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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Plusieurs méthodes ont été utilisées pour analyser les lipoprotéines plasmatiques; cependant, l’ultracentrifugation reste l’une des méthodes les plus populaires et fiables. Ici, nous décrivons une méthode concernant la façon d’isoler les lipoprotéines du plasma en utilisant l’ultracentrifugation séquentielle de densité et comment analyser les apolipoprotéines à des fins diagnostiques et de recherche.

Résumé

L’analyse des lipoprotéines et des apolipoprotéines de plasma est une partie essentielle pour le diagnostic de dyslipidémie et les études du métabolisme de lipide et de l’athérosclérose. Bien qu’il existe plusieurs méthodes pour analyser les lipoprotéines plasmatiques, l’ultracentrifugation reste l’une des méthodes les plus populaires et fiables. En raison de sa procédure intacte de séparation, les fractions de lipoprotéine isolées par cette méthode peuvent être employées pour l’analyse des lipoprotéines, des apolipoprotéines, des protéomes, et de l’étude fonctionnelle des lipoprotéines avec des cellules cultured in vitro. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour isoler sept fractions de lipoprotéine comprenant VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 et 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1,10 et 1,21 g/mL) provenant du plasma de lapin à l’aide d’ultracentrifugation flottante séquentielle. En outre, nous présentons aux lecteurs comment analyser les apolipoprotéines telles que l’apoA-I, l’apoB et l’apoE par SDS-PAGE et le ballonnement occidental et montrer des résultats représentatifs des profils de lipoprotéine et d’apolipoprotéine utilisant des modèles hyperlipidémiques de lapin. Cette méthode peut devenir un protocole standard pour les cliniciens et les scientifiques de base pour analyser les fonctions lipoprotéines.

Introduction

La dyslipidémie est le principal facteur de risque de maladie athéroclérotique dans le monde. Des niveaux élevés de lipoprotéines de basse densité (LDL) et de faibles niveaux de lipoprotéines de haute densité (HDLs) sont étroitement associés à un risque élevé de maladie coronarienne (CHD)1,2. En milieu clinique, le cholestérol LDL (LDL-C) et le cholestérol HDL (HDL-C) sont régulièrement mesurés à l’aide d’un analyseur automatisé dans un laboratoireclinique 3,4. Malgré cela, il est essentiel d’analyser les profils de lipoprotéine dans les détails pour le diagnostic de la dyslipidémie et l’étude du métabolisme lipidique et de l’athérosclérose chez les animaux humains et expérimentaux. Plusieurs méthodes ont été rapportées pour analyser des lipoprotéines de plasma telles que l’ultracentrifugation, la chromatographie d’exclusion de taille [chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC) et chromatographie liquide de haute performance (HPLC)], électrophoresis par gels d’agarose et de polyacrylamide, résonance magnétique nucléaire, et précipitation chimique sélective utilisant des polyanions et des cations divalentes ou d’autres produits chimiques. Dans les années 1950, le groupe de Havel a proposé pour la première fois le concept de lipoprotéines définies par densités utilisant l’ultracentrifugation et les a classées en chylomicrons (CM), lipoprotéines de très faible densité (VLDL), lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL), LDL et HDL5 et plus tard, la méthode a été modifiée par d’autres groupes6,7. Jusqu’à présent, l’ultracentrifugation est la méthode la plus populaire et fiable alors que le protocole pratique n’est toujours pas disponible. Dans cet article, nous avons essayé de décrire un protocole facile à utiliser pour isoler une petite échelle de plasma utilisant l’ultracentrifugation flottante de densité séquentielle décrite à l’origineprécédemment 8. Isolement de sept fractions de lipoprotéine plasmatique [VLDL (d<1,006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 et 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1,10 et 1,21 g/mL)] permet aux chercheurs de faire une analyse approfondie des lipoprotéines et de leurs apolipoprotéines compositionnelles9,10,11. Les sept lipoprotéines intactes de densité consécutive peuvent être employées pour analyser des fonctions de lipoprotéine et également servir aux stratégies in vitro basées sur la cellule. Ce protocole devrait être utile pour le diagnostic clinique et la recherche fondamentale. Ici, nous avons utilisé le plasma de lapin comme exemple pour démontrer cette technique tandis que le plasma d’autres espèces peut être appliqué de la même manière.

Protocole

Toutes les procédures d’études sur le lapin ont été effectuées avec l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Yamanashi (numéro approuvé : A28-39).

1. Séparation de plasma du sang de lapin

  1. Préparer des microtubes de 1,5 mL contenant 15 μL de 0,5 M EDTA (pH 8,0) pour la collecte de sang.
  2. Mettez un lapin dans un restrainer et perforez une artère intermédiaire auriculaire à l’aide d’une aiguille de calibre 22 et recueillez le sang dans un tube. Mélanger le sang avec l’EDTA doucement et le mettre sur la glace.
  3. Centrifuger les tubes sanguins à 1 500 x g pendant 20 min à 4 °C et recueillir le plasma sur un nouveau microtube.
    REMARQUE : 3 mL de sang suffisent pour recueillir 1 mL de plasma. Si vous collectez du sang auprès de souris ou d’autres petits animaux, vous devez les mettre en commun.

2. Isolement des lipoprotéines plasmatiques

REMARQUE : La procédure schématique est indiquée dans la figure 1. La méthode de préparation des solutions de densité de bromure de potassium (KBr) est indiquée dans le tableau 1.

  1. Transférer 1 mL de plasma dans un tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate(figure 2A).
  2. Chargez ces tubes dans un rotor à angle fixe et centrifuger le plasma à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C (figure 2B).
    REMARQUE : Pour le rotor Beckman TLA 120,2, 356 000 x g (champ centrifuge relatif moyen, Av RCF) correspond à 100 000 rpm.
  3. Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [VLDL (d<1,006 g/mL)], environ 200 μL dans un nouveau microtube (Figure 2C). Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante (Figure 2D). Mesurez le volume et faites le volume total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,006 g/mL).
    REMARQUE : Installez une lame sur la trancheuse à tube. Ajustez la position de la lame à un niveau entre la fraction supérieure (200 μL) et la fraction inférieure (800 μL). Le précipité visqueux dans la fraction inférieure doit être recueilli soigneusement et complètement par pipetting dans toutes les étapes suivantes. Si vous faites une pause, faites-le après avoir séparé la fraction supérieure et inférieure dans toutes les étapes. Conserver l’échantillon à 4 °C jusqu’à la prochaine centrifugation.
  4. Ajustez la fraction inférieure (total 800 μL) en d=1,02 g/mL en ajoutant 58,9 μL de solution d=1,21 g/mL et 141,1 μL de solution d=1,02 g/mL (le volume total est de 1 mL).
  5. Chargez ces tubes dans le rotor à angle fixe et la centrifugeuse à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C.
  6. Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [IDL (d=1,02 g/mL)] environ 200 μL dans un nouveau microtube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante. Mesurez le volume et faites le volume total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,02 g/mL).
  7. Ajustez la fraction inférieure (total 800 μL) en d=1,04 g/mL en ajoutant 94,1 μL de solution d=1,21 g/mL et 105,9 μL de solution d=1,04 g/mL (le volume total est de 1 mL).
  8. Chargez ces tubes dans un rotor à angle fixe et une centrifugeuse à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C.
  9. Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [LDL (d=1,04 g/mL)] d’environ 200 μL dans un nouveau microtube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante. Mesurez le volume et faites le total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,04 g/mL).
  10. Ajustez la fraction inférieure (total 800 μL) en d=1,06 g/mL en ajoutant 106,7 μL de solution d=1,21 g/mL et 93,3 μL de solution d=1,06 g/mL (le volume total est de 1 mL).
  11. Chargez ces tubes dans un rotor à angle fixe et une centrifugeuse à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C.
  12. Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [LDL (d=1,06 g/mL)] d’environ 200 μL dans un nouveau microtube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante. Mesurez le volume et faites le total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,06 g/mL).
  13. Ajustez la fraction inférieure (total 800 μL) à d=1,08 g/mL en ajoutant 123,1 μL de solution d=1,21 g/mL et 76,9 μL de solution d=1,08 g/mL (le volume total est de 1 mL).
  14. Chargez ces tubes dans un rotor à angle fixe et une centrifugeuse à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C.
  15. Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [HDL2 (d=1,08 g/mL)] environ 200 μL dans un nouveau microtube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante. Mesurez le volume et faites le total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,08 g/mL).
  16. Ajustez la fraction inférieure (total 800 μL) à d=1,10 g/mL en ajoutant 145,5 μL de solution d=1,21 g/mL et 54,5 μL de solution d=1,10 g/mL (le volume total est de 1 mL).
  17. Chargez ces tubes dans un rotor à angle fixe et une centrifugeuse à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C.
  18. Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [HDL2 (d=1,10 g/mL)] environ 200 μL dans un nouveau microtube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante. Mesurez le volume et faites le total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,10 g/mL).
  19. Ajuster la fraction inférieure (total 800 μL) en d=1,21 g/mL en ajoutant 0,140 g de bromure de potassium (KBr) en poudre et la dissoudre complètement. Mesurez le volume et faites-les jusqu’à 1 mL en ajoutant la solution d=1,21 g/mL.
  20. Chargez ces tubes dans le rotor à angle fixe et la centrifugeuse à 513 000 x g pendant 4 h à 4 °C.
    REMARQUE : Pour le rotor Beckman TLA 120.2, 513 000 x g (Av RCF) correspond à 120 000 rpm.
  21. Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [HDL3 (d=1,21 g/mL)] environ 200 μL dans un nouveau microtube. C’est la dernière étape de l’ultracentrifugation.

3. Dialyse

REMARQUE : Étant donné que les fractions de densité (à l’exception de la fraction d<1,006 g/mL) contiennent des concentrations élevées de KBr, il est nécessaire de les enlever par dialyse.

  1. Transférez les fractions de densité dans un tube de dialyse et coupez les deux extrémités avec des fermetures.
  2. Dialyz contre 2 L de tampon de dialyse tels que PBS/ 1 mM EDTA pendant 6 h à 4 °C avec agitation à l’aide d’un agitateur magnétique.
  3. Remplacer par un nouveau tampon et dialyser à nouveau pendant encore 6 h à 4 °C.
  4. Recueillir les fractions de densité et mesurer le volume. Ajustez toutes les fractions de densité au même volume (p. ex., 250 μL).
    REMARQUE : Vous pouvez calculer le facteur concentré à partir de 1 mL de plasma d’origine (p. ex., 250 μL de fraction de densité correspond à quatre fois la concentration).

4. Analyse des lipoprotéines

REMARQUE : Après dialyse, ces lipoprotéines sont prêtes pour différentes analyses. Les lipoprotéines peuvent être évaluées en mesurant les lipides ou les apolipoprotéines ou les deux. Pour mesurer la teneur en lipides tels que le cholestérol total (TC), les triglycérides (TG), les phospholipides (PL) et le cholestérol libre (FC) dans chaque fraction, nous utilisons des kits d’analyse colorimétrique enzymatique commerciale. Pour l’analyse des apolipoprotéines, nous utilisons SDS-PAGE visualisé avec des taches CBB ou des ballonnements occidentaux.

  1. Analyse lipidique
    REMARQUE : Les lipides tels que TC, TG, PL et FC dans la fraction de lipoprotéine peuvent être mesurés à l’aide de kits de mesure disponibles dans le commerce. Les procédures dépendent des reagents utilisés, alors suivez les instructions de chaque kit utilisé. Ici, nous montrons un test de microplaque typique à l’aide d’un kit d’analyse enzymatique commerciale.
    1. Appliquer 8 μL d’échantillon de lipoprotéine et de substance d’étalonnage standard sur une microplaque de 96 puits.
    2. Ajouter 240 μL de reagent d’analyse et mélanger au pipetage.
    3. Incuber à 37 °C pendant 10 min.
    4. Mesurez l’OD à l’aide d’un lecteur de microplaque et calculez les concentrations lipidiques.
  2. Analyse de l’apolipoprotéine
    1. Coloration SDS-PAGE et CBB
      1. Préparation de l’échantillon : Ajouter 10 μL de tampon échantillon 2x à 10 μL de fraction de lipoprotéine. Chauffer le mélange à 80 °C pendant 5 min à l’aide d’un bloc thermique sec.
      2. Préparer 4-20% gradient SDS-gel polyacrylamide et mettre en place le gel sur la chambre d’électrophoresis rempli de tampon en cours d’exécution.
      3. Chargez l’échantillon de lipoprotéine (10 μL/lane) et les normes protéiques (5 μL/lane) sur le gel d’empilage.
        REMARQUE : Si les échantillons sont deux fois concentrés, une quantité équivalente de plasma de 20 μL sera analysée par voie.]
      4. Exécuter l’électrophoresis à 20-40 mA courant constant.
      5. Coloration CBB: Tremper le gel deux fois dans la solution de fixation avec une secousse douce pendant 10 min. Tacher le gel avec la solution de coloration CBB pendant 30 min. Rincer le gel à l’eau distillée pour enlever l’excès de taches. Le gel est prêt pour la photographie.
    2. Ballonnement occidental
      1. Effectuez l’électrophorèse dans la même procédure que décrite ci-dessus.
        REMARQUE : Le volume de lipoprotéines chargées pour le ballonnement occidental est inférieur à celui des taches CBB décrites ci-dessus (p. ex. 1 à 5 μL).
      2. Placez le gel et la membrane PVDF entre le papier filtre imbibé de tampon de transfert et le tampon de forme. Installez le sandwich dans une cassette de support et placez-le dans un réservoir rempli de tampon de transfert.
      3. Effectuer l’électroblotting à 100 mA courant constant pendant 3 h à 4 °C.
      4. Blocage : Incuber la membrane en bloquant le tampon pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C.
      5. Réaction ab primaire : Incuber les membranes dans les abdos primaires diluées avec tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C avec des secousses légères.
        REMARQUE : La dilution primaire suggérée d’Ab est montrée dans le tableau des matériaux. Trois types d’abs primaires contre les apolipoprotéines peuvent être utilisés uniquement ou dans les cocktails.
      6. Laver la membrane trois fois dans le tampon de lavage avec agitation, 5 min par lavage.
      7. Réaction secondaire d’Ab : Incuber la membrane dans les abs secondaires dilués avec le tampon de blocage pendant 1 h à la température ambiante avec l’agitation.
        REMARQUE : La dilution secondaire suggérée d’Ab est indiquée dans le tableau des matériaux.
      8. Laver la membrane trois fois dans le tampon de lavage avec agitation, 5 min par lavage.
      9. Détection ecl: Placer la membrane sur une pellicule plastique. Ajouter les réagenants de détection ECL et incuber pendant 1 min. Égoutter l’excès de liquide et sceller la membrane dans un sac.
      10. Visualisez les signaux à l’aide d’un analyseur d’images.

Résultats

En utilisant ce protocole, nous avons isolé des lipoprotéines de lapin utilisant 1 mL de plasma et avons obtenu sept fractions de densité. Fractions de densité isolées sont suffisants pour mesurer les lipides et les apolipoprotéines comme décrit ci-dessus pour la plupart des fins de recherche. La même procédure peut également être utilisée pour isoler les lipoprotéines plasmatiques de l’homme et d’autres espèces. Pour les animaux de petite taille comme les souris, un plasma mis en commun est nécessaire...

Discussion

L’hyperlipidémie est l’un des facteurs de risque les plus importants de la maladie athérosclérostique. Ainsi, l’analyse des lipoprotéines de plasma est non seulement essentielle pour le diagnostic des patients de dyslipidémie mais également importante pour l’investigation des mécanismes moléculaires du métabolisme de lipoprotéine et de l’athérosclérose. Dans cette étude, nous avons décrit le protocole d’isolement et d’analyse des lipoprotéines plasmatiques qui peuvent être appliquées dans l...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus en partie par une subvention de recherche du numéro de subvention JP 20K08858 de JSPS KAKENHI, de la National Natural Science Foundation of China (no 81941001 et 81770457), du JSPS-CAS dans le cadre du Programme de coopération de recherche Japon-Chine.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
22-gauge needleTerumoNN-2232SFor blood collection
96-well microplategreiner bio-one655101For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibodyLifeSpan BioSciencesLS-C314186For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibodyROCKLAND600-101-111For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibodyMerck MilliporeAB947For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kitFUJIFILM Wako Pure Chemical299-50101For apolipoprotein analysis
CentrifugeHITACHIhimac CF15RN
ClosureSpectrum132736For lipoprotein dialysis
Dialysis tubingFUJIFILM Wako Pure Chemical043-30921For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat blockMajor ScienceMD-01NFor SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagentsGE HealthcareRPN2209For Western blotting
Electrophoresis ChamberBIO-RADMini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrateFUJIFILM Wako Pure Chemical345-01865For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paperADVANTEC590For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotorBECKMAN COULTER357656TLA-120.2
Fixing solutionFor SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbraneBIO-RAD1620177For Western blotting
Lumino image analyzerGE HealthcareFor Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrerADVANTECSR-304For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARKBIO-RADFor lipids measurment
MicrotubeINA-OPTIKASC-0150
Orbital agitator USBDboStovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibodyJackson ImmunoResearch705-035-003For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch715-035-150For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical433-36201For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge TubesBECKMAN COULTER343778
Potassium BromideFUJIFILM Wako Pure Chemical168-03475For density solution
Power SupplyBIO-RADFor SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual XtraBIO-RAD161-0377For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainerNatsume SeisakushoKN-318For blood collection
RotorHITACHIT15A43
SDS-PAGE running buffer25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powderFUJIFILM Wako Pure Chemical190-12865For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical439-17501For lipids measurment
Triglyicerides assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical432-40201For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tubeBECKMAN COULTER347960For lipoprotein isolation
Tween 20SIGMA-ALDRICHP1379For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
UltracentrifugeBECKMAN COULTERA95761Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer systemBIO-RADMini Trans-Blot Cell

Références

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