超遠心分離による血漿リポタンパク質の単離と分析

要約

血漿リポタンパク質の分析にはいくつかの方法が使用されています。しかし、超遠心は依然として最も人気があり、信頼性の高い方法の1つです。ここでは、逐次密度超遠心を用いて血漿からリポタンパク質を分離する方法と、診断と研究の両方の目的でアポリポタンパク質を分析する方法について説明する。

要約

血漿リポタンパク質とアポリポタンパク質の分析は、脂質異常症の診断や脂質代謝とアテローム性動脈硬化症の研究に不可欠な部分です。血漿リポタンパク質を分析するためのいくつかの方法がありますが、超遠心分離は依然として最も人気があり、信頼性の高い方法の1つです。その無傷の分離手順のために、この方法によって単離されたリポタンパク質の画分は、リポタンパク質、アポリポタンパク質、プロテオーム、および培養細胞を有するリポタンパク質の機能研究に使用することができる。ここでは、VLDL(d<1.006 g/mL)、IDL(d=1.02 g/mL)、LL(d=1.04および1.06 g/mL)、HDL(d=1.08、1.10、および1.21 g/mL)を含む7つのリポタンパク質画分をシーケンシャルプラズマを使用してシーケンシャルプラズマから分離するための詳細なプロトコルを提供します。また、SDS-PAGEやウエスタンブロッティングによるアポアI、apoB、apoEなどのアポリポタンパク質を分析する方法を読者に紹介し、過脂性ウサギモデルを用いたリポタンパク質およびアポリポタンパク質プロファイルの代表的な結果を示します。この方法は、臨床医と基本的な科学者の両方がリポタンパク質機能を分析するための標準的なプロトコルになることができます。

概要

脂質異常症は、世界の動脈硬化性疾患の主要な危険因子です。高濃度の低密度リポタンパク質(LDL)および低濃度の高密度リポタンパク質(HDL)は、冠状動脈性心疾患(CHD)1,2の高リスクと密接に関連している。臨床現場では、LDLコレステロール(LDL-C)とHDL-コレステロール(HDL-C)の両方が臨床検査室^3,4の自動分析装置を用いて日常的に測定される。しかし、脂質異常症の診断やヒトおよび実験動物における脂質代謝とアテローム性動脈硬化症の研究については、リポタンパク質のプロファイルを詳細に分析することが不可欠です。超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー(高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、アガロースおよびポリアクリルアミドゲルによる電気泳動、核磁気共鳴、ポリアニオンおよび二価カチオンなどの選択的化学沈殿を分析する方法がいくつか報告されている。1950年代、Havelのグループは、最初に超遠心分離を使用して密度によって定義されるリポタンパク質の概念を提案し、それらをチロミクロン(CM)、非常に低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度リポタンパク質(IDL)、LDL、およびHDL⁵以降に分類し、この方法は他のグループ^6、7によってさらに改変された。これまで、超遠心分離は最も一般的で信頼性の高い方法ですが、実用的なプロトコルはまだ利用できません。本稿では^、先に説明した逐次密度の超遠心分離を用いて、微小なプラズマを単離するための使いやすいプロトコルを説明することを試みた。7つの血漿リポタンパク質画分の単離 [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LL (d=1.04 および 1.06 g/mL), HDL (d=1.08, 1.10、および1.21 g/mL))は、研究者がリポタンパク質とその組成アポリポタンパク質^9、10、11の両方の広範な分析を行うことを可能にする。無傷の7つの連続した密度リポタンパク質は、リポタンパク質機能を分析し、また細胞ベースのインビトロ戦略にも役立つことができます。このプロトコルは、臨床診断と基礎研究の両方に有用である必要があります。ここでは、他の種からのプラズマを同じように適用しながら、この技術を実証するために、例としてウサギのプラズマを使用しました。

プロトコル

ウサギ研究の全ての手続きは、山梨大学の制度的動物の世話・使用委員会(承認番号:A28-39)の承認を得て行われました。

1. ウサギの血からプラズマ分離

1. 0.5 M EDTA (pH 8.0) の 15 μL を含む 1.5 mL マイクロチューブを採血用に準備します。
2. ウサギを拘束剤に入れ、22ゲージの針を使って耳介中動脈を穿刺し、血液をチューブに集める。EDTAと血液を優しく混ぜ、氷の上に置きます。
3. 4°Cで20分間1,500xgの血液管を遠心分離し、新しいマイクロチューブに血漿を収集します。
   注:血液の3 mLは1 mL血漿を収集するのに十分です。マウスや他の小動物から血液を採取する場合は、それらをプールする必要があります。

2. 血漿リポタンパク質の単離

注: 図 1に、スケマティック手順を示します。臭化カリウム(KBr)密度溶液の調製方法を 表1に示す。

1. 1 mLのプラズマをポリカーボネート超遠心チューブに移す(図2A)。
2. これらのチューブを固定角度ローターにロードし、プラズマを4°Cで2.5時間356,000 x gで遠心分離します(図2B)。
   注: ベックマン TLA 120.2 ローターの場合、356,000 x g (平均相対遠心フィールド、Av RCF) は 100,000 rpm に相当します。
3. スライサーを使用してチューブを切り取り、上部の分画[VLDL(d<1.006 g/mL)]を収集し、約200 μLを新しいマイクロチューブにします(図2C)。残りの底分を次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに集める(図2D)。同じ密度溶液(d=1.006 g/mL)を加えて、体積を測定し、合計体積を800μLにします。
   メモ:チューブスライサーにブレードをセットします。上部の分数(200 μL)と下端分(800 μL)の間のレベルでブレードの位置を調整します。下部分数の粘性沈殿物は、以下のすべてのステップでピペッティングすることによって慎重かつ完全に収集する必要があります。一時停止する場合は、すべてのステップで上下の分数を分けた後に行います。次の遠心まで4°Cでサンプルを保存します。
4. d=1.21 g/mL溶液の58.9 μLとd=1.02 g/mL溶液の141.1 μLを加えて、底分(合計800 μL)をd=1.02 g/mLに調整します(総体積は1mL)。
5. これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を356,000 x g で4°Cで2.5時間ロードします。
6. スライサーを使用してチューブを切り、上端分画[IDL(d=1.02 g/mL)]を約200μLで新しいマイクロチューブに集めます。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。同じ密度溶液(d=1.02 g/mL)を加えることで、体積を測定し、合計体積を800μLにします。
7. d=1.21 g/mL溶液の94.1 μLとd=1.04 g/mL溶液の105.9 μLを加えて、底分(合計800 μL)をd=1.04 g/mLに調整します(総体積は1mL)。
8. これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を356,000 x g で4°Cで2.5時間ロードします。
9. スライサーを使用してチューブを切り、上端分画[LDL(d=1.04 g/mL)]を約200μLで新しいマイクロチューブに集めます。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。同じ密度溶液(d=1.04 g/mL)を加えて、体積を測定し、合計を800 μLにします。
10. d=1.21 g/mL溶液の106.7 μLとd=1.06 g/mL溶液の93.3 μLを加えて、底分(合計800 μL)をd=1.06 g/mLに調整します(総体積は1mL)。
11. これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を356,000 x g で4°Cで2.5時間ロードします。
12. スライサーを使用してチューブを切り、上端分画[LDL(d=1.06 g/mL)]を約200μLで新しいマイクロチューブに集めます。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。同じ密度溶液(d=1.06 g/mL)を加えて、体積を測定し、合計を800 μLにします。
13. d=1.21 g/mL溶液の123.1 μLとd=1.08 g/mL溶液の76.9 μLを加えて、底分(合計800 μL)をd=1.08 g/mLに調整します(総体積は1mL)。
14. これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を356,000 x g で4°Cで2.5時間ロードします。
15. スライサーを使用してチューブをカットし、上部の分画[HDL 2(d=1.08 g/mL)]を収集し、約200μLを新しいマイクロチューブにします。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。同じ密度溶液(d=1.08 g/mL)を加えて、体積を測定し、合計を800 μLにします。
16. d=1.21 g/mL溶液の145.5 μLとd=1.10 g/mL溶液の54.5 μLを加えて、底分(合計800 μL)をd=1.10 g/mLに調整します(総体積は1mL)。
17. これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を356,000 x g で4°Cで2.5時間ロードします。
18. スライサーを使用してチューブをカットし、上部の分画[HDL 2(d=1.10 g/mL)]を約200μL新しいマイクロチューブに集めます。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。同じ密度溶液(d=1.10 g/mL)を加えて、体積を測定し、合計を800 μLにします。
19. 0.140 gの臭化カリウム(KBr)粉末を加えて、底分(合計800 μL)をd=1.21 g/mLに調整し、完全に溶解します。d=1.21 g/mL溶液を加えて、体積を測定して1mLにします。
20. これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を513,000 x g で4°Cで4時間ロードします。
    注: ベックマン TLA 120.2 ローターの場合、513,000 x g (Av RCF) は 120,000 rpm に相当します。
21. スライサーを使用してチューブをカットし、上部の分画[HDL 3(d=1.21 g/mL)]を約200μL新しいマイクロチューブに集めます。これは超遠心化のための最後のステップです。

3. 透析

注: 密度分率(d<1.006 g/mL 画分を除く)は高濃度の KBr を含んでいるため、透析によって除去する必要があります。

1. 密度分率を透析チューブに移し、両端をクロージャでクリップします。
2. 磁気攪拌機を用いた攪拌で4°Cで6時間のPBS/1 mM EDTAなどの透析バッファーの2 Lに対する透析。
3. 新しいバッファーと透析を4 °Cで別の 6 時間再び交換します。
4. 密度の分数を収集し、ボリュームを測定します。密度の分数をすべて同じボリューム(例えば、250 μL)に調整します。
   注:元のプラズマの1mLから濃縮係数を計算することができます(例えば、250 μLの密度分率は4倍の濃度に相当します)。

4. リポタンパク質の分析

注:透析後、これらのリポタンパク質は異なる分析の準備ができています。リポタンパク質は、脂質またはアポリポタンパク質、またはその両方を測定することによって評価することができる。総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)、リン脂質(PL)、および遊離コレステロール(FC)などの脂質内容物を各画分で測定するために、市販の酵素的着色アッセイキットを用います。アポリポタンパク質の分析には、CBB染色またはウェスタンブロッティングで可視化したSDS-PAGEを用います。

1. 脂質分析
   注:リポタンパク質画分中のTC、TG、PLおよびFCのような脂質は、市販の測定キットを使用して測定することができる。手順は使用する試薬によって異なりますので、使用する各キットの指示に従ってください。ここでは、市販の酵素アッセイキットを用いた典型的なマイクロプレートアッセイを示す。
   1. 96ウェルマイクロプレートにリポタンパク質サンプルと標準キャリブレーション物質を8μL塗布します。
   2. 240 μLのアッセイ試薬を加え、ピペットで混合します。
   3. 37°Cで10分間インキュベートします。
   4. マイクロプレートリーダーでODを測定し、脂質濃度を計算します。
2. アポリポ蛋白分析
   1. SDS-ページおよびCBB染色
      1. サンプル調製:2xサンプルバッファーの10 μLを10 μLのリポタンパク質画分に加えます。乾燥したヒートブロックを使用して、80°Cで5分間加熱します。
      2. 4-20%の勾配SDS-ポリアクリルアミドゲルを調製し、ランニングバッファで満たされた電気泳動チャンバにゲルをセットします。
      3. 積み重ねゲルにリポタンパク質サンプル(10 μL/lane)とタンパク質標準(5 μL/レーン)をロードします。
         注:サンプルが2倍の濃縮値の場合、1車線当たり20μLのプラズマに相当する量が解析されます。
      4. 電気泳動を20~40mAの定電流で実行します。
      5. CBB染色:ゲルを10分間穏やかな揺れで固定溶液に2回浸します。30分間CBB染色液でゲルを染色します。余分な汚れを除去するために蒸留水でゲルをすすい。ゲルは撮影の準備ができています。
   2. ウェスタンブロッティング
      1. 上記と同様の手順で電気泳動を行う。
         注意:ウエスタンブロッティング用にロードされるリポタンパク質の量は、上記のCBB染色(例えば1~5μL)に比べて少なくなります。
      2. 転写バッファー浸しろ紙とフォームパッドの間にゲルとPVDF膜を置きます。ホルダーカセットにサンドイッチを設置し、移動バッファで満たされたタンクに入れます。
      3. 4°Cで3時間、100mA定電流でエレクトロブロットを行います。
      4. ブロッキング: 膜を、室温で1時間、または4°Cで一晩ブロッキングバッファーにインキュベートします。
      5. 一次Ab反応:軽度の揺れで室温または4°Cで1時間または一晩ブロッキングバッファーで希釈した一次腹筋の膜をインキュベートします。
         注: 推奨される一次 Ab 希釈は 、材料表に示されています。アポリポタンパク質に対する3種類の一次腹筋は、1人でまたはカクテルに使用することができる。
      6. 膜を攪拌して洗浄バッファーで3回洗浄し、洗浄ごとに5分。
      7. 二次Ab反応:攪拌で室温で1時間ブロッキングバッファーで希釈した二次腹筋の膜をインキュベートします。
         注: 推奨されるセカンダリ Ab 希釈は 、材料表に示されています。
      8. 膜を攪拌して洗浄バッファーで3回洗浄し、洗浄ごとに5分。
      9. ECL検出:プラスチックラップに膜を置きます。ECL検出試薬を加え、1分間インキュベートします。余分な液体を排出し、袋に膜を密封します。
      10. 画像アナライザを使用して信号を視覚化します。

結果

このプロトコルを用いて、1mLの血漿を用いてウサギのリポタンパク質を単離し、7つの密度画分を得た。分離された密度画分は、ほとんどの研究目的で上記のように脂質およびアポリポタンパク質を測定するのに十分である。同じ手順は、ヒトおよび他の種から血漿リポタンパク質を単離するためにも使用することができる。マウスなどの小型動物の場合、プールされた血漿が必要です。

ディスカッション

高脂血症は、アテローム硬化性疾患の最も重要な危険因子の1つです。したがって、血漿リポタンパク質の解析は、脂質異常症患者の診断に不可欠であるだけでなく、リポタンパク質代謝およびアテローム性動脈硬化症の分子機構の研究にも重要である。本研究では、超遠心分離が可能な研究室で適用できる血漿リポタンパク質の単離および分析のプロトコルについて説明した。この方法で得...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22-gauge needle	Terumo	NN-2232S	For blood collection
96-well microplate	greiner bio-one	655101	For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody	LifeSpan BioSciences	LS-C314186	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody	ROCKLAND	600-101-111	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody	Merck Millipore	AB947	For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	299-50101	For apolipoprotein analysis
Centrifuge	HITACHI		himac CF15RN
Closure	Spectrum	132736	For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing	FUJIFILM Wako Pure Chemical	043-30921	For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block	Major Science	MD-01N	For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents	GE Healthcare	RPN2209	For Western blotting
Electrophoresis Chamber	BIO-RAD		Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	345-01865	For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper	ADVANTEC	590	For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor	BECKMAN COULTER	357656	TLA-120.2
Fixing solution			For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane	BIO-RAD	1620177	For Western blotting
Lumino image analyzer	GE Healthcare		For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer	ADVANTEC	SR-304	For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK	BIO-RAD		For lipids measurment
Microtube	INA-OPTIKA	SC-0150
Orbital agitator USBDbo	Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	705-035-003	For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	433-36201	For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes	BECKMAN COULTER	343778
Potassium Bromide	FUJIFILM Wako Pure Chemical	168-03475	For density solution
Power Supply	BIO-RAD		For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra	BIO-RAD	161-0377	For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer	Natsume Seisakusho	KN-318	For blood collection
Rotor	HITACHI		T15A43
SDS-PAGE running buffer			25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)			0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel			4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder	FUJIFILM Wako Pure Chemical	190-12865	For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	439-17501	For lipids measurment
Triglyicerides assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	432-40201	For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube	BECKMAN COULTER	347960	For lipoprotein isolation
Tween 20	SIGMA-ALDRICH	P1379	For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A95761	Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system	BIO-RAD		Mini Trans-Blot Cell