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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Diversi metodi sono stati utilizzati per analizzare le lipoproteine plasmatiche; tuttavia, l'ultracentrifugazione è ancora uno dei metodi più popolari e affidabili. Qui descriviamo un metodo su come isolare le lipoproteine dal plasma usando l'ultracentrifugazione a densità sequenziale e come analizzare le apolipoproteine sia a scopo diagnostico che di ricerca.

Abstract

L'analisi delle lipoproteine plasmatiche e delle apolipoproteine è una parte essenziale per la diagnosi di dislipidemia e gli studi sul metabolismo lipidico e sull'aterosclerosi. Sebbene esistano diversi metodi per analizzare le lipoproteine plasmatiche, l'ultracentrifugazione è ancora uno dei metodi più popolari e affidabili. A causa della sua procedura di separazione intatta, le frazioni di lipoproteina isolate con questo metodo possono essere utilizzate per l'analisi di lipoproteine, apolipoproteine, proteomi e studio funzionale delle lipoproteine con cellule coltivate in vitro. Qui forniamo un protocollo dettagliato per isolare sette frazioni di lipoproteina tra cui VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDL (d=1,08, 1,10 e 1,21 g/mL) dal plasma di coniglio utilizzando ultracentrifugazione galleggiante sequenziale. Inoltre, introduciamo ai lettori come analizzare le apolipoproteine come apoA-I, apoB e apoE di SDS-PAGE e Western blotting e mostriamo risultati rappresentativi dei profili di lipoproteina e apolipoproteina utilizzando modelli di coniglio iperlipidemico. Questo metodo può diventare un protocollo standard sia per i medici che per gli scienziati di base per analizzare le funzioni della lipoproteina.

Introduzione

La dislipidemia è il principale fattore di rischio della malattia aterosclerotica nel mondo. Alti livelli di lipoproteine a bassa densità (LDL) e bassi livelli di lipoproteine ad alta densità (HDL) sono strettamente associati ad un alto rischio di malattie coronarica (CHD)1,2. Nell'ambiente clinico, sia il colesterolo LDL (LDL-C) che il colesterolo HDL (HDL-C) vengono misurati regolarmente utilizzando un analizzatore automatizzato in un laboratorioclinico 3,4. Nonostante ciò, è essenziale analizzare i profili di lipoproteina nei dettagli per la diagnosi di dislipidemia e lo studio del metabolismo lipidico e dell'aterosclerosi negli animali umani e sperimentali. Diversi metodi sono stati segnalati per analizzare le lipoproteine plasmatiche come l'ultracentrifugazione, la cromatografia ad esclusione delle dimensioni [cromatografia liquida proteica veloce (FPLC) e cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)], l'elettroforesi da gel di agarosio e poliacrilammide, risonanza magnetica nucleare e precipitazioni chimiche selettive usando polianioni e formazioni divalenti o altre sostanze chimiche. Negli anni '50, il gruppo di Havel propose per la prima volta il concetto di lipoproteine definite dalle densità usando l'ultracentrifugazione e le classificò in chilomicroni (CM), lipoproteine a bassissimo densità (VLDL), lipoproteine a densità intermedia (IDL), LDL e HDL5 e successivamente, il metodo fu ulteriormente modificato da altrigruppi 6,7. Fino ad ora, l'ultracentrifugazione è il metodo più popolare e affidabile mentre il protocollo pratico non è ancora disponibile. In questo documento, abbiamo cercato di descrivere un protocollo facile da usare per isolare una piccola scala di plasma usando l'ultracentrifugazione galleggiante a densità sequenziale originariamente descrittain precedenza 8. Isolamento di sette frazioni plasmatiche lipoproteine [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDL (d=1,08, 1.10, e 1.21 g/mL)] consente ai ricercatori di effettuare un'analisi approfondita sia delle lipoproteine che delle loro apolipoproteine compositive9,10,11. Le lipoproteine intatte a sette densità consecutive possono essere utilizzate per analizzare le funzioni della lipoproteina e servire anche a strategie in vitro basate su cellule. Questo protocollo dovrebbe essere utile sia per la diagnosi clinica che per la ricerca di base. Qui abbiamo usato il plasma di coniglio come esempio per dimostrare questa tecnica mentre il plasma di altre specie può essere applicato allo stesso modo.

Protocollo

Tutte le procedure per gli studi sui conigli sono state eseguite con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yamanashi (numero approvato: A28-39).

1. Separazione al plasma dal sangue di coniglio

  1. Preparare microtubi da 1,5 mL contenenti 15 μL di 0,5 M EDTA (pH 8,0) per la raccolta del sangue.
  2. Mettere un coniglio in un trattiere e forare un'arteria intermedia auricolare usando un ago calibro 22 e raccogliere il sangue in un tubo. Mescolare delicatamente il sangue con EDTA e metterli sul ghiaccio.
  3. Centrifugare le provette ematiche a 1.500 x g per 20 min a 4 °C e raccogliere il plasma su un nuovo microtubo.
    NOTA: 3 mL di sangue sono sufficienti per raccogliere 1 mL di plasma. Se raccogli sangue da topi o altri piccoli animali, devi raggrupparli.

2. Isolamento delle lipoproteine plasmatiche

NOTA: la procedura schematica è illustrata nella figura 1. Il metodo di preparazione delle soluzioni di densità del bromuro di potassio (KBr) è illustrato nella tabella 1.

  1. Trasferire 1 ml di plasma in un tubo ultracentrifugo in policarbonato (Figura 2A).
  2. Caricare questi tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare il plasma a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C(Figura 2B).
    NOTA: Per il rotore Beckman TLA 120.2, 356.000 x g (campo centrifugo relativo medio, Av RCF) corrisponde a 100.000 giri/min.
  3. Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [VLDL (d<1.006 g/mL)], circa 200 μL in un nuovo microtubo (Figura 2C). Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la separazione successiva (Figura 2D). Misurare il volume e rendere il volume totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,006 g/mL).
    NOTA: Impostare una lama sull'affettatubo. Regolare la posizione della lama ad un livello compreso tra la frazione superiore (200 μL) e la frazione inferiore (800 μL). Il precipitante viscoso nella frazione inferiore deve essere raccolto con attenzione e completamente tubazione in tutti i seguenti passaggi. In caso di pausa, eseguire questa procedura dopo aver separato la frazione superiore e inferiore in tutti i passaggi. Conservare il campione a 4°C fino alla successiva centrifugazione.
  4. Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,02 g/mL aggiungendo 58,9 μL di soluzione d=1,21 g/mL e 141,1 μL di soluzione d=1,02 g/mL (il volume totale è di 1 mL).
  5. Caricare questi tubi in rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C.
  6. Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [IDL (d=1,02 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione. Misurare il volume e rendere il volume totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,02 g/mL).
  7. Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,04 g/mL aggiungendo 94,1 μL di soluzione d=1,21 g/mL e 105,9 μL di soluzione d=1,04 g/mL (il volume totale è di 1 mL).
  8. Caricare questi tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C.
  9. Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [LDL (d=1,04 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione. Misurare il volume e rendere il totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,04 g/mL).
  10. Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,06 g/mL aggiungendo 106,7 μL di soluzione d=1,21 g/mL e 93,3 μL di soluzione d=1,06 g/mL (il volume totale è di 1 mL).
  11. Caricare questi tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C.
  12. Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [LDL (d=1,06 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione. Misurare il volume e rendere il totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,06 g/mL).
  13. Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,08 g/mL aggiungendo 123,1 μL di soluzione d=1,21 g/mL e 76,9 μL di soluzione d=1,08 g/mL (il volume totale è di 1 mL).
  14. Caricare questi tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C.
  15. Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [HDL2 (d=1,08 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione. Misurare il volume e rendere il totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,08 g/mL).
  16. Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,10 g/mL aggiungendo 145,5 μL di soluzione d=1,21 g/mL e 54,5 μL di soluzione d=1,10 g/mL (il volume totale è di 1 mL).
  17. Caricare questi tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C.
  18. Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [HDL2 (d=1,10 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione. Misurare il volume e rendere il totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,10 g/mL).
  19. Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,21 g/mL aggiungendo 0,140 g di polvere di bromuro di potassio (KBr) e scioglierla completamente. Misurare il volume e renderli a 1 mL aggiungendo la soluzione d=1,21 g/mL.
  20. Caricare questi tubi in rotore ad angolo fisso e centrifugare a 513.000 x g per 4 h a 4 °C.
    NOTA: Per il rotore Beckman TLA 120.2, 513.000 x g (Av RCF) corrisponde a 120.000 giri/min.
  21. Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [HDL3 (d=1,21 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Questo è l'ultimo passo per l'ultracentrifugazione.

3. Dialisi

NOTA: Poiché le frazioni di densità (ad eccezione della frazione d<1.006 g/mL) contengono alte concentrazioni di KBr, è necessario rimuoverle per dialisi.

  1. Trasferire le frazioni di densità in un tubo di dialisi e ritagliare entrambe le estremità con chiusure.
  2. Dializzare contro 2 L di tampone di dialisi come PBS/ 1 mM EDTA per 6 h a 4 °C con agitazione utilizzando un agitatore magnetico.
  3. Sostituire con nuovo tampone e dializzare di nuovo per altri 6 h a 4 °C.
  4. Raccogliere le frazioni di densità e misurare il volume. Regolare tutte le frazioni di densità allo stesso volume (ad esempio, 250 μL).
    NOTA: È possibile calcolare il fattore concentrato da 1 mL di plasma originale (ad esempio, 250 μL di frazione di densità corrisponde a una concentrazione quattro volte superiore).

4. Analisi delle lipoproteine

NOTA: Dopo la dialisi, queste lipoproteine sono pronte per diverse analisi. Le lipoproteine possono essere valutate misurando lipidi o apolipoproteine o entrambi. Per misurare il contenuto lipidico come colesterolo totale (TC), trigliceridi (TG), fosfolipidi (PL) e colesterolo libero (FC) in ogni frazione, utilizziamo kit di dosaggio colorimetrici enzimatici commerciali. Per l'analisi delle apolipoproteine, utilizziamo SDS-PAGE visualizzato con colorazione CBB o western blotting.

  1. Analisi lipidica
    NOTA: Lipidi come TC, TG, PL e FC nella frazione lipoproteina possono essere misurati utilizzando kit di misurazione disponibili in commercio. Le procedure dipendono dai reagenti utilizzati, quindi segui le istruzioni di ogni kit utilizzato. Qui mostriamo un tipico test di micropiatta usando un kit di saggi enzimatici commerciali.
    1. Applicare 8 μL di campione di lipoproteina e sostanza di taratura standard su micropiatta da 96 pozzi.
    2. Aggiungere 240 μL di reagente di dosaggio e mescolare mediante pipettazione.
    3. Incubare a 37 °C per 10 minuti.
    4. Misurare l'OD con un lettore di micropiatte e calcolare le concentrazioni lipidiche.
  2. Analisi dell'apolipoproteina
    1. Colorazione SDS-PAGE e CBB
      1. Preparazione del campione: Aggiungere 10 μL di 2x Tampone campione a 10 μL di frazione lipoproteina. Scaldare la miscela a 80 °C per 5 minuti utilizzando un blocco di calore asciutto.
      2. Preparare il gel SDS-poliacrilammide sfumato al 4-20% e impostare il gel sulla camera di elettroforesi riempita con tampone di corsa.
      3. Caricare il campione di lipoproteina (10 μL/corsia) e gli standard proteici (5 μL/ corsia) sul gel impilabile.
        NOTA: Se i campioni sono due volte concentrati, verrà analizzata una quantità equivalente di plasma da 20 μL per corsia.]
      4. Eseguire l'elettroforesi a corrente costante di 20-40 mA.
      5. Colorazione CBB: Immergere il gel due volte in soluzione di fissaggio con agitazione delicata per 10 minuti. Macchiare il gel con soluzione di colorazione CBB per 30 min. Risciacquare il gel in acqua distillata per rimuovere la macchia in eccesso. Il gel è pronto per la fotografia.
    2. Gonfiore occidentale
      1. Eseguire l'elettroforesi nella stessa procedura descritta sopra.
        NOTA: Il volume di lipoproteine caricate per l'assorbimento occidentale è inferiore a quello della colorazione CBB sopra descritta (ad esempio 1-5 μL).
      2. Posizionare il gel e la membrana PVDF tra la carta filtrante imbevuta di tampone di trasferimento e il form pad. Impostare il sandwich in una cassetta di supporto e posizionare in un serbatoio pieno di buffer di trasferimento.
      3. Eseguire l'elettroblotting a corrente costante di 100 mA per 3 ore a 4 °C.
      4. Blocco: Incubare la membrana in tampone di blocco per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
      5. Reazione Primaria Ab: Incubare le membrane negli Abs primari diluiti con tampone di blocco per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C con lievi scosse.
        NOTA: l'ab diluizione primaria suggerita è mostrata nella tabella dei materiali. Tre tipi di Abs primari contro le apolipoproteine possono essere usati singolarmente o nei cocktail.
      6. Lavare la membrana tre volte nel tampone di lavaggio con agitazione, 5 minuti per lavaggio.
      7. Reazione Ab secondaria: Incubare la membrana negli Abs secondari diluiti con tampone di blocco per 1 h a temperatura ambiente con agitazione.
        NOTA: L'ab diluizione secondaria suggerita è mostrata nella tabella dei materiali.
      8. Lavare la membrana tre volte nel tampone di lavaggio con agitazione, 5 minuti per lavaggio.
      9. Rilevamento ECL: Posizionare la membrana su un involucro di plastica. Aggiungere reagenti di rilevamento ECL e incubare per 1 min. Scolare il liquido in eccesso e sigillare la membrana in un sacchetto.
      10. Visualizzare i segnali utilizzando un analizzatore di immagini.

Risultati

Utilizzando questo protocollo, abbiamo isolato le lipoproteine di coniglio usando 1 mL di plasma e ottenuto sette frazioni di densità. Le frazioni di densità isolate sono sufficienti per misurare lipidi e apolipoproteine come descritto sopra per la maggior parte degli scopi di ricerca. La stessa procedura può essere utilizzata anche per isolare le lipoproteine plasmatiche dall'uomo e da altre specie. Per animali di piccole dimensioni come i topi, è necessario plasma in pool. La figura 3 ...

Discussione

L'iperlipidemia è uno dei principali fattori di rischio della malattia aterosclerotica. Pertanto, l'analisi delle lipoproteine plasmatiche non è solo essenziale per la diagnosi di pazienti con dislipidemia, ma anche importante per lo studio dei meccanismi molecolari del metabolismo della lipoproteina e dell'aterosclerosi. In questo studio, abbiamo descritto il protocollo di isolamento e analisi delle lipoproteine plasmatiche che può essere applicato nei laboratori in cui è disponibile l'ultracentrifugazione. Le infor...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di ricerca del JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, della National Natural Science Foundation of China (n. 81941001 e 81770457), JSPS-CAS nell'ambito del Japan-China Research Cooperative Program.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
22-gauge needleTerumoNN-2232SFor blood collection
96-well microplategreiner bio-one655101For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibodyLifeSpan BioSciencesLS-C314186For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibodyROCKLAND600-101-111For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibodyMerck MilliporeAB947For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kitFUJIFILM Wako Pure Chemical299-50101For apolipoprotein analysis
CentrifugeHITACHIhimac CF15RN
ClosureSpectrum132736For lipoprotein dialysis
Dialysis tubingFUJIFILM Wako Pure Chemical043-30921For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat blockMajor ScienceMD-01NFor SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagentsGE HealthcareRPN2209For Western blotting
Electrophoresis ChamberBIO-RADMini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrateFUJIFILM Wako Pure Chemical345-01865For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paperADVANTEC590For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotorBECKMAN COULTER357656TLA-120.2
Fixing solutionFor SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbraneBIO-RAD1620177For Western blotting
Lumino image analyzerGE HealthcareFor Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrerADVANTECSR-304For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARKBIO-RADFor lipids measurment
MicrotubeINA-OPTIKASC-0150
Orbital agitator USBDboStovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibodyJackson ImmunoResearch705-035-003For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch715-035-150For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical433-36201For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge TubesBECKMAN COULTER343778
Potassium BromideFUJIFILM Wako Pure Chemical168-03475For density solution
Power SupplyBIO-RADFor SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual XtraBIO-RAD161-0377For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainerNatsume SeisakushoKN-318For blood collection
RotorHITACHIT15A43
SDS-PAGE running buffer25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powderFUJIFILM Wako Pure Chemical190-12865For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical439-17501For lipids measurment
Triglyicerides assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical432-40201For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tubeBECKMAN COULTER347960For lipoprotein isolation
Tween 20SIGMA-ALDRICHP1379For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
UltracentrifugeBECKMAN COULTERA95761Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer systemBIO-RADMini Trans-Blot Cell

Riferimenti

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