극심분리에 의한 혈장 지단백질의 격리 및 분석

요약

혈장 지단백질을 분석하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었습니다. 그러나, 초원심 분리는 여전히 가장 인기 있고 신뢰할 수있는 방법 중 하나입니다. 여기서는 순차밀도 극심분리를 이용하여 플라즈마로부터 지단백질을 분리하는 방법과 진단 및 연구 목적으로 아폴리포단백질을 분석하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

초록

플라즈마 지단백질과 아폴리포단백질의 분석은 지질 대사와 죽상 동맥 경화증의 이상지질혈증 진단 및 연구 결과를 위한 필수적인 부분입니다. 플라즈마 지단백질을 분석하기 위한 몇 가지 방법이 있지만, 초원심 분리는 여전히 가장 인기 있고 신뢰할 수 있는 방법 중 하나입니다. 그것의 그대로 분리 절차 때문에, 이 방법에 의해 고립된 지단백질 분획은 지단백질, apolipoproteins, proteomes 및 시험관내 배양된 세포를 가진 지단백질의 기능적인 연구 결과에 이용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 VLDL (d&1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL (d=1.04 및 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, 및 1.21 g/mL)를 포함하는 7개의 지단백질 분획을 격리하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 또한, SDS-PAGE 및 서양 블로팅에 의해 아포아-I, apoB 및 apoE와 같은 아포포단백질을 분석하고 고지립 토끼 모델을 사용하여 지단백질 및 아폴리포단백질 프로파일의 대표적인 결과를 보여주는 방법을 독자에게 소개합니다. 이 방법은 임상의와 기초 과학자 모두에게 지단백질 기능을 분석하는 표준 프로토콜이 될 수 있습니다.

서문

이상지질혈증은 세계에서 죽상 경화성 질환의 주요 위험 요소입니다. 저밀도 지단백(LdL) 및 저농도 고밀도 지단백(HDL)의 높은 수준은 관상 동맥 심장질환(CHD)^1,2의고위험과 밀접한 관련이 있다. 임상 환경에서, LDL 콜레스테롤(LDL-C)과 HDL-콜레스테롤(HDL-C)은 임상 실험실^3,4에서자동화된 분석기를 사용하여 일상적으로 측정된다. 그럼에도 불구 하 고, 이상 지질 혈 증의 진단 및 인간 및 실험 동물에 지질 대사와 동맥 경화증의 연구에 대 한 세부 사항에 지 단 단 프로파일을 분석 하는 것이 필수적이다. 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피[빠른 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)], 아가로즈 및 다극성 겔, 핵자기 공명, 선택적 화학적 흡기 등의 플라즈마 지단백질을 분석하는 몇 가지 방법이 보고되었다. 1950년대에 하벨 그룹은 먼저 초원심분리를 사용하여 밀도에 의해 정의된 지단백질개념을 제안하고 chylomicrons(CM), 매우 저밀도 지단백(VLDL), 중밀도 지단백질(IDL), LDL 및 HDL^5로 분류하여 다른^그룹,6개군에 의해 더 수정되었다. 지금까지, 초원심 분리는 실용적인 프로토콜을 아직 사용할 수없는 동안 가장 인기 있고 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 논문에서는 이전에 설명한 순차 밀도 부동 초원심분리기를 사용하여 소량의 플라즈마를 격리하기 위한 사용하기 쉬운 프로토콜을 설명하려고^{시도하였다.} 7개의 플라즈마 지단백질 분획 [VLDL(d&1.006 g/mL), IDL(d=1.02 g/mL), LDL(d=1.04 및 1.06 g/mL), HDL(d=1.08), HDL(d=1.08) 1.10, 및 1.21 g/mL)]을 통해 연구자들은 지단백질과 그들의 조성성 아폴리포단백질^{9,10,11모두에}대한 광범위한 분석을 할 수 있다. 그대로 7개의 연속밀도 지단백은 지단백질 기능을 분석하고 세포 기반 체외 전략에도 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 임상 진단과 기본 연구 모두에 유용해야합니다. 여기서 우리는 토끼 플라즈마를 다른 종의 플라즈마가 동일한 방식으로 적용 할 수있는 동안이 기술을 입증하는 예로 사용했습니다.

프로토콜

토끼 연구를위한 모든 절차는 야마나시 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인으로 수행되었다 (승인 번호: A28-39).

1. 토끼 혈액에서 플라즈마 분리

1. 혈액 수집을 위해 0.5 M EDTA (pH 8.0)의 15 μL을 포함하는 1.5 mL 마이크로튜브를 준비하십시오.
2. 토끼를 제지에 넣고 22 게이지 바늘을 사용하여 대동맥 중간 동맥에 구멍을 뚫고 튜브에 혈액을 수집합니다. EDTA와 혈액을 부드럽게 섞어 얼음위에 올려놓습니다.
3. 4°C에서 20분 동안 1,500 x g의 혈액 튜브를 원심분리하고 새로운 마이크로튜브로 플라즈마를 수집합니다.
   참고: 3mL의 혈액은 1mL 플라즈마를 수집하기에 충분합니다. 쥐 나 다른 작은 동물에서 혈액을 수집하는 경우, 당신은 그들을 풀링해야합니다.

2. 혈장 지단백질의 분리

참고: 회로도 절차는 그림 1에표시됩니다. 칼륨 브로마이드(KBr) 밀도 용액의 제조 방법은 표 1에도시된다.

1. 폴리카보네이트 초원심분리기튜브(도 2A)로플라즈마 1mL을 전송한다.
2. 이러한 튜브를 고정 각도 로터에 적재하고 플라즈마를 356,000 x g에서 4°C(도2B)에2.5h로 로드합니다.
   참고: Beckman TLA 120.2 로터의 경우 356,000 x g(평균 상대 원심 필드, Av RCF)는 100,000 rpm에 해당합니다.
3. 슬라이서를 사용하여 튜브를 잘라낸 다음 상단 분획 [VLDL(d&1.006 g/mL)]을 수집하고, 약 200μL을 새로운 마이크로튜브(그림2C)로수집한다. 다음 분리를 위해 새로운 폴리카보네이트 극심분리기 튜브로 남은 바닥 분획을 수집한다(도2D). 동일한 밀도 솔루션(d=1.006 g/mL)을 추가하여 부피를 측정하고 총 부피를 800 μL로 만듭니다.
   참고: 튜브 슬라이서에 블레이드를 설정합니다. 블레이드의 위치를 상단 분획(200 μL)과 하부 분수(800 μL) 사이의 수준에서 조정합니다. 아래쪽 분획의 점성 침전제는 다음 의 모든 단계에서 파이펫팅하여 신중하고 완전히 수집되어야 합니다. 일시 중지하는 경우 모든 단계에서 위쪽과 아래쪽 분수를 분리한 후 이렇게 합니다. 다음 원심분리까지 샘플을 4°C로 저장합니다.
4. d=1.21 g/mL 용액의 58.9 μL과 d=1.02 g/mL 용액의 141.1 μL(총 부피는 1mL)을 추가하여 바닥 분수(총 800 μL)를 d=1.02 g/mL로 조정합니다.
5. 고정 각도 로터및 원심분리기에서 이 튜브를 4°C에서 2.5h의 356,000 x g로 적재합니다.
6. 슬라이서를 사용하여 튜브를 잘라낸 다음 상단 분획 [IDL(d=1.02 g/mL]] 약 200 μL을 새로운 마이크로튜브로 수집합니다. 다음 분리를 위해 나머지 바닥 분획을 새로운 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브로 수집합니다. 동일한 밀도 솔루션(d=1.02 g/mL)을 추가하여 부피를 측정하고 총 부피를 800 μL로 만듭니다.
7. d=1.21 g/mL 용액의 94.1 μL과 d=1.04 g/mL 용액의 105.9 μL(총 부피는 1mL)을 추가하여 바닥 분수(총 800 μL)를 d=1.04 g/mL로 조정합니다.
8. 고정 각도 로터 및 원심분리기에서 4°C에서 2.5h의 356,000 x g로 이 튜브를 적재합니다.
9. 슬라이서를 사용하여 튜브를 잘라낸 다음 상단 분획 [LDL(d=1.04 g/mL)] 약 200 μL을 새로운 마이크로튜브로 수집합니다. 다음 분리를 위해 나머지 바닥 분획을 새로운 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브로 수집합니다. 동일한 밀도 용액(d=1.04 g/mL)을 추가하여 부피를 측정하고 총 800 μL로 만듭니다.
10. d=1.21 g/mL 용액의 106.7 μL과 d=1.06 g/mL 용액의 93.3 μL(총 부피는 1mL)을 추가하여 바닥 분수(총 800 μL)를 d=1.06 g/mL로 조정합니다.
11. 고정 각도 로터 및 원심분리기에서 4°C에서 2.5h의 356,000 x g로 이 튜브를 적재합니다.
12. 슬라이서를 사용하여 튜브를 잘라낸 다음 상단 분획 [LDL(d=1.06 g/mL)] 약 200 μL을 새로운 마이크로튜브로 수집합니다. 다음 분리를 위해 나머지 바닥 분획을 새로운 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브로 수집합니다. 동일한 밀도 용액(d=1.06 g/mL)을 추가하여 부피를 측정하고 총 800 μL로 만듭니다.
13. d=1.21 g/mL 용액의 123.1 μL과 d=1.08 g/mL 용액의 76.9 μL(총 부피는 1mL)을 추가하여 바닥 분수(총 800 μL)를 d=1.08 g/mL로 조정합니다.
14. 고정 각도 로터 및 원심분리기에서 4°C에서 2.5h의 356,000 x g로 이 튜브를 적재합니다.
15. 슬라이서를 사용하여 튜브를 잘라낸 다음 상단 분획 [HDL₂ (d = 1.08 g /mL)] 약 200 μL을 새로운 마이크로 튜브로 수집합니다. 다음 분리를 위해 나머지 바닥 분획을 새로운 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브로 수집합니다. 동일한 밀도 용액(d=1.08 g/mL)을 추가하여 부피를 측정하고 총 800 μL로 만듭니다.
16. d=1.21 g/mL 용액의 145.5 μL과 d=1.10 g/mL 용액의 54.5 μL(총 부피는 1mL)을 추가하여 바닥 분수(총 800 μL)를 d=1.10 g/mL로 조정합니다.
17. 고정 각도 로터 및 원심분리기에서 4°C에서 2.5h의 356,000 x g로 이 튜브를 적재합니다.
18. 슬라이서를 사용하여 튜브를 잘라낸 다음 상단 분획 [HDL₂ (d = 1.10 g /mL)] 약 200 μL을 새로운 마이크로 튜브로 수집합니다. 다음 분리를 위해 나머지 바닥 분획을 새로운 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브로 수집합니다. 동일한 밀도 용액(d=1.10 g/mL)을 추가하여 부피를 측정하고 총 800 μL로 만듭니다.
19. 0.140 g의 브로마이드(KBr) 분말을 추가하여 바닥 분수(총 800 μL)를 d=1.21 g/mL로 조정하고 완전히 용해합니다. d=1.21 g/mL 솔루션을 추가하여 볼륨을 측정하고 1mL로 만듭니다.
20. 고정 각도 로터 및 원심분리기에서 4°C에서 4시간 동안 513,000 x g로 이 튜브를 적재합니다.
    참고: 베크만 TLA 120.2 로터의 경우 513,000 x g(Av RCF)는 120,000rpm에 해당합니다.
21. 슬라이서를 사용하여 튜브를 잘라낸 다음 상단 분획 [HDL₃ (d =1.21 g/mL)] 약 200 μL을 새로운 마이크로 튜브로 수집합니다. 이것은 초원심분리를 위한 마지막 단계입니다.

3. 투석

참고: 밀도 분획(d&1.006 g/mL 분획 제외)은 고농도의 KBr을 포함하기 때문에 투석으로 제거할 필요가 있습니다.

1. 밀도 분획을 투석 튜브로 옮기고 양쪽 끝을 닫기로 클립합니다.
2. 자기 교반기를 사용하여 동요와 4 °C에서 6 시간 PBS / 1 mM EDTA와 같은 투석 버퍼 2 L에 대해 투석합니다.
3. 새 버퍼로 교체하고 4°C에서 6h를 다시 투석합니다.
4. 밀도 분획을 수집하고 볼륨을 측정합니다. 모든 밀도 분획을 동일한 부피(예: 250 μL)로 조정합니다.
   참고: 원래 플라즈마의 1mL에서 농축 된 계수를 계산할 수 있습니다 (예를 들어, 밀도 분획의 250 μL은 4 배 농도에 해당).

4. 지단백질 분석

참고: 투석 후, 이러한 지단백질은 다른 분석을 위한 준비가 되어 있습니다. 지단백질은 지질이나 아폴리포단백질 또는 둘 다를 측정하여 평가될 수 있다. 총 콜레스테롤(TC), 트리글리세라이드(TG), 인지질(PL), 무료 콜레스테롤(FC)과 같은 지질 함량을 측정하기 위해, 상업용 효소 색도 분석 키트를 사용합니다. 아폴리포프로틴의 분석을 위해 CBB 염색 또는 서양 얼룩으로 시각화된 SDS-PAGE를 사용합니다.

1. 지질 분석
   참고: 지단백질 분획에서 TC, TG, PL 및 FC와 같은 지질은 시판되는 측정 키트를 사용하여 측정할 수 있습니다. 절차는 사용되는 시약에 따라 달라지므로 사용된 각 키트의 지침을 따르십시오. 여기서 우리는 상업적 인 효소 분석 키트를 사용하여 전형적인 마이크로 플레이트 분석체를 보여줍니다.
   1. 96웰 마이크로 플레이트에 지단백질 샘플 과 표준 교정 물질 8 μL을 적용합니다.
   2. 분석 시약 240 μL을 추가하고 파이펫팅하여 혼합합니다.
   3. 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
   4. 마이크로 플레이트 판독기로 OD를 측정하고 지질 농도를 계산합니다.
2. 아폴리포프로틴 분석
   1. SDS 페이지 및 CBB 스테인링
      1. 샘플 준비: 지단백질 분획의 10 μL에 2x 샘플 버퍼의 10 μL을 추가합니다. 혼합물을 건조한 열 블록을 사용하여 5 분 동안 80 °C에서 가열합니다.
      2. 4-20% 그라데이션 SDS-폴리아크라이알라미드 젤을 준비하고 달리는 버퍼로 채워진 전기 전광챔버에 젤을 설치합니다.
      3. 스태킹 젤에 지단백질 샘플(10 μL/차선) 및 단백질 표준(5 μL/차선)을 적재합니다.
         참고: 샘플이 두 배 집중되어 있는 경우 차선당 20μL 플라즈마를 분석합니다.]
      4. 20~40mA상전류에서 전기전도를 실행한다.
      5. CBB 염색: 젤을 두 번 담그고 부드러운 흔들림으로 10분 동안 고정용 액트에 담가 둡니다. 30 분 동안 CBB 염색 용액으로 젤을 염색하십시오. 여분의 얼룩을 제거하기 위해 증류수에 젤을 헹구는 다. 젤은 촬영할 준비가 되어 있습니다.
   2. 웨스턴 블로팅
      1. 전술한 바와 동일한 절차로 전기전도를 수행한다.
         참고: 서쪽 얼룩에 로드된 지단백질의 부피는 위에서 설명한 CBB 염색(예: 1-5 μL)보다 적습니다.
      2. 전달 버퍼에 젖은 필터 용지와 폼 패드 사이에 젤과 PVDF 멤브레인을 배치합니다. 홀더 카세트에 샌드위치를 설정하고 전송 버퍼로 채워진 탱크에 배치합니다.
      3. 4°C에서 3시간 동안 100mA상전류에서 전기로팅을 수행한다.
      4. 차단: 실온에서 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 버퍼를 차단하는 멤브레인을 배양합니다.
      5. 1차 Ab 반응: 1차 복근의 멤브레인을 실온에서 1h 또는 온화한 흔들림으로 4°C에서 하룻밤 동안 블로킹 버퍼로 희석한다.
         참고: 제안된 기본 Ab 희석은 재료 표에표시됩니다. 아폴리포단백질에 대한 3가지 1차 복근은 노래하거나 칵테일로 사용할 수 있습니다.
      6. 세척당 5분, 조리액으로 세워짐 버퍼로 멤브레인을 세 번 씻습니다.
      7. 보조 Ab 반응: 동요와 실온에서 1 h에 대 한 차단 버퍼희석 보조 복근에서 멤브레인을 배양.
         참고: 제안된 보조 Ab 희석은 재료 표에표시됩니다.
      8. 세척당 5분, 조리액으로 세워짐 버퍼로 멤브레인을 세 번 씻습니다.
      9. ECL 감지: 멤브레인을 플라스틱 랩에 놓습니다. ECL 검출 시약을 추가하고 1분 동안 배양합니다. 여분의 액체를 배출하고 가방에 멤브레인을 밀봉.
      10. 이미지 분석기를 사용하여 신호를 시각화합니다.

결과

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 플라즈마의 1 mL를 사용하여 토끼 지단백질을 격리하고 일곱 밀도 분획을 얻었다. 고립 된 밀도 분획은 대부분의 연구 목적을 위해 위에서 설명한 것과 같이 지질과 아폴리포단백질을 측정하기에 충분합니다. 동일한 절차는 또한 인간과 그밖 종에서 플라즈마 지단백질을 격리하기 위해 이용될 수 있습니다. 마우스와 같은 작은 크기의 동물의 경우 풀링 된 플라즈?...

토론

고지혈증은 동맥 경화성 질환의 가장 중요한 위험 요소 중 하나입니다. 따라서, 플라즈마 지단백질의 분석은 이상지질혈증 환자의 진단에 필수적일 뿐만 아니라 지단백질 대사와 죽상 동맥 경화증의 분자 기계장치의 조사에또한 중요합니다. 이 연구에서는 극심분리가 가능한 실험실에서 적용될 수 있는 혈장 지단백질의 격리 및 분석 프로토콜을 설명했습니다. 이 방법에 의해 얻은 정보는 포괄?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
22-gauge needle	Terumo	NN-2232S	For blood collection
96-well microplate	greiner bio-one	655101	For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody	LifeSpan BioSciences	LS-C314186	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody	ROCKLAND	600-101-111	For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody	Merck Millipore	AB947	For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	299-50101	For apolipoprotein analysis
Centrifuge	HITACHI		himac CF15RN
Closure	Spectrum	132736	For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing	FUJIFILM Wako Pure Chemical	043-30921	For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block	Major Science	MD-01N	For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents	GE Healthcare	RPN2209	For Western blotting
Electrophoresis Chamber	BIO-RAD		Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	345-01865	For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper	ADVANTEC	590	For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor	BECKMAN COULTER	357656	TLA-120.2
Fixing solution			For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane	BIO-RAD	1620177	For Western blotting
Lumino image analyzer	GE Healthcare		For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer	ADVANTEC	SR-304	For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK	BIO-RAD		For lipids measurment
Microtube	INA-OPTIKA	SC-0150
Orbital agitator USBDbo	Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	705-035-003	For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	433-36201	For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes	BECKMAN COULTER	343778
Potassium Bromide	FUJIFILM Wako Pure Chemical	168-03475	For density solution
Power Supply	BIO-RAD		For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra	BIO-RAD	161-0377	For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer	Natsume Seisakusho	KN-318	For blood collection
Rotor	HITACHI		T15A43
SDS-PAGE running buffer			25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)			0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel			4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder	FUJIFILM Wako Pure Chemical	190-12865	For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	439-17501	For lipids measurment
Triglyicerides assay kit	FUJIFILM Wako Pure Chemical	432-40201	For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube	BECKMAN COULTER	347960	For lipoprotein isolation
Tween 20	SIGMA-ALDRICH	P1379	For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	A95761	Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system	BIO-RAD		Mini Trans-Blot Cell