Plazma Lipoproteinlerinin Ultracentrifugation ile İzolasyonu ve Analizi

Özet

Plazma lipoproteinlerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılmıştır; ancak, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Burada, sıralı yoğunluklu ultrasantrifüjasyon kullanarak lipoproteinlerin plazmadan nasıl izole edilmesi ve apolipoproteinlerin hem tanı hem de araştırma amacıyla nasıl analiz edilmesi ile ilgili bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Plazma lipoproteinlerinin ve apolipoproteinlerin analizi dislipidemi tanısı ve lipid metabolizması ve ateroskleroz çalışmaları için önemli bir parçadır. Plazma lipoproteinlerini analiz etmek için çeşitli yöntemler olmasına rağmen, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Bozulmamış ayırma prosedürü nedeniyle, bu yöntemle izole edilen lipoprotein fraksiyonları, lipoproteinlerin, apolipoproteinlerin, proteomların analizi ve kültürlü hücreler in vitro ile lipoproteinlerin fonksiyonel çalışması için kullanılabilir. Burada, VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL'ler (d=1.04 ve 1.06 g/mL), HDL'ler (d=1.08, 1.10 ve 1.21 g/mL) sıralı yüzer ultrasantrifüj kullanarak tavşan plazmasından. Buna ek olarak, okuyuculara SDS-PAGE ve Western blotting tarafından apoA-I, apoB ve apoE gibi apolipoproteinlerin nasıl analiz edeceğimizi tanıtıyoruz ve hiperlipidemik tavşan modellerini kullanarak lipoprotein ve apolipoprotein profillerinin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Bu yöntem hem klinisyenler hem de temel bilim adamları için lipoprotein fonksiyonlarını analiz etmek için standart bir protokol haline gelebilir.

Giriş

Dislipidemi dünyada aterosklerotik hastalığın başlıca risk faktörüdür. Yüksek düzeyde düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL'ler) ve düşük yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL' ler) yüksek koroner kalp hastalığı riski (CHD)^1,2ile yakından ilişkilidir. Klinik ortamda, hem LDL-kolesterol (LDL-C) hem de HDL-kolesterol (HDL-C) rutin olarak bir klinik laboratuvarda otomatik bir analizör kullanılarak ölçülür^3,4. Buna rağmen, dislipidemi tanısı ve insan ve deney hayvanlarında lipid metabolizması ve ateroskleroz çalışması için lipoprotein profillerini ayrıntılı olarak analiz etmek önemlidir. Ultrasantrifüjasyon, boyut dışlama kromatografisi [hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)], agarose ve poliakrilamid jeller tarafından elektroforez, nükleer manyetik rezonans ve seçici kimyasal çökeltme gibi plazma lipoproteinlerini polianyonlar ve divalent katyonlar veya diğer kimyasallar kullanılarak analiz etmek için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. 1950'lerde Havel'in grubu ilk olarak ultrasantrifüjleme kullanan yoğunluklar tarafından tanımlanan lipoprotein kavramını önerdi ve bunları chylomicrons (CM), çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL), orta yoğunluklu lipoproteinler (IDL), LDL ve HDL⁵ ve daha sonra diğer gruplar tarafından daha da değiştirildi^6,7. Şimdiye kadar, ultrasantrifüjleme en popüler ve güvenilir yöntemdir, ancak pratik protokol hala mevcut değildir. Bu yazıda, başlangıçta daha önce açıklanan sıralı yoğunluklu yüzer ultrasantrifüjasyon kullanarak küçük bir plazma ölçeğini izole etmek için kullanımı kolay bir protokol tanımlamaya çalıştık⁸. Yedi plazma lipoprotein fraksiyonunun izolasyonu [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL'ler (d=1.04 ve 1.06 g/mL), HDL'ler (d=1.08, 1.10 ve 1.21 g/mL)] araştırmacıların hem lipoproteinlerin hem de^bunlarınbileşimsel apolipoproteinleri 9 , 10^,11'inkapsamlı bir analizini yapmasını sağlar. Sağlam yedi ardışık yoğunluklu lipoprotein, lipoprotein fonksiyonlarını analiz etmek ve ayrıca hücre bazlı in vitro stratejilere hizmet etmek için kullanılabilir. Bu protokol hem klinik tanı hem de temel araştırmalar için yararlı olmalıdır. Burada tavşan plazmasını örnek olarak diğer türlerden alınan plazma aynı şekilde uygulanabilirken bu tekniği göstermek için kullandık.

Protokol

Tavşan çalışmaları için tüm prosedürler Yamanashi Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirildi (Onaylı sayı: A28-39).

1. Tavşan kanından plazma ayrımı

1. Kan almak için 15 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) içeren 1,5 mL mikrotüpler hazırlayın.
2. Bir tavşanı bir kısıtlayıcıya koyun ve 22 kalibrelik bir iğne kullanarak bir asuriküler ara arteri delin ve bir tüpe kan toplayın. Kanı EDTA ile hafifçe karıştırın ve buza koyun.
3. Kan tüplerini 4 °C'de 20 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüj edin ve plazmayı yeni bir mikrotüpe toplayın.
   NOT: 1 mL plazma toplamak için 3 mL kan yeterlidir. Farelerden veya diğer küçük hayvanlardan kan toplarsanız, onları bir arada toplamanız gerekir.

2. Plazma lipoproteinlerinin izolasyonu

NOT: Şematik yordam Şekil 1'de gösterilmiştir. Potasyum bromür (KBr) yoğunluk çözeltilerinin hazırlama yöntemi Tablo 1'de gösterilmiştir.

1. 1 mL plazmayı polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne aktarın(Şekil 2A).
2. Bu tüpleri sabit açılı bir rotora yükleyin ve plazmayı 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da santrifüj edin (Şekil 2B).
   NOT: Beckman TLA 120.2 rotor için 356.000 x g (ortalama göreli santrifüj alanı, Av RCF) 100.000 rpm'ye karşılık gelir.
3. Tüpleri bir dilimleyici kullanarak kesin ve üst fraksiyonu [VLDL (d<1.006 g/mL)], yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın (Şekil 2C). Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın (Şekil 2D). Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1.006 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplam hacmi 800 μL'ye getirin.
   NOT: Tüp dilimleyiciye bir bıçak ayarlayın. Bıçağın konumunu üst fraksiyon (200 μL) ile alt fraksiyon (800 μL) arasında bir seviyede ayarlayın. Alt fraksiyondaki viskoz çökelti, aşağıdaki tüm adımlarda pipetleme yapılarak dikkatlice ve tamamen toplanmalıdır. Duraklatıyorsanız, tüm adımlarda üst ve alt kesirleri ayırdıktan sonra bunu yapın. Numuneyi bir sonraki santrifüje kadar 4°C'de saklayın.
4. 58,9 μL d=1,21 g/mL çözelti ve 141,1 μL d=1,02 g/mL çözelti (toplam hacim 1 mL)'yi ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,02 g/mL'ye ayarlayın.
5. Bu tüpleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
6. Bir dilimleyici kullanarak tüpleri kesin ve ardından üst fraksiyonu [IDL (d=1.02 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın. Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1,02 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplam hacmi 800 μL'ye getirin.
7. 94,1 μL d=1,21 g/mL çözeltisi ve 105,9 μL d=1,04 g/mL çözeltisi ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,04 g/mL'ye ayarlayın (toplam hacim 1 mL'dir).
8. Bu tüpleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
9. Bir dilimleyici kullanarak tüpleri kesin ve ardından üst fraksiyonu [LDL (d=1.04 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın. Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1,04 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplamı 800 μL'ye getirin.
10. 106,7 μL d=1,21 g/mL çözelti ve 93,3 μL d=1,06 g/mL çözelti (toplam hacim 1 mL)'yi ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,06 g/mL'ye ayarlayın.
11. Bu tüpleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
12. Bir dilimleyici kullanarak tüpleri kesin ve ardından üst fraksiyonu [LDL (d=1.06 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın. Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1,06 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplamı 800 μL'ye getirin.
13. 123,1 μL d=1,21 g/mL çözeltisi ve 76,9 μL d=1,08 g/mL çözelti (toplam hacim 1 mL'dir) ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,08 g/mL'ye ayarlayın.
14. Bu tüpleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
15. Bir dilimleyici kullanarak tüpleri kesin ve ardından üst fraksiyonu [HDL₂ (d=1.08 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın. Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1,08 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplamı 800 μL'ye getirin.
16. 145,5 μL d=1,21 g/mL çözelti ve 54,5 μL d=1,10 g/mL çözelti (toplam hacim 1 mL'dir) ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,10 g/mL'ye ayarlayın.
17. Bu tüpleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
18. Tüpleri bir dilimleyici kullanarak kesin ve ardından üst fraksiyonu [HDL₂ (d=1.10 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın. Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1,10 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplamı 800 μL'ye getirin.
19. 0,140 g potasyum bromür (KBr) tozu ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,21 g/mL'ye ayarlayın ve tamamen çözün. D=1,21 g/mL çözeltisi ekleyerek hacmi ölçün ve 1 mL'ye getirin.
20. Bu tüpleri 4 °C'de 4 saat boyunca 513.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
    NOT: Beckman TLA 120.2 rotor için 513.000 x g (Av RCF) 120.000 rpm'ye karşılık gelir.
21. Tüpleri bir dilimleyici kullanarak kesin ve ardından üst fraksiyonu [HDL₃ (d=1.21 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Bu ultrasantrifüjleme için son adımdır.

3. Diyaliz

NOT: Yoğunluk fraksiyonları (d<1.006 g/mL fraksiyonu hariç) yüksek konsantrasyonlarda KBr içerdiğinden, bunları diyalizle çıkarmak gerekir.

1. Yoğunluk fraksiyonlarını diyaliz tüpüne aktarın ve her iki ucu da kapaklarla kırpın.
2. Manyetik karıştırıcı kullanarak ajitasyon ile 4 °C'de 6 saat boyunca PBS/ 1 mM EDTA gibi 2 L diyaliz tampona karşı dialyze.
3. Yeni tamponla değiştirin ve 4 °C'de 6 saat daha dialyze edin.
4. Yoğunluk kesirlerini toplayın ve hacmi ölçün. Tüm yoğunluk fraksiyonlarını aynı hacme ayarlayın (örneğin, 250 μL).
   NOT: Konsantre faktörü 1 mL orijinal plazmadan hesaplayabilirsiniz (örneğin, 250 μL yoğunluk fraksiyonu dört kat konsantrasyona karşılık gelir).

4. Lipoproteinlerin analizi

NOT: Diyalizden sonra bu lipoproteinler farklı analizlere hazırdır. Lipoproteinler lipitler veya apolipoproteinler veya her ikisi de ölçülerek değerlendirilebilir. Her kesirde toplam kolesterol (TC), trigliseritler (TG), fosfolipidler (PL) ve serbest kolesterol (FC) gibi lipit içeriklerini ölçmek için ticari enzymatic kolorimetrik test kitleri kullanıyoruz. Apolipoproteinlerin analizi için, CBB boyama veya Batı şişkinliği ile görselleştirilmiş SDS-PAGE kullanıyoruz.

1. Lipid analizi
   NOT: Lipoprotein fraksiyonunda TC, TG, PL ve FC gibi lipitler ticari olarak mevcut ölçüm kitleri kullanılarak ölçülebilir. Prosedürler kullanılan reaktiflere bağlıdır, bu nedenle kullanılan her kitin talimatlarını izleyin. Burada ticari bir enzymatic tahlil kiti kullanarak tipik bir mikro plaka tahlilini gösteriyoruz.
   1. 96 kuyulu mikro plakaya 8 μL lipoprotein numunesi ve standart kalibrasyon maddesi uygulayın.
   2. 240 μL tahlil reaktifi ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
   3. 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
   4. OD'yi bir mikro plaka okuyucu ile ölçün ve lipit konsantrasyonlarını hesaplayın.
2. Apolipoprotein analizi
   1. SDS-PAGE ve CBB boyama
      1. Numune hazırlama: 10 μL lipoprotein fraksiyonu için 10 μL 2x Numune tamponu ekleyin. Karışımı kuru bir ısı bloğu kullanarak 5 dakika boyunca 80 °C'de ısıtın.
      2. % 4-20 gradyan SDS-poliakrilamid jel hazırlayın ve jeli çalışan tamponla dolu elektroforezi odasına kurun.
      3. İstifleme jelinin üzerine lipoprotein numunesi (10 μL/şerit) ve protein standartları (5 μL/şerit) yükleyin.
         NOT: Numuneler iki kez konsantre edilirse, şerit başına eşdeğer miktarda 20 μL plazma analiz edilecektir.]
      4. Elektroforezi 20-40 mA sabit akımda çalıştırın.
      5. CBB boyama: Jeli 10 dakika boyunca hafif sallama ile sabitleme çözeltisinde iki kez ıslatın. Jeli 30 dakika boyunca CBB boyama çözeltisi ile lekelenin. Fazla lekeyi gidermek için jeli damıtılmış suda durulayın. Jel fotoğraf için hazır.
   2. Batı şişkinliği
      1. Elektroforezi yukarıda açıklandığı gibi aynı prosedürde gerçekleştirin.
         NOT: Batı şişkinliği için yüklenen lipoproteinlerin hacmi yukarıda açıklanan CBB lekelemesinden daha azdır (örneğin 1-5 μL).
      2. Jel ve PVDF membranını transfer tamponu ile ıslatılmış filtre kağıdı ve form pedi arasına yerleştirin. Sandviçi bir tutucu kasete yerleştirin ve transfer tamponu ile dolu bir tanka yerleştirin.
      3. 4 °C'de 3 saat boyunca 100 mA sabit akımda elektroblotting gerçekleştirin.
      4. Engelleme: Membranı oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de blokaj tamponunda kuluçkaya yatırın.
      5. Birincil Ab reaksiyonu: Oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de hafif sallama ile gece boyunca bloke tamponu ile seyreltilmiş birincil Abs'deki membranları kuluçkaya bırakın.
         NOT: Önerilen birincil Ab seyreltme Malzeme Tablosundagösterilmiştir. Apolipoproteinlere karşı üç çeşit birincil Abs tek tek veya kokteyllerde kullanılabilir.
      6. Membranı yıkama tamponunda ajitasyonla üç kez yıkayın, yıkama başına 5 dk.
      7. İkincil Ab reaksiyonu: İkincil Abs'deki membranı ajitasyon ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke tamponu ile seyreltin.
         NOT: Önerilen ikincil Ab seyreltme Malzeme Tablosundagösterilmiştir.
      8. Membranı yıkama tamponunda ajitasyonla üç kez yıkayın, yıkama başına 5 dk.
      9. ECL algılama: Zarı plastik bir sargı üzerine yerleştirin. ECL algılama reaktifleri ekleyin ve 1 dakika kuluçkaya yaslanın. Fazla sıvıyı boşaltın ve zarı bir torbaya kapatın.
      10. Görüntü çözümleyici kullanarak sinyalleri görselleştirin.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, 1 mL plazma kullanarak tavşan lipoproteinlerini izole ettik ve yedi yoğunluk fraksiyonu elde ettik. İzole yoğunluk fraksiyonları, çoğu araştırma amacıyla yukarıda açıklandığı gibi lipitleri ve apolipoproteinleri ölçmek için yeterlidir. Aynı prosedür, plazma lipoproteinlerini insan ve diğer türlerden izole etmek için de kullanılabilir. Fareler gibi küçük boyutlu hayvanlar için havuzlanmış plazma gereklidir. Şekil 3, normal standart (NS...

Tartışmalar

Hiperlipidemi aterosklerotik hastalığın en önemli risk faktörlerinden biridir. Bu nedenle, plazma lipoproteinlerinin analizi sadece dislipidemi hastalarının tanısı için değil, aynı zamanda lipoprotein metabolizması ve aterosklerozun moleküler mekanizmalarının araştırılması için de önemlidir. Bu çalışmada ultrasantrifüjasyonun mevcut olduğu laboratuvarlarda uygulanabilen plazma lipoproteinlerinin izolasyon ve analiz protokolünü anlattık. Bu yöntemle elde edilen bilgiler kapsamlı ve basittir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
22-gauge needle	Terumo	NN-2232S	For blood collection
96-well microplate	greiner bio-one	655101	For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody	LifeSpan BioSciences	LS-C314186	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody	ROCKLAND	600-101-111	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody	Merck Millipore	AB947	For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	299-50101	For apolipoprotein analysis
Centrifuge	HITACHI		himac CF15RN
Closure	Spectrum	132736	For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing	FUJIFILM Wako Pure Chemical	043-30921	For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block	Major Science	MD-01N	For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents	GE Healthcare	RPN2209	For Western blotting
Electrophoresis Chamber	BIO-RAD		Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	345-01865	For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper	ADVANTEC	590	For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor	BECKMAN COULTER	357656	TLA-120.2
Fixing solution			For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane	BIO-RAD	1620177	For Western blotting
Lumino image analyzer	GE Healthcare		For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer	ADVANTEC	SR-304	For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK	BIO-RAD		For lipids measurment
Microtube	INA-OPTIKA	SC-0150
Orbital agitator USBDbo	Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	705-035-003	For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	433-36201	For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes	BECKMAN COULTER	343778
Potassium Bromide	FUJIFILM Wako Pure Chemical	168-03475	For density solution
Power Supply	BIO-RAD		For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra	BIO-RAD	161-0377	For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer	Natsume Seisakusho	KN-318	For blood collection
Rotor	HITACHI		T15A43
SDS-PAGE running buffer			25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)			0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel			4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder	FUJIFILM Wako Pure Chemical	190-12865	For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	439-17501	For lipids measurment
Triglyicerides assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	432-40201	For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube	BECKMAN COULTER	347960	For lipoprotein isolation
Tween 20	SIGMA-ALDRICH	P1379	For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A95761	Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system	BIO-RAD		Mini Trans-Blot Cell