Abordagem Sistemática para Identificar Novas Moléculas antimicrobianas e antibiofilmes de extratos e frações de plantas para prevenir cárie dentária

Resumo

Os produtos naturais representam pontos de partida promissores para o desenvolvimento de novas drogas e agentes terapêuticos. No entanto, devido à alta diversidade química, encontrar novos compostos terapêuticos das plantas é uma tarefa desafiadora e demorada. Descrevemos uma abordagem simplificada para identificar moléculas antimicrobianas e antibiofilmes a partir de extratos e frações vegetais.

Resumo

Os produtos naturais fornecem substâncias estruturalmente diferentes, com uma miríade de atividades biológicas. No entanto, a identificação e o isolamento de compostos ativos das plantas são desafiadores devido à complexa matriz vegetal e aos procedimentos demorados de isolamento e identificação. Por isso, é apresentada uma abordagem stepwise para a triagem de compostos naturais das plantas, incluindo o isolamento e identificação de moléculas potencialmente ativas. Inclui a coleta do material vegetal; preparação e fracionamento de extratos brutos; abordagens de cromatografia e espectrometria (UHPLC-DAD-HRMS e NMR) para análise e identificação de compostos; bioensações (atividades antimicrobianas e antibiofilmes; "força de adesão" bacteriana à pellícula salivar e matriz glucana inicial tratada com tratamentos selecionados); e análise de dados. O modelo é simples, reprodutível e permite a triagem de alto rendimento de múltiplos compostos, concentrações e passos de tratamento podem ser consistentemente controlados. Os dados obtidos fornecem a base para estudos futuros, incluindo formulações com extratos e/ou frações mais ativos, isolamento de moléculas, modelagem de moléculas para alvos específicos em células microbianas e biofilmes. Por exemplo, um alvo para controlar o biofilme cariogênico é inibir a atividade de glucosyltransferases da matriz extracelular que sintetizam os glúcanos da matriz extracelular. A inibição dessas enzimas impede o acúmulo de biofilme, diminuindo sua virulência.

Introdução

Os primeiros modelos de medicina utilizados nas sociedades foram baseados em produtos naturais (NPs). Desde então, os humanos têm procurado por novos produtos químicos na natureza que possam ser transformados em drogas¹. Essa pesquisa causou uma melhoria contínua das tecnologias e métodos para a triagem etnobotânica^1,2,3. Os NPs oferecem uma rica fonte de substâncias estruturalmente diversas, com uma ampla gama de atividades biológicas úteis para o desenvolvimento de terapias alternativas ou adjuvantes. No entanto, a matriz vegetal complexa inerente torna o isolamento e identificação dos compostos ativos uma tarefa desafiadora e demorada⁴.

Medicamentos ou formulações baseadas em NPs podem ser usados para prevenir e/ou tratar várias condições que afetam a oral, incluindo cárie dentária⁴. A cárie dentária, uma das doenças crônicas mais prevalentes globalmente, deriva da interação da dieta rica em açúcar e dos biofilmes microbianos (placa dentária) formados na superfície dentária que leva à desmineralização causada por ácidos orgânicos derivados do metabolismo microbiano e, se não tratados, leva à perda de dentes^5,6. Embora outros microrganismos possam estar associados⁷, Streptococcus mutans é uma bactéria cariogênica crítica porque é acidogênica, aciduric, e um construtor de matriz extracelular. Esta espécie codifica múltiplos exoenzymes (por exemplo, glicosyltransferases ou Gtfs) que usam sacarose como substrato⁸ para construir a matriz extracelular rica em exopolysacarídeos, que são um determinante virulência⁹. Além disso, os fungos Candida albicans podem impulsionar a produção dessa matriz extracelular⁷. Embora o flúor, administrado em diversas modalidades, continue sendo a base para a prevenção da cárie dentária¹⁰, novas abordagens são necessárias como adjuvantes para aumentar sua eficácia. Além disso, as modalidades anti-placa disponíveis baseiam-se no uso de agentes microbicidais de amplo espectro (por exemplo, clorexidina)¹¹. Como alternativa, as NPs são terapias potenciais para o controle de biofilmes e prevenção de cárie dentária^12,13.

O avanço adicional na descoberta de novos compostos bioativos das plantas inclui etapas ou abordagens necessárias, tais como: (i) o uso de protocolos confiáveis e reprodutíveis para amostragem, considerando que as plantas frequentemente apresentam variabilidade intraespecífica; (ii) a elaboração de extratos abrangentes e suas respectivas frações em pequena escala; (iii) a caracterização e/ou dereplicação de seus perfis químicos pensou na aquisição de dados multidimensionais como GC-MS, LC-DAD-MS ou NMR, por exemplo; (iv) a utilização de modelos viáveis e de alto rendimento para avaliar a bioatividade; v A seleção de novos hits potenciais com base na análise de dados multivariados ou outras ferramentas estatísticas; vi Realizar o isolamento e purificação dos compostos direcionados ou candidatos promissores; e (vii) a validação das atividades biológicas correspondentes utilizando os compostos isolados^2,14.

A dereplicação é o processo de identificação rápida de compostos conhecidos em extrato bruto e permite diferenciar novos compostos daqueles que já foram estudados. Além disso, esse processo previne o isolamento quando a bioatividade já foi descrita para determinados compostos, e é particularmente útil detectar "rebatedores frequentes". Tem sido usado em diferentes fluxos de trabalho não-alvo, desde a identificação de compostos principais ou a aceleração do fracionamento guiado pela atividade até o perfil químico das coleções de extratos. Pode ser totalmente integrado com estudos metabolômicos para o perfil químico não direcionado de CE ou a identificação direcionada de metabólitos. Tudo isso, em última análise, leva à priorização de extratos antes dos procedimentos de isolamento^1,15,16,17.

Portanto, no presente manuscrito, descrevemos uma abordagem sistemática para identificar moléculas antimicrobianas e antibiofilmes a partir de extratos e frações vegetais. Inclui quatro etapas multidisciplinares: (1) coleta de material vegetal; (2) elaboração de extratos brutos (CE) e frações (CEF), seguidos de sua análise de perfil químico; (3) bioensaios; e (4) análises de dados biológicos e químicos(Figura 1). Assim, apresentamos o protocolo desenvolvido para analisar as atividades antimicrobianas e antibiofilmes de extratos e frações de Casearia sylvestris contra Streptococcus mutans e Candida albicans^13,bem como os procedimentos para a caracterização fitoquímica e análise de dados. Para simplificar, o foco aqui é demonstrar a abordagem para a triagem de compostos naturais usando a bactéria.

Figura 1: Fluxograma da Abordagem Sistemática para identificar moléculas ativas de extratos e frações de plantas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Coleta de Material Vegetal

1. Material vegetal
   1. Regissei o acesso ao material vegetal em plataformas eletrônicas que regulam o acesso ao patrimônio genético no país onde ocorrerá a coleta. Por exemplo, no Brasil, registre-se no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado – SisGen (site https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
   2. Coletar amostras do material vegetal de interesse (por exemplo, folhas, caules, raízes, flores, frutas). Registre se o material foi coletado durante a fase reprodutiva ou vegetativa.
   3. Regissos parâmetros de coleta (data, georreferenciamento, temperatura média anual e percentual médio de umidade).
   4. Identifique as amostras com precisão, e um taxonomista deve confirmar a autenticidade.
2. Estabilização e armazenamento de amostras de plantas
   1. Separe os órgãos vegetais em sacos plásticos individuais ou frascos imediatamente após as coletas.
   2. Inativar reações enzimáticas potenciais por (i) congelamento imediato em nitrogênio líquido, (ii) desidratação em um forno de ar circulante (40 °C), ou (iii) congelamento das amostras por liofilização.
   3. Armazene o material estabilizado em sacos hermeticamente lacrados à temperatura ambiente ou em um congelador até o uso (-20 ou -80 °C, dependendo do período de armazenamento ou do uso pretendido).
   4. Triture as amostras em um moinho analítico (faca ou bola, dependendo do tipo de tecido ou disponibilidade) e padronize o tamanho das partículas usando peneiras padronizadas.
   5. Pesar as amostras individualmente para as etapas de extração subsequentes.

2. Preparação de Extratos Brutos (CE) e Frações (CEF) para Análise de Perfil Químico e Bioensaões

1. Elaboração de Extratos Brutos (CE)
   NOTA: As etapas são ilustradas no fluxograma na Figura 2A.
   1. Prepare um solvente de extração com uma mistura hidroalcoólica (por exemplo, etanol (EtOH) 70% ou misturas ternárias de água, EtOH e outros modificadores, definidos pelo desenho experimental de segundo relatórios anteriores).
   2. Use a razão de peso amostral (peso seco, mg)/ solvente de extração (mL) variando de 50 a 100 mgs para cada mL de solvente.
   3. Para extrações rápidas e reprodutíveis, use extrações em lote usando microtubos.
      NOTA: Pelo menos três réplicas devem ser utilizadas neste momento para permitir a análise estatística.
   4. Realize extrações assistidas por ultrassom (EAU) para torná-lo rápido, fácil e barato.
   5. Repita o procedimento três vezes (15 min cada) para obter a melhor eficiência.
   6. Após cada etapa de extração, decante o resíduo sólido por centrifugação e remova o sobrenante.
   7. Combine os supernantes individualmente, filtre e salve alíquotas para análise química simultânea e bioensações. Se necessário, remova o solvente extrato sob vácuo, fluxo de nitrogênio ou liofilização, e registre a pesagem e o rendimento.
   8. Armazene a -20 °C protegido contra a luz.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui para tela do CE e selecionar os que apresentam a atividade desejada.
2. Fracionamento de Extratos Brutos (CEF)
   NOTA: As etapas são ilustradas no fluxograma na Figura 2B.
   1. Use cartuchos com pelo menos 1 g de adsorbent. Se os alcaloides estiverem potencialmente presentes no CE, utilize solventes contendo 0,1% de ácido fórmico (FA).
   2. Diluir a amostra na mistura de solvente (ou solvente) mais adequada para obter uma solução de amostra de 100 mg/mL. Em seguida, transfira 1 mL da solução amostral para um cartucho de extração em fase sólida - SPE (1 g de adsorbent, 6 mL de capacidade).
   3. Realize o fracionamento utilizando cerca de três volumes mortos de cada eluente de extração (a um cartucho de 1 g, ele corresponderá a 2 mL de cada solvente). Se os alcaloides estiverem potencialmente presentes no CE, utilize solventes contendo 0,1% de FA.
   4. Colete uma fração por composição eluente e salve alíquotas para análise química simultânea e bioensações.
   5. Remova o solvente sob vácuo, fluxo de nitrogênio ou liofilização e registre a pesagem e o rendimento.
      NOTA: Se o CE for difícil de dissolver na mistura inicial de elução, disperse o CE em uma fase sólida (por exemplo, C₁₈ ou celite) em proporção de 1:1 (w/w) antes de carregar o material na parte superior do cartucho.
      ATENÇÃO: Pesar os microtubos com antecedência para calcular o rendimento em massa de extratos e frações.
3. Análise de perfil químico
   NOTA: Considerando que cada espécie de planta requer métodos otimizados e específicos para sua análise química, nas seguintes seções, descrevemos as abordagens analíticas mais comuns utilizadas para analisar materiais vegetais. Como exemplo prático, foi desenvolvida e validada uma cromatografia líquida em fase inversa para a análise simultânea de compostos fenólicos e diterpenos do tipo clerodano, autenticadas diferenciadamente por duas variedades de Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). O aparelho UPLC-DAD foi equipado com um degasser, uma bomba quaternária, um sampler automático, um detector de matriz de fotodiodo UV-Vis e um forno (veja detalhes em Bueno et al. 2015¹⁸). Abordagens semelhantes descritas nos exemplos a seguir podem ser otimizadas de acordo com outras espécies vegetais e/ou materiais vegetais.
   1. Análise cromatográfica e possibilidades de hifenização
      1. Para separações utilizando cromatografia líquida de alto desempenho (UPLC), use uma coluna cromatográfica C₁₈ (por exemplo, 150 × 2,1 mm, 2,6 μm, 100 Å) protegida por uma pré-coluna compatível.
         NOTA: Outras fases de coluna ou modos cromatográficos podem ser usados dependendo da espécie/material da planta. O HPLC convencional também pode ser usado; Nesse caso, deve-se escolher uma coluna cromatográfica adequada. Para obter excelentes separações, ajuste as condições cromatográficas considerando a taxa de fluxo (μL/min), temperatura da coluna (°C) e volume de injeção (μL). A fase móvel geralmente consiste em água (A) e acetonitrilo ou metanol (B) usando gradientes de elução linear ou multicamada ou eluição isocrática. Modificadores como buffers, ácidos, bases ou outros também podem ser usados.
      2. Realize a análise do material vegetal (CE e/ou CEF) e registre todos os dados relacionados, como dados espectrais (utilizando um UV-Vis e/ou, preferencialmente, detectores de MS), tempo de retenção (min) e outros, dependendo da hifenização disponível.
         NOTA: A cromatografia líquida (LC) é geralmente hifenizada (acoplada) com espectrometria de massa de alta resolução (HRMS), como LC-HRMS, e é comumente usada para a rápida anotação de metabólito em CE ou CEF¹⁵.
      3. Se forem necessários dados qualitativos e dados quantitativos, prepare-se cuidadosamente e injete curvas de calibração, seguindo o mesmo protocolo.
         NOTA: O desenvolvimento das melhores condições cromatográficas pode ser realizado com o auxílio do desenho de experimentos, conforme descrito por Bueno et al. 2015¹⁸, ou literatura semelhante. É importante considerar a inclusão de normas internas durante o desenvolvimento do método. Eles são muito apreciados, pois permitem desvios técnicos corretos durante a preparação e injeções da amostra, e uma maior normalização para análise de dados.
4. Análise de dados univariados e multivariados
   1. Exporte os cromatógramas registrados em formato adequado (por exemplo, ASCII, .txt. ou .csv formato). Uma única matriz de dados pode ser definida unindo e alinhando os cromatógrafos se várias amostras estiverem sendo analisadas, e comparações são necessárias. As matrizes resultantes devem ser normalizadas os cromatogramas de acordo com o padrão interno utilizado.
   2. Analise os dados de metabolômica da planta usando métodos multivariados e univariados. Explorar e visualizar conjuntos de dados metabolômicos através da análise simultânea de múltiplas variáveis utilizando métodos estatísticos multivariados, incluindo análise de componentes principais não supervisionadas (PCA) e análise hierárquica de clustering (HCA), ou análise de menos quadrados parciais supervisionados (como PLS, OPLS, PLS-DA). Métodos univariados, como ANOVA, Student's, Tukey e Welch's t-test, são especialmente interessantes para a análise precisa das diferenças quantitativas entre as amostras¹⁹.
5. Anotação de dereplicação e compostos
   NOTA: O objetivo desta etapa é dedicar-se à rápida identificação on-line de NPs conhecidos para evitar o isolamento tedioso que possa ser realizado simultaneamente à análise de dados uni ou multivariada.
   1. Realize os níveis de identificação dos compostos detectados ou alvos:
      1. Composto identificado, incluindo estrutura 3D completa e estereoquímica (nível 0);
      2. Identificação alcançada por dois parâmetros ortogonais, como tempo de retenção e espectro MS/MS (nível 1);
      3. Compostos anotados e classes compostas (níveis 2 e 3);
      4. Metabólitos não identificados ou não classificados que podem ser diferenciados com base em dados analíticos (nível 4)^19,20.
   2. Caracterizar os compostos conhecidos utilizando os bancos de dados comerciais ou públicos. Entre as bases de dados mais importantes, destacam-se: NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) e a Rede Molecular Social global de Produtos Naturais – Banco de Dados GNPS (https://gnps.ucsd.edu)¹⁹.
      NOTA: Existem diferentes níveis de anotações e dependem da técnica hifenizada empregada durante o estudo e podem incluir: a assistência de bancos de dados espectrais baseados em MS- (ou NMR) e em algoritmos de previsão espectral silico.
   3. Isolamento, purificação e identificação completa de compostos
      NOTA: Se um determinado composto (cuja identidade foi suspeita pelos métodos estatísticos) precisa de identificação estrutural completa, o primeiro passo para realizar essa tarefa é isolar e purificar os compostos desejados em maior escala. Pode ser realizado ampliando os protocolos já desenvolvidos.
      1. Realizar o isolamento rápido e direto do composto alvo (s) por técnicas cromatográficas preparatórias bem estabelecidas e otimizadas. O HPLC semi-preparatório com injeção de carga seca pode ser usado para evitar os compromissos que geralmente precisam ser feitos entre o carregamento elevado e a solubilização da amostra¹.
      2. Realizar a caracterização estrutural completa e identificação de compostos isolados. Isso pode ser feito através da combinação de diferentes técnicas:
         1. Ressonância Magnética Nuclear (RMN);
         2. Espectrometria de massa (MS);
         3. Técnicas espectrométricas nas regiões ultravioleta (UV) e infravermelha (IR) também são muito úteis para a caracterização dos grupos funcionais;
         4. O uso de espectroscopia quiroptical como o dicroísmo circular eletrônico e vibracional (ECD e VCD, respectivamente), a atividade óptica de Raman (ROA) e a cristalografia de raios-X são técnicas importantes para caracterização de configuração absoluta.

3. Bioensações

NOTA: Triagem biológica: Para avaliar rapidamente a bioatividade potencial da CE e da CEF, a triagem inicial de substâncias naturais deve ser organizada e direta.

1. Preparação de CE e CEF para bioensa de ensaios
   1. Reconstitua a matéria seca com os melhores solventes possíveis (que podem ser determinados experimentalmente). O projeto experimental^21,22 definem a solução de estoque e a concentração de solventes.
   2. Calcule a concentração de solventes da solução de estoque. Para isso, utilize a fórmula: C₁ x V₁ = C₂ x V₂, onde C₁ representa a solução de estoque (mg) de CE e/ou CEF; V₁ representa o volume do solvente; C₂ é o peso do CE e/ou CEF; V₂ é o volume final (mL) da solução de estoque.
      NOTA: Por exemplo, selecionamos 84,15% EtOH e 15% de sulfóxido de dimetil (DMSO) como a concentração de solventes da solução de estoque. Preparamos a concentração de estoque do CE a 6 mg/mL e da CEF a 1 mg/mL¹³. O solvente para diluir o CE e a CEF dependerá do método de avaliação da atividade biológica. O solvente utilizado como veículo não deve interferir na atividade biológica e toxicológica. Normalmente, a água, DMSO, EtOH ou um solvente aquoso à base de EtOH é usado para solubilizar extratos de plantas ou derivados de plantas^4,13.
2. Preparação de organismos de teste
   1. Reativar uma cepa microbiana, por exemplo S. mutans UA159 em ágar de sangue (48 h, 37 °C, 5% CO₂), e cultvá-lo em meio de cultura líquida (por exemplo, broto extrato de fônton-levedura [TYE: 2,5% (w/v) triptona com 1,5% (w/v) extrato de levedura] contendo 1% de glicose (w/v) (TYEg) para 16 h, 37° C, 5% CO₂.
   2. Realizar uma diluição de 1:20 da cultura inicial do microrganismo no mesmo meio de cultura (a razão de diluição da cultura inicial pode mudar de acordo com o desenho experimental).
   3. Incubar até chegar à fase de crescimento do registro médio.
   4. Prepare o inóculo para bioensaudidos com uma população definida (por exemplo, 2x10⁶ unidades formadoras de colônias por mililitro - CFU/mL) em TYEg para ensaios antimicrobianos e TYE com 1% de sacarose (w/v) (TYEs) para ensaios de biofilmes.
      NOTA: As condições de crescimento dependerão do microrganismo testado.
3. Atividade antimicrobiana
   NOTA: As etapas são ilustradas na Figura 3.
   1. Em uma placa de 96 poços, adicione uma alíquota (μL) da solução de estoque CE e/ou CEF (tratamentos). O volume da alíquota é definido pela concentração do teste, que deve ser selecionada com base em estudos anteriores. Por exemplo, para testar ce na concentração de teste de 0,5 mg/mL, use uma alíquota de 16,67 μL da solução de estoque a 6 mg/mL. Para este cálculo, use a fórmula: C₁ x V₁ = C₂ x V₂, onde C₁ é a concentração de estoque, V₁ é o volume da alíquota da solução de estoque, C₂ é a concentração de teste, e V₂ é o volume da placa de 96-well (que corresponde a 200 μL). Nesta condição experimental, a concentração de teste dos solventes (veículo) será de 7% EtOH e 1,25% DMSO.
   2. Incluir um conjunto de controles para cada placa: uma coluna com tratamentos, sem o inóculo (controle em branco por tratamento, ajuda a diferenciar a turbidez pelo tratamento utilizado a partir do crescimento microbiano); uma coluna com veículo e inóculo (diluído de controle CE ou CEF ou 0 mg/mL); uma coluna com apenas o meio de cultura (controle médio da cultura) e uma coluna com apenas inóculo (controle de crescimento microbiano).
   3. Usando TYEg, ajuste o volume para 100 μL. Em seguida, incubar, por exemplo, 24h, 37 °C, 5% de CO₂ (dependendo do microrganismo testado).
   4. Inocular 100 μL de microrganismo inóculo (1x 10⁶ CFU/mL) na placa de 96 poços.
   5. Analisar o crescimento bacteriano de acordo com a turbidez por inspeção visual dos poços (claro ou nublado). Claro: significa que não há crescimento visual do microrganismo. Nublado: significa que há crescimento visual do microrganismo.
   6. Medindo a absorvância (densidade óptica ou O.D.) da cultura bacteriana em cada poço (leitor ELISA usando 540 nm). Em seguida, transfira 100 μL das culturas para microtubos contendo 900 μL de solução salina (0,89% NaCl), misture bem por vórtice. Em seguida, continue realizando uma diluição serial dez vezes maior até o valor desejado.
   7. Inocular uma alíquota da diluição desejada em placas específicas de ágar (em duplicata). Por exemplo, 10 μL de uma diluição específica em placas de ágar de sangue.
   8. Incubar. As condições podem mudar entre microrganismos, por exemplo, S. mutans: 48 h, 37 °C, 5% CO₂.
   9. Realizar colônia conta com as placas para posterior transformação em UFC/mL como (Um_{número de colônias} x 10ⁿ)/q. Nesta fórmula,ⁿ é igual ao valor absoluto da diluição (0, 1, 2 ou 3), e q é igual à quantidade, em mL, pipetada para cada diluição banhada na placa de ágar. Além disso, a CFU/mL pode ser convertida em valores de log.
      NOTA: Quando os extratos vegetais são adicionados ao meio da cultura, pode ocorrer precipitação de partículas dos extratos. Esse fato pode dificultar a interpretação dos resultados. O mesmo ocorre quando um leitor de microplacândia mede a turbidez como, em alguns casos, as células se aglomeram na parte inferior da microplacão. Além disso, dependendo do extrato utilizado, a cor dos extratos de folhas vegetais pode dificultar a quantificação da turbidez^23,24. Um método alternativo usa corantes que revelam se as células microbianas são metabolicamente ativas ou não²⁴.
4. Atividade antibiofilm
   NOTA: As etapas para avaliar o efeito dos tratamentos na formação de biofilme são ilustradas na Figura 4.
   1. Formação e processamento de biofilmes
      1. Tratamentos diluídos em meio de cultura (TYEs) em uma placa de 96 poços como descrito nas etapas do protocolo de Atividade Antimicrobiana.
      2. Incubar a placa. No exemplo com S. mutans, a incubação é realizada durante 24 h, a 37 °C, e 5% DE CO₂.
      3. Após a incubação, coloque as placas em um agitador orbital (5 min, 37 °C, 75 rpm) para soltar as células não aderidas ao biofilme. Em seguida, descarte o meio de cultura contendo as células não aderidas e lave os biofilmes restantes três vezes com 0,89% de NaCl para remover células não aderentes.
   2. Quantificação da biomassa a partir de biofilmes tratados
      NOTA: As etapas são ilustradas no fluxograma na Figura 4A.
      1. Mantenha os biofilmes lavados na placa e adicione 50 μL de solução aquosa cristalina de 1% para cada poço.
      2. Incubar a placa em temperatura ambiente por 35 minutos.
      3. Lave os poços manchados com água MilliQ (três vezes) e depois seque-os por 60-90 min.
      4. Elute o violeta cristalina dos poços manchados com 200 μL de 99% EtOH incubando a placa em um agitador orbital (5 min, 37 °C, 75 rpm).
      5. Transfira uma alíquota de 150 μL de cada poço com o corante elucido para outra placa e quantifique a biomassa amostral (leitor ELISA 570 nm).
   3. Quantificação da população microbiana viável (UFC/mL) dos biofilmes tratados
      NOTA: As etapas são ilustradas no fluxograma na Figura 4B.
      1. Remova os biofilmes lavados da placa com uma pipeta e 200 μL de NaCl 0,89% e transfira a suspensão resultante individualmente para microtubos estéreis.
      2. Utilize um adicional de 200 μL de NaCl 0,89% por poço e transfira-o para o tubo correspondente, já contendo 200 μL da suspensão inicial do biofilme. Realize este processo até atingir uma suspensão total de 1 mL biofilm por poço original.
      3. Use uma alíquota de cada tubo para realizar uma diluição serial de dez vezes.
      4. Inocular uma alíquota da diluição desejada em placas específicas de ágar (em duplicata). Por exemplo, 10 μL de uma diluição específica em placas de ágar de sangue.
      5. Incubar placas de ágar (por exemplo, 48 h, 37 °C, 5% CO₂), em seguida, contar as colônias para determinar a UFC/mL como descrito acima.
5. Fase de validação da atividade biológica
   1. Formação de pellicle salivar
      1. Use contas de hidroxiapatita (HA) (Macro-Prep Cerâmica Hydroxyapatite Tipo I 80 μm) como superfície para formar o filme salivar²⁵. Essas contas superfamem esmalte dentário.
      2. Pesar as contas HA (por exemplo, 10 mg) em microtubos e esterilizar. Em seguida, use o buffer de adsorção (buffer AB: 50 mM KCl, 1 mM KPO₄, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, em dd-H2O, pH 6.5]²⁵ contendo 0,1 mM de fenilmtilasulfonil fluoreto (PMSF) e 0,02% de azida de sódio (NaN₃) para lavar as contas.
      3. Coletar e preparar saliva humana²⁶. É necessário ter aprovação do Comitê de Ética Institucional.
      4. Adicione 500 μL de saliva em microtubos e incubar (40 min, 37 °C, 24 rpm).
      5. Em seguida, remova a supernasa de saliva e lave as contas (três vezes com tampão AB contendo PMSF e NaN₃). As contas sHA (contas HA com pellicle salivar) estão agora prontas para ensaios a jusante.
         NOTA: A saliva é coletada de voluntários saudáveis. Após a coleta, dilui a saliva (1: 1 v/v) com tampão AB e centrífuga (1699 x g, 20 min, 4 °C). Esterilizar por filtração (filtro de membrana polietroésulfone com baixa ligação a 0,22 μm de proteínas)²⁶. O Comitê de Ética Institucional deve aprovar o estudo. No nosso caso, o Comitê de Ética da Instituição aprovou o estudo (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
   2. Desprendimento de S. mutans após adesão ao filme salivar e glucas tratados com extratos selecionados
      1. Cultive o microrganismo até a fase de crescimento do registro médio, conforme descrito acima.
      2. Quando as culturas atingiram o desejado O.D., centrífuga (4000 × g por 20 min), lave com solução de 0,89% NaCl e resuspenja a pelota com 0,89% NaCl utilizando o mesmo volume inicial do meio de cultura.
      3. Se usar um estreptococos, como S. mutans,sonicar as culturas com uma sonda para dechain (30 s, 7 W, três vezes). Se usar um único organismo celular, este passo pode ser ignorado.
      4. Verifique a O.D. (540 nm) para ajustar a concentração para 2 x 10⁶ UFC/mL.
   3. Adesão de S. mutans à pellicle salivar (sHA) e desprendimento de células aderidas
      NOTA: As etapas são ilustradas no fluxograma na Figura 5.
      1. Obtenha as amostras de sHA conforme descrito acima.
      2. Adicione uma alíquota (por exemplo, adicionamos 500 μL) de tratamentos selecionados (na concentração de teste; por exemplo, 0,5 mg/mL) ou controles em microtubos contendo amostras de sHA.
      3. Incubar as amostras de sHA com tratamentos ou controles (30 min, 37 °C, 24 rpm); em seguida, lave as contas três vezes com tampão AB (contendo PMSF e NaN₃).
      4. Adicione a cultura do microrganismo. No exemplo, adicionamos 500 μL de cultura S. mutans (2 x 10⁶ UFC/mL) a cada microtubo.
      5. Incubar (1h, 37 °C, 24 rpm) e, em seguida, remover células sem saída lavando três vezes com tampão AB.
      6. Resuspend cada amostra com uma alíquota (no exemplo, adicionamos 1000 μL) de tampão AB e sonicato com uma sonda (30 s, 7 W).
      7. Use uma alíquota de cada suspensão para uma diluição serial de dez vezes para determinar o número de colônias viáveis, emplacando em placas específicas de ágar (48 h, 37 °C, 5% CO₂). Em seguida, conte as colônias para determinar a UFC/mL como descrito acima.
         NOTA: A etapa do sonicato é realizada para desacopr as células aderidas ao sHA.
   4. Adesão de S. mutans à matriz glucano inicial(gsHA) e desprendimento de células aderidas
      NOTA: As etapas são ilustradas no fluxograma na Figura 6. A enzima GtfB foi purificada da cultura supernacante Streptococcus milleri KSB8 projetada para produzir GtfB. A purificação foi realizada com uma coluna de cromatografia contendo contas de hidroxiapatita utilizando tampões contendo dois inibidores de protease (0,1 mM PMSF e 0,02% NaN₃)^27,28. Em seguida, a enzima foi verificada em gel de acrilamida (SDS-PAGE) e manchada com nitrato de prata. As alíquotas da enzima foram armazenadas a -80 °C até o uso.
      1. Obtenha as amostras de sHA conforme descrito acima. Em seguida, adicione uma alíquota (no exemplo, adicionamos 500 μL) de enzima GtfB a cada tubo e incubamos em um homogeneizador (40 min, 37 °C, 24 rpm). Em seguida, lave três vezes com tampão AB (contendo PMSF e NaN₃).
      2. Adicione uma alíquota (por exemplo, 500 μL) de substrato de sacarose (100 mmol de sacarose) contendo os tratamentos (ou controles na concentração de teste, por exemplo, 0,5 mg/mL) a cada microtubo.
      3. Incubar as amostras em um homogeneizador (4h, 37 °C, 24 rpm). Em seguida, realize três lavagens com tampão AB (com PMSF e NaN₃) para remover os tratamentos e o excesso de sacarose não incorporados nos glucas sintetizados (amostras de gsHA).
      4. Adicione uma alíquota (no exemplo, adicionamos 500 μL) de S. mutans inóculo (2 x 10⁶ CFU/mL) a cada microtubo.
      5. Incubar em um homogeneizador (1 h, 37 °C, 24 rpm) e lavar três vezes com tampão AB (com PMSF e NaN₃) para remover células sem saída.
      6. Resuspend cada amostra com uma alíquota (por exemplo, 1000 μL) de tampão AB (com PMSF e NaN₃) e sonicato com uma sonda para desacoplar células aderidas a gsHA (30 s, 7 W).
      7. Use uma alíquota de cada suspensão para uma diluição serial de dez vezes para determinar o número de colônias viáveis, emplacando em placas específicas de ágar (48 h, 37 °C, 5% CO₂). Em seguida, conte as colônias para determinar a UFC/mL como descrito acima.

4. Análise de Dados Biológicos

1. Bioensaensiagens Dados
   1. Insira dados brutos para os bioensadores em uma planilha. Calcule o registro da inibição do crescimento microbiano por cada tratamento como (UMA_{UFC/mL de tratamentos} + 1) x log₁₀. Em seguida, calcule a porcentagem de registro da inibição do crescimento microbiano, em comparação com o uso do controle do veículo (A_{log10 CFU/mL de tratamento}/média A_{log10 CFU/mL de controle do veículo}) x 100%.
   2. Correto O.D. de culturas planctônicas e biomassa tratadas por tratamentos (grupos tratados ce e CEF) e por controle veicular (controle negativo). Para correção, subtraia a absorção de poços tratados daquele obtido em poços contendo apenas meio de cultura (Ablank) como_{(Agrupos tratados médio} /A meio de controle negativo ) x 100%.
   3. Após essa correção, calcule o percentual da inibição da biomassa, em comparação com o controle do veículo como_{(Biomassa tratada/controle médio}de veículo A ) x 100%.
   4. Envie os dados brutos gerados para análise estatística dos dados utilizando software específico.
      NOTA: A interpretação da eficácia de um determinado tratamento é determinada por meio de pontos de ruptura, como o IC_50/IC90. Esses valores são definidos como a concentração mínima de um tratamento capaz de inibir 50% e 90%, respectivamente, de crescimento bacteriano ou formação de biofilme²⁴. Esses parâmetros podem ajudar a interpretar os dados e fornecer uma base para a seleção de compostos com melhor atividade^13,29.

Resultados

Fornecemos um exemplo de utilização de uma abordagem sistemática para triagem da atividade biológica de extratos e frações vegetais para identificar moléculas potencialmente ativas para possíveis novas terapias anticaspas: atividades antimicrobianas e antibiofilmas de extratos de Casearia sylvestris de biomas brasileiros distintos contra estreptococos mutadores e Candida albicans¹³.

Fundo
Interações complexas entr...

Discussão

Os principais desafios relacionados ao trabalho com extratos naturais brutos compreendem sua composição complexa e as inadequações de estudos clássicos de isolamento biogui guiado. Embora esse processo seja lento, é eficaz e levou a grandes descobertas na pesquisa de PN. Para racionalizar, são necessários estudos orientados à priorização para racionalizar. Assim, o uso de abordagens químicas modernas para análise de CE e desreplicação antes do isolamento são importantes para caracterizar o material estuda...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microplates	Kasvi	Flat bottom
Activated carbon	LABSYNTH	Clean up and/or fractionation step
Analytical mill	Ika LabortechniK	Model A11 Basic
Blood agar plates	Laborclin
Chromatographic column C18	Phenomenex Kinetex	150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	Vehicle solution
ELISA plate reader	Biochrom Ez
Ethanol	J. T. Baker	For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol	Sigma-Aldrich	Vehicle solution
Ethyl acetate	J. T. Baker	Fractionation step
GraphPad Software	La Jolla	GraphPad Prism7
Hexane	J. T. Baker	Fractionation step
Incubator	Thermo Scientific
Isopropanol	J. T. Baker	For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer)	Savant	Modulyo
Nylon Millipore	LAC	0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker	Quimis	Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge	Macherey-Nagel	Clean up and/or fractionation step
Silica gel	Merck	40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl)	Synth	0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE)	Macherey-Nagel	Clean up and/or fractionation step
Tryptone	Difco
UHPLC-DAD	Dionex	Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath	UNIQUE	Model USC 2800
Yeast extract	Difco