Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Mehrere Methoden wurden zur Analyse von Plasma-Lipoproteinen verwendet; Ultrazentrifugation ist jedoch nach wie vor eine der beliebtesten und zuverlässigsten Methoden. Hier beschreiben wir eine Methode, wie Lipoproteine aus Plasma mit sequenzieller Dichte-Ultrazentrifugation isoliert werden und wie die Apolipoproteine sowohl für diagnostische als auch für Forschungszwecke analysiert werden können.

Zusammenfassung

Die Analyse von Plasmalipoproteinen und Apolipoproteinen ist ein wesentlicher Bestandteil für die Diagnose von Dyslipidämie und Studien des Fettstoffwechsels und der Arteriosklerose. Obwohl es mehrere Methoden zur Analyse von Plasma-Lipoproteinen gibt, ist die Ultrazentrifugation immer noch eine der beliebtesten und zuverlässigsten Methoden. Aufgrund seines intakten Trennverfahrens können die mit dieser Methode isolierten Lipoproteinfraktionen zur Analyse von Lipoproteinen, Apolipoproteinen, Proteomen und funktionellen Untersuchungen von Lipoproteinen mit kultivierten Zellen in vitro verwendet werden. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von sieben Lipoproteinfraktionen, einschließlich VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 und 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1,10 und 1,21 g/ml) aus Kaninchenplasma unter Verwendung sequenzieller schwimmender Ultrazentrifugation. Darüber hinaus stellen wir den Lesern vor, wie man Apolipoproteine wie ApoA-I, ApoB und ApoE von SDS-PAGE und Western Blotting analysiert und repräsentative Ergebnisse von Lipoprotein- und Apolipoproteinprofilen mit hyperlipidemischen Kaninchenmodellen zeigt. Diese Methode kann ein Standardprotokoll für Ärzte und Grundlegende Wissenschaftler werden, um Lipoproteinfunktionen zu analysieren.

Einleitung

Dyslipidämie ist der Hauptrisikofaktor für atherosklerotische Erkrankungen in der Welt. Hohe Konzentrationen von Lipoproteinen mit geringer Dichte (LDLs) und niedrige Konzentrationen von Lipoproteinen mit hoher Dichte (HDLs) sind eng mit einem hohen Risiko für koronare Herzerkrankungen (CHD)1,2verbunden. Im klinischen Umfeld werden sowohl LDL-Cholesterin (LDL-C) als auch HDL-Cholesterin (HDL-C) routinemäßig mit einem automatisierten Analysator in einem klinischenLabor3,4gemessen. Trotzdem ist es wichtig, Lipoproteinprofile im Detail für die Diagnose von Dyslipidämie und die Untersuchung des Fettstoffwechsels und der Arteriosklerose bei menschlichen und experimentellen Tieren zu analysieren. Es wurden mehrere Methoden zur Analyse von Plasmalipoproteinen wie Ultrazentrifugation, Größenausschlusschromatographie [schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)], Elektrophorese durch Agarose und Polyacrylamidgele, Kernspinresonanz und selektive chemische Ausfällung mit Polyanionen und divalenten Kationen oder anderen Chemikalien beschrieben. In den 1950er Jahren schlug Havels Gruppe erstmals das Konzept der Lipoproteine vor, die durch Dichten mittels Ultrazentrifugation definiert wurden, und klassifizierte sie in Chylomicrons (CM), Lipoproteine mit sehr niedriger Dichte (VLDL), Lipoproteine mit mittlerer Dichte (IDL), LDL und HDL5 und später wurde die Methode von anderen Gruppen6,7weiter modifiziert. Bisher ist ultrazentrifugation die beliebteste und zuverlässigste Methode, während das praktische Protokoll noch nicht verfügbar ist. In diesem Artikel haben wir versucht, ein benutzerfreundliches Protokoll zur Isolierung eines kleinen Plasmamaßstabs mit sequenzieller Dichte schwebender Ultrazentrifugation zu beschreiben, die ursprünglichzuvor beschriebenwurde 8 . Isolierung von sieben Plasma-Lipoproteinfraktionen [VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 und 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1.10 und 1.21 g/mL)] ermöglicht es den Forschern, eine umfassende Analyse sowohl der Lipoproteine als auch ihrer kompositorischen Apolipoproteine9,10,11zu machen. Die intakten sieben aufeinanderfolgenden Dichte-Lipoproteine können zur Analyse von Lipoproteinfunktionen und auch zur Analyse zellbasierter In-vitro-Strategien verwendet werden. Dieses Protokoll sollte sowohl für die klinische Diagnose als auch für die Grundlagenforschung nützlich sein. Hier haben wir Kaninchenplasma als Beispiel verwendet, um diese Technik zu demonstrieren, während Plasma von anderen Arten auf die gleiche Weise angewendet werden kann.

Protokoll

Alle Verfahren für Kaninchenstudien wurden mit Genehmigung des Institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschusses der Universität Yamanashi (genehmigte Nummer: A28-39) durchgeführt.

1. Plasmatrennung von Kaninchenblut

  1. Bereiten Sie 1,5 ml Mikroröhrchen mit 15 l 0,5 M EDTA (pH 8,0) für die Blutentnahme vor.
  2. Legen Sie ein Kaninchen in einen Restrainer und punktieren Sie eine auriculare Zwischenschlagader mit einer 22-Spur-Nadel und sammeln Sie Blut in eine Röhre. Mischen Sie das Blut mit EDTA sanft und legen Sie es auf Eis.
  3. Zentrifugieren Sie die Blutröhrchen bei 1.500 x g für 20 min bei 4 °C und sammeln Sie Plasma in einem neuen Mikrorohr.
    HINWEIS: 3 ml Blut reichen aus, um 1 ml Plasma zu sammeln. Wenn Sie Blut von Mäusen oder anderen kleinen Tieren sammeln, müssen Sie sie bündeln.

2. Isolierung von Plasma-Lipoproteinen

HINWEIS: Die schematische Prozedur ist in Abbildung 1dargestellt. Die Zubereitungsmethode von Kaliumbromid (KBr) Dichtelösungen ist in Tabelle 1dargestellt.

  1. Übertragen Sie 1 ml Plasma in ein Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr (Abbildung 2A).
  2. Beladen Sie diese Rohre in einem festen Winkelrotor und zentrieren Sie das Plasma bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C(Abbildung 2B).
    HINWEIS: Für Beckman TLA 120.2 Rotor entspricht 356.000 x g (durchschnittliches relatives Zentrifugalfeld, Av RCF) 100.000 U/min.
  3. Schneiden Sie die Rohre mit einem Slicer und sammeln Sie dann den oberen Bruch [VLDL (d<1.006 g/ml)], ca. 200 'L in ein neues Mikrorohr (Abbildung 2C). Sammeln Sie den verbleibenden unteren Bruch in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung (Abbildung 2D). Messen Sie das Volumen und machen Sie das Gesamtvolumen auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,006 g/ml) hinzufügen.
    HINWEIS: Richten Sie eine Klinge auf den Rohrschneider ein. Passen Sie die Position der Klinge auf einer Ebene zwischen dem oberen Bruch (200 l) und dem unteren Bruch (800 l) an. Der viskose Niederschlag in der unteren Fraktion sollte sorgfältig und vollständig durch Pipettieren in allen folgenden Schritten gesammelt werden. Wenn Sie anhalten, tun Sie dies nach dem Trennen des oberen und unteren Bruchs in allen Schritten. Bewahren Sie die Probe bei 4°C bis zur nächsten Zentrifugation auf.
  4. Passen Sie den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,02 g/ml an, indem Sie 58,9 l d=1,21 g/ml Lösung und 141,1 l d=1,02 g/ml Lösung (das Gesamtvolumen beträgt 1 ml) hinzufügen.
  5. Beladen Sie diese Rohre in Festwinkelrotor und Zentrifuge bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C.
  6. Schneiden Sie die Rohre mit einem Schneideschneider und sammeln Sie dann den oberen Bruch [IDL (d=1,02 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung. Messen Sie das Volumen und machen Sie das Gesamtvolumen auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,02 g/ml) hinzufügen.
  7. Passen Sie den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,04 g/ml an, indem Sie 94,1 l d=1,21 g/ml Lösung und 105,9 l d=1,04 g/ml Lösung (das Gesamtvolumen beträgt 1 ml) hinzufügen.
  8. Beladen Sie diese Rohre in einem festwinkeligen Rotor und Zentrifuge bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C.
  9. Schneiden Sie die Rohre mit einem Schneideschneider und sammeln Sie dann den oberen Bruch [LDL (d=1,04 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung. Messen Sie das Volumen und machen Sie die Gesamtmenge auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,04 g/ml) hinzufügen.
  10. Passen Sie den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,06 g/ml an, indem Sie 106,7 l d=1,21 g/ml Lösung und 93,3 l d=1,06 g/ml Lösung (das Gesamtvolumen beträgt 1 ml) hinzufügen.
  11. Beladen Sie diese Rohre in einem festwinkeligen Rotor und Zentrifuge bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C.
  12. Schneiden Sie die Rohre mit einem Schneideschneider und sammeln Sie dann den oberen Bruch [LDL (d=1,06 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung. Messen Sie das Volumen und machen Sie die Gesamtmenge auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,06 g/ml) hinzufügen.
  13. Passen Sie den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,08 g/ml an, indem Sie 123,1 l d=1,21 g/ml Lösung und 76,9 l d=1,08 g/ml Lösung (das Gesamtvolumen beträgt 1 ml) hinzufügen.
  14. Beladen Sie diese Rohre in einem festwinkeligen Rotor und Zentrifuge bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C.
  15. Schneiden Sie die Rohre mit einem Slicer und sammeln Sie dann den oberen Bruch [HDL2 (d=1,08 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung. Messen Sie das Volumen und machen Sie die Gesamtmenge auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,08 g/ml) hinzufügen.
  16. Passen Sie den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,10 g/ml an, indem Sie 145,5 l d=1,21 g/ml Lösung und 54,5 l d=1,10 g/ml Lösung (das Gesamtvolumen beträgt 1 ml) hinzufügen.
  17. Beladen Sie diese Rohre in einem festwinkeligen Rotor und Zentrifuge bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C.
  18. Schneiden Sie die Rohre mit einem Slicer und sammeln Sie dann den oberen Bruch [HDL2 (d=1,10 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung. Messen Sie das Volumen und machen Sie die Gesamtmenge auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,10 g/ml) hinzufügen.
  19. Den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,21 g/ml einstellen, indem man 0,140 g Kaliumbromidpulver (KBr) hinzufügt, und vollständig auflösen. Messen Sie das Volumen und machen Sie sie auf 1 ml, indem Sie d=1,21 g/ml Lösung hinzufügen.
  20. Beladen Sie diese Rohre in Festwinkelrotor und Zentrifuge bei 513.000 x g für 4 h bei 4 °C.
    HINWEIS: Für Beckman TLA 120.2 Rotor entspricht 513.000 x g (Av RCF) 120.000 Umdrehungen von 120.000 Umdrehungen/ Min.
  21. Schneiden Sie die Rohre mit einem Slicer und sammeln Sie dann den oberen Bruch [HDL3 (d=1,21 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Dies ist der letzte Schritt für die Ultrazentrifugation.

3. Dialyse

HINWEIS: Da die Dichtefraktionen (außer d<1.006 g/ml) hohe KBr-Konzentrationen enthalten, ist es notwendig, sie durch Dialyse zu entfernen.

  1. Übertragen Sie die Dichtefraktionen auf einen Dialyseschlauch und schneiden Sie beide Enden mit Verschlüssen ab.
  2. Dialyse gegen 2 L Dialysepuffer wie PBS/ 1 mM EDTA für 6 h bei 4 °C mit Rührer mit Magnetrührer.
  3. Durch neuen Puffer ersetzen und bei 4 °C noch mal 6 h dialysieren.
  4. Sammeln Sie die Dichtefraktionen und messen Sie das Volumen. Passen Sie alle Dichtefraktionen auf das gleiche Volumen an (z. B. 250 l).
    HINWEIS: Sie können den konzentrierten Faktor aus 1 ml Originalplasma berechnen (z. B. entspricht 250 l Dichteanteil der vierfachen Konzentration).

4. Analyse von Lipoproteinen

HINWEIS: Nach der Dialyse sind diese Lipoproteine für verschiedene Analysen bereit. Lipoproteine können entweder durch Messung von Lipiden oder Apolipoproteinen oder beidem bewertet werden. Zur Messung von Lipidgehalten wie Gesamtcholesterin (TC), Triglyceriden (TG), Phospholipiden (PL) und freiem Cholesterin (FC) in jeder Fraktion verwenden wir kommerzielle enzymatische kolorekmetrische Assay-Kits. Für die Analyse von Apolipoproteinen verwenden wir SDS-PAGE visualisiert mit CBB-Färbung oder Western Blotting.

  1. Lipidanalyse
    HINWEIS: Lipide wie TC, TG, PL und FC in der Lipoproteinfraktion können mit handelsüblichen Messkits gemessen werden. Die Verfahren hängen von den verwendeten Reagenzien ab, also befolgen Sie die Anweisungen jedes verwendeten Kits. Hier zeigen wir einen typischen Mikroplatten-Assay mit einem kommerziellen enzymatischen Assay-Kit.
    1. Tragen Sie 8 L Lipoproteinprobe und Standardkalibrierungssubstanz auf 96-Well-Mikroplatte auf.
    2. Fügen Sie 240 L Assay-Reagenz hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren.
    3. Bei 37 °C für 10 min inkubieren.
    4. Messen Sie die OD mit einem Mikroplattenleser und berechnen Sie Lipidkonzentrationen.
  2. Apolipoprotein-Analyse
    1. SDS-PAGE und CBB Färbung
      1. Probenvorbereitung: Fügen Sie 10 l 2x Probenpuffer zu 10 l Lipoproteinfraktion hinzu. Erhitzen Sie das Gemisch bei 80 °C für 5 min mit einem trockenen Wärmeblock.
      2. Bereiten Sie 4-20% GradientS-Polyacrylamid-Gel vor und richten Sie das Gel auf der mit Laufpuffer gefüllten Elektrophoresekammer ein.
      3. Laden Sie Lipoproteinproben (10 l/Lane) und Proteinstandards (5 l/Lane) auf das Stapelgel.
        ANMERKUNG: Wenn die Proben zweimal konzentriert sind, wird pro Spur eine entsprechende Menge von 20 L Plasma analysiert.]
      4. Elektrophorese bei 20–40 mA Konstantstrom laufen.
      5. CBB-Färbung: Das Gel zweimal in Befestigungslösung mit sanftem Schütteln für 10 min einweichen. Das Gel mit CBB-Färbungslösung für 30 min färben. Spülen Sie das Gel in destilliertem Wasser, um den überschüssigen Fleck zu entfernen. Das Gel ist zum Fotografieren bereit.
    2. Western Blotting
      1. Führen Sie die Elektrophorese im gleichen Verfahren wie oben beschrieben durch.
        HINWEIS: Das Volumen der Lipoproteine, die für die Western-Blotting geladen werden, ist geringer als bei der oben beschriebenen CBB-Färbung (z. B. 1–5 l).
      2. Legen Sie das Gel und die PVDF-Membran zwischen Transferpuffer-getränktem Filterpapier und Formpad. Richten Sie das Sandwich in eine Halterkassette ein und legen Sie es in einen mit Transferpuffer gefüllten Tank.
      3. Elektroblotting bei 100 mA Konstantstrom für 3 h bei 4 °C durchführen.
      4. Blockierung: Inkubieren Sie die Membran im Sperrpuffer für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
      5. Primäre Ab-Reaktion: Inkubieren Sie die Membranen im primären Abs mit Sperrpuffer für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C mit leichtem Schütteln verdünnt.
        HINWEIS: Die vorgeschlagene primäre Ab-Verdünnung ist in der Materialtabelledargestellt. Drei Arten von primären Abs gegen Apolipoproteine können singoder in Cocktails verwendet werden.
      6. Waschen Sie die Membran dreimal im Waschpuffer mit Rührung, 5 min pro Wäsche.
      7. Sekundäre Ab-Reaktion: Inkubieren Sie die Membran im sekundären Abs mit Sperrpuffer für 1 h bei Raumtemperatur mit Rührung verdünnt.
        HINWEIS: Die vorgeschlagene sekundäre Ab-Verdünnung ist in der Materialtabelledargestellt.
      8. Waschen Sie die Membran dreimal im Waschpuffer mit Rührung, 5 min pro Wäsche.
      9. ECL-Erkennung: Legen Sie die Membran auf eine Plastikfolie. ECL-Detektionsreagenzien hinzufügen und 1 min inkubieren. Überschüssige Flüssigkeit abtropfen lassen und die Membran in einem Beutel versiegeln.
      10. Visualisieren Sie die Signale mit einem Bildanalysator.

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll isolierten wir Kaninchen-Lipoproteine mit 1 ml Plasma und erhielten sieben Dichtefraktionen. Isolierte Dichtefraktionen reichen aus, um Lipide und Apolipoproteine zu messen, wie oben beschrieben, für die meisten Forschungszwecke. Das gleiche Verfahren kann auch für die Isolierung von Plasma-Lipoproteinen von menschlichen und anderen Arten verwendet werden. Für kleine Tiere wie Mäuse ist gepooltes Plasma erforderlich. Abbildung 3 zeigt Lipoproteinprofile von Wildtypka...

Diskussion

Hyperlipidämie ist einer der wichtigsten Risikofaktoren für atherosklerotische Erkrankungen. Daher ist die Analyse von Plasmalipoproteinen nicht nur für die Diagnose von Dyslipidämie-Patienten wichtig, sondern auch wichtig für die Untersuchung molekularer Mechanismen des Lipoproteinstoffwechsels und der Arteriosklerose. In dieser Studie haben wir das Protokoll der Isolierung und Analyse von Plasma-Lipoproteinen beschrieben, das in Laboratorien angewendet werden kann, in denen Ultrazentrifugation verfügbar ist. Die ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Forschungsstipendium von JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81941001 und 81770457), JSPS-CAS im Rahmen des Japan-China Research Cooperative Program unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
22-gauge needleTerumoNN-2232SFor blood collection
96-well microplategreiner bio-one655101For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibodyLifeSpan BioSciencesLS-C314186For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibodyROCKLAND600-101-111For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibodyMerck MilliporeAB947For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kitFUJIFILM Wako Pure Chemical299-50101For apolipoprotein analysis
CentrifugeHITACHIhimac CF15RN
ClosureSpectrum132736For lipoprotein dialysis
Dialysis tubingFUJIFILM Wako Pure Chemical043-30921For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat blockMajor ScienceMD-01NFor SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagentsGE HealthcareRPN2209For Western blotting
Electrophoresis ChamberBIO-RADMini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrateFUJIFILM Wako Pure Chemical345-01865For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paperADVANTEC590For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotorBECKMAN COULTER357656TLA-120.2
Fixing solutionFor SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbraneBIO-RAD1620177For Western blotting
Lumino image analyzerGE HealthcareFor Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrerADVANTECSR-304For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARKBIO-RADFor lipids measurment
MicrotubeINA-OPTIKASC-0150
Orbital agitator USBDboStovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibodyJackson ImmunoResearch705-035-003For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch715-035-150For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical433-36201For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge TubesBECKMAN COULTER343778
Potassium BromideFUJIFILM Wako Pure Chemical168-03475For density solution
Power SupplyBIO-RADFor SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual XtraBIO-RAD161-0377For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainerNatsume SeisakushoKN-318For blood collection
RotorHITACHIT15A43
SDS-PAGE running buffer25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powderFUJIFILM Wako Pure Chemical190-12865For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical439-17501For lipids measurment
Triglyicerides assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical432-40201For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tubeBECKMAN COULTER347960For lipoprotein isolation
Tween 20SIGMA-ALDRICHP1379For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
UltracentrifugeBECKMAN COULTERA95761Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer systemBIO-RADMini Trans-Blot Cell

Referenzen

  1. Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
  2. Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
  3. Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
  4. Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
  5. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
  6. Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
  7. Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
  8. Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
  9. Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
  10. Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
  11. Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
  12. Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
  13. Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
  14. Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
  15. Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
  16. von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
  17. Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
  18. Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
  19. De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
  20. Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BiochemieAusgabe 167LipoproteinApolipoproteinFettstoffwechselDyslipid mieUltrazentrifugationTiermodell

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten