定する例を提供する:ストレプトコッカス・ミュータンスおよびカンジダ・アルビカンス¹³に対するブラジルの異なるバイオームからのカゼリアシルベストリス抽出物の抗菌および抗バイオフィルム活性。

.......

ディスカッション

天然の粗抽出物の研究に関連する主な課題は、その複雑な組成と古典的な生体誘導分離研究の不十分さから成り立っています。このプロセスは遅いですが,効果的であり,NP研究における主要な知見につながっています。合理化には、優先順位付け主導型の研究が必要です。したがって、分離前のCEおよび非複製の分析のための現代の化学プロファイリングアプローチの使用は、研究された材料?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microplates	Kasvi	Flat bottom
Activated carbon	LABSYNTH	Clean up and/or fractionation step
Analytical mill	Ika LabortechniK	Model A11 Basic
Blood agar plates	Laborclin
Chromatographic column C18	Phenomenex Kinetex	150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	Vehicle solution
ELISA plate reader	Biochrom Ez
Ethanol	J. T. Baker	For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol	Sigma-Aldrich	Vehicle solution
Ethyl acetate	J. T. Baker	Fractionation step
GraphPad Software	La Jolla	GraphPad Prism7
Hexane	J. T. Baker	Fractionation step
Incubator	Thermo Scientific
Isopropanol	J. T. Baker	For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer)	Savant	Modulyo
Nylon Millipore	LAC	0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker	Quimis	Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge	Macherey-Nagel	Clean up and/or fractionation step
Silica gel	Merck	40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl)	Synth	0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE)	Macherey-Nagel	Clean up and/or fractionation step
Tryptone	Difco
UHPLC-DAD	Dionex	Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath	UNIQUE	Model USC 2800
Yeast extract	Difco