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Resumo

Vários métodos têm sido utilizados para analisar lipoproteínas plasmáticas; no entanto, a ultracentrifugação ainda é um dos métodos mais populares e confiáveis. Aqui, descrevemos um método sobre como isolar as lipoproteínas do plasma usando ultracentrifugação de densidade sequencial e como analisar as apolipoproteínas para fins diagnósticos e de pesquisa.

Resumo

A análise de lipoproteínas plasmáticas e apolipoproteínas é parte essencial para o diagnóstico de dislipidemia e estudos de metabolismo lipídico e aterosclerose. Embora existam vários métodos para analisar lipoproteínas plasmáticas, a ultracentrifugação ainda é um dos métodos mais populares e confiáveis. Devido ao seu procedimento de separação intacto, as frações de lipoproteína isoladas por este método podem ser utilizadas para análise de lipoproteínas, apolipoproteínas, proteomes e estudo funcional de lipoproteínas com células cultivadas in vitro. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para isolar sete frações de lipoproteína, incluindo VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1,10, e 1,21 g/mL) do plasma de coelho usando ultracentrifugação flutuante sequencial. Além disso, apresentamos aos leitores como analisar apolipoproteínas como apoA-I, apoB e apoE por SDS-PAGE e mancha ocidental e mostrar resultados representativos de perfis de lipoproteína e apolipoproteína usando modelos de coelho hiperlipidêmica. Este método pode se tornar um protocolo padrão tanto para médicos quanto cientistas básicos analisarem as funções de lipoproteína.

Introdução

A dislipidemia é o principal fator de risco da doença aterosclerótica no mundo. Altos níveis de lipoproteínas de baixa densidade (LDLs) e baixos níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDLs) estão intimamente associados a um alto risco de doença cardíaca coronariana (CHD)1,2. No cenário clínico, tanto o LDL-colesterol (LDL-C) quanto o HDL-colesterol (HDL-C) são medidos rotineiramente usando um analisador automatizado em um laboratório clínico3,4. Apesar disso, é essencial analisar os perfis de lipoproteína em detalhes para o diagnóstico de dislipidemia e o estudo do metabolismo lipídico e da aterosclerose em animais humanos e experimentais. Vários métodos foram relatados para analisar lipoproteínas plasmáticas, como ultracentrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho [cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)], eletrofose por géis de agarose e poliacrilamida, ressonância magnética nuclear e precipitação química seletiva usando polianões e cára divalentes ou outros produtos químicos. Na década de 1950, o grupo de Havel propôs pela primeira vez o conceito de lipoproteínas definidas por densidades usando ultracentrifugação e as classificou em chylomicrons (CM), lipoproteínas de baixa densidade (VLDL), lipoproteínas de densidade intermediária (IDL), LDL e HDL5 e posteriormente, o método foi modificado por outros grupos6,7. Até agora, a ultracentrifugação é o método mais popular e confiável, enquanto o protocolo prático ainda não está disponível. Neste artigo, tentamos descrever um protocolo fácil de usar para isolar uma pequena escala de plasma usando ultracentrifugação flutuante de densidade sequencial originalmente descrita anteriormente8. Isolamento de sete frações de lipoproteína plasmáticas [VLDL (d<1,006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1.10, e 1,21 g/mL)] permite que os pesquisadores façam uma análise extensiva das lipoproteínas e suas apolipoproteínas composicionais9,10,11. As sete lipoproteínas de densidade consecutiva podem ser usadas para analisar funções de lipoproteína e também servir para estratégias in vitro baseadas em células. Este protocolo deve ser útil tanto para o diagnóstico clínico quanto para a pesquisa básica. Aqui usamos o plasma de coelho como exemplo para demonstrar essa técnica, enquanto o plasma de outras espécies pode ser aplicado da mesma forma.

Protocolo

Todos os procedimentos para estudos de coelhos foram realizados com aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yamanashi (número aprovado: A28-39).

1. Separação de plasma do sangue de coelho

  1. Prepare microtubos de 1,5 mL contendo 15 μL de 0,5 M EDTA (pH 8.0) para coleta de sangue.
  2. Coloque um coelho em um contidor e perfure uma artéria intermediária auricular usando uma agulha calibre 22 e colete sangue em um tubo. Misture o sangue com EDTA suavemente e coloque-os no gelo.
  3. Centrifugar os tubos de sangue a 1.500 x g por 20 min a 4 °C e coletar plasma para um novo microtubo.
    NOTA: 3 mL de sangue é suficiente para coletar plasma de 1 mL. Se você coletar sangue de ratos ou outros animais pequenos, você precisa juncioná-los.

2. Isolamento de lipoproteínas plasmáticas

NOTA: O procedimento esquemático é mostrado na Figura 1. O método de preparação das soluções de densidade de brometo de potássio (KBr) é mostrado na Tabela 1.

  1. Transfira 1 mL de plasma para um tubo de ultracentrífuga de policarbonato(Figura 2A).
  2. Carregue esses tubos em um rotor de ângulo fixo e centrífugue o plasma a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C(Figura 2B).
    NOTA: Para o rotor Beckman TLA 120.2, 356.000 x g (campo centrífuga relativo médio, Av RCF) corresponde a 100.000 rpm.
  3. Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [VLDL (d<1.006 g/mL)], aproximadamente 200 μL em um novo microtubo(Figura 2C). Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrifuagem de policarbonato para a próxima separação(Figura 2D). Meça o volume e faça o volume total até 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,006 g/mL).
    NOTA: Coloque uma lâmina no cortador do tubo. Ajuste a posição da lâmina em um nível entre a fração superior (200 μL) e a fração inferior (800 μL). O precipitante viscoso na fração inferior deve ser coletado cuidadosamente e completamente por pipetação em todas as etapas seguintes. Em caso de pausa, faça-o depois de separar a fração superior e inferior em todas as etapas. Armazene a amostra a 4°C até a próxima centrifugação.
  4. Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,02 g/mL adicionando 58,9 μL de solução d=1,21 g/mL e 141,1 μL de solução d=1,02 g/mL (o volume total é de 1 mL).
  5. Carregue estes tubos em rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C.
  6. Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [IDL (d=1,02 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação. Meça o volume e faça o volume total até 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,02 g/mL).
  7. Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,04 g/mL adicionando 94,1 μL de solução d=1,21 g/mL e 105,9 μL de solução d=1,04 g/mL (o volume total é de 1 mL).
  8. Carregue esses tubos em um rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C.
  9. Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [LDL (d=1,04 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação. Meça o volume e faça o total de 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,04 g/mL).
  10. Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,06 g/mL adicionando 106,7 μL de solução d=1,21 g/mL e 93,3 μL de solução d=1,06 g/mL (o volume total é de 1 mL).
  11. Carregue esses tubos em um rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C.
  12. Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [LDL (d=1,06 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação. Meça o volume e faça o total de 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,06 g/mL).
  13. Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,08 g/mL adicionando 123,1 μL de solução d=1,21 g/mL e 76,9 μL de solução d=1,08 g/mL (o volume total é de 1 mL).
  14. Carregue esses tubos em um rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C.
  15. Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [HDL2 (d=1,08 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação. Meça o volume e faça o total de 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,08 g/mL).
  16. Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,10 g/mL adicionando 145,5 μL de solução d=1,21 g/mL e 54,5 μL de solução d=1,10 g/mL (o volume total é de 1 mL).
  17. Carregue esses tubos em um rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C.
  18. Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [HDL2 (d=1,10 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação. Meça o volume e faça o total de 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,10 g/mL).
  19. Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,21 g/mL adicionando 0,140 g de brometo de potássio (KBr) em pó e dissolvendo-o completamente. Meça o volume e faça-os a 1 mL adicionando a solução d=1,21 g/mL.
  20. Carregue estes tubos em rotor de ângulo fixo e centrífuga a 513.000 x g por 4 h a 4 °C.
    NOTA: Para o rotor Beckman TLA 120.2, 513.000 x g (Av RCF) corresponde a 120.000 rpm.
  21. Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [HDL3 (d=1,21 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Este é o último passo para a ultracentrifugação.

3. Diálise

NOTA: Como as frações de densidade (exceto fração d<1,006 g/mL) contêm altas concentrações de KBr, é necessário removê-las por diálise.

  1. Transfira as frações de densidade para uma tubulação de diálise e corte ambas as extremidades com fechamentos.
  2. Dialisar contra 2 L de tampão de diálise como PBS/ 1 mM EDTA por 6h a 4 °C com agitação usando um agitador magnético.
  3. Substitua por novo buffer e volte a dilisar por mais 6h a 4 °C.
  4. Colete as frações de densidade e meça o volume. Ajuste todas as frações de densidade para o mesmo volume (por exemplo, 250 μL).
    NOTA: Você pode calcular o fator concentrado a partir de 1 mL de plasma original (por exemplo, 250 μL de fração de densidade corresponde a quatro vezes concentração).

4. Análise de lipoproteínas

NOTA: Após a diálise, essas lipoproteínas estão prontas para diferentes análises. As lipoproteínas podem ser avaliadas medindo lipídios ou apolipoproteínas ou ambos. Para medir conteúdos lipídicos como colesterol total (TC), triglicerídeos (TG), fosfolipídios (PL) e colesterol livre (FC) em cada fração, utilizamos kits de ensaios coloridos enzimáticos comerciais. Para análise de apolipoproteínas, utilizamos SDS-PAGE visualizado com coloração CBB ou mancha ocidental.

  1. Análise lipídica
    NOTA: Lipídios como TC, TG, PL e FC na fração de lipoproteína podem ser medidos usando kits de medição disponíveis comercialmente. Os procedimentos dependem dos reagentes utilizados, então siga as instruções de cada kit utilizado. Aqui mostramos um típico ensaio de microplacão usando um kit de ensaio enzimático comercial.
    1. Aplique 8 μL de amostra de lipoproteína e substância de calibração padrão em microplacão de 96 poços.
    2. Adicione 240 μL de reagente de ensaio e misture por pipetação.
    3. Incubar a 37 °C por 10 min.
    4. Meça o OD com um leitor de microplatos e calcule as concentrações lipídicas.
  2. Análise de apolipoproteína
    1. Manchas de SDS-PAGE e CBB
      1. Preparação da amostra: Adicione 10 μL de 2x Tampão de amostra a 10 μL de fração de lipoproteína. Aqueça a mistura a 80 °C por 5 minutos usando um bloco de calor seco.
      2. Prepare gel de poliacrilamida SDS-poliacrilamida de 4-20% gradiente e configure o gel na câmara de eletroforese cheia de tampão em execução.
      3. Carregar a amostra de lipoproteína (10 μL/lane) e os padrões proteicos (5 μL/pista) no gel de empilhamento.
        NOTA: Se as amostras estiverem duas vezes concentradas, uma quantidade equivalente de plasma de 20 μL será analisada por faixa.]
      4. Execute a eletroforese a 20-40 mA corrente constante.
      5. Coloração CBB: Mergulhe o gel duas vezes na solução de fixação com agitação suave por 10 minutos. Manche o gel com solução de coloração CBB por 30 minutos. Enxágüe o gel em água destilada para remover o excesso de mancha. O gel está pronto para fotografar.
    2. Mancha ocidental
      1. Realize eletroforese no mesmo procedimento descrito acima.
        NOTA: O volume de lipoproteínas carregadas para a mancha ocidental é menor do que para a mancha CBB descrita acima (por exemplo, 1-5 μL).
      2. Coloque a membrana gel e PVDF entre o papel filtro encharcado de buffer e o bloco de formulários. Coloque o sanduíche em um de suporte e coloque em um tanque cheio de tampão de transferência.
      3. Realize eletroblotting a 100 mA corrente constante por 3 h a 4 °C.
      4. Bloqueio: Incubar a membrana no tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
      5. Reação ab primária: Incubar as membranas no abs primário diluído com tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C com leve agitação.
        NOTA: A diluição ab primária sugerida é mostrada na Tabela de Materiais. Três tipos de Abs primário contra apolipoproteínas podem ser usados de forma cansa ou em coquetéis.
      6. Lave a membrana três vezes na lavagem do tampão com agitação, 5 minutos por lavagem.
      7. Reação ab secundária: Incubar a membrana no Abs secundário diluída com tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente com agitação.
        NOTA: A diluição ab secundária sugerida é mostrada na Tabela de Materiais.
      8. Lave a membrana três vezes na lavagem do tampão com agitação, 5 minutos por lavagem.
      9. Detecção de ECL: Coloque a membrana em um plástico. Adicione reagentes de detecção de ECL e incubar por 1 min. Escorra o excesso de líquido e sele a membrana em um saco.
      10. Visualize os sinais usando um analisador de imagens.

Resultados

Usando este protocolo, isolamos lipoproteínas de coelho usando 1 mL de plasma e obtivemos sete frações de densidade. Frações de densidade isolada são suficientes para medir lipídios e apolipoproteínas, como descrito acima para a maioria dos propósitos de pesquisa. O mesmo procedimento também pode ser usado para isolar lipoproteínas plasmáticas de espécies humanas e outras. Para animais de pequeno porte, como ratos, é necessário plasma agrupado. A Figura 3 mostra perfis de lipo...

Discussão

A hiperlipidemia é um dos fatores de risco mais importantes da doença aterosclerótica. Assim, a análise de lipoproteínas plasmáticas não é apenas essencial para o diagnóstico de pacientes com dislipidemia, mas também importante para a investigação de mecanismos moleculares de metabolismo de lipoproteína e aterosclerose. Neste estudo, descrevemos o protocolo de isolamento e análise de lipoproteínas plasmáticas que podem ser aplicadas nos laboratórios onde a ultracentrifugação está disponível. As infor...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa de pesquisa do JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, a National Natural Science Foundation of China (nº 81941001 e 81770457), JSPS-CAS sob o Programa Cooperativo de Pesquisa Japão-China.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
22-gauge needleTerumoNN-2232SFor blood collection
96-well microplategreiner bio-one655101For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibodyLifeSpan BioSciencesLS-C314186For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibodyROCKLAND600-101-111For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibodyMerck MilliporeAB947For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kitFUJIFILM Wako Pure Chemical299-50101For apolipoprotein analysis
CentrifugeHITACHIhimac CF15RN
ClosureSpectrum132736For lipoprotein dialysis
Dialysis tubingFUJIFILM Wako Pure Chemical043-30921For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat blockMajor ScienceMD-01NFor SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagentsGE HealthcareRPN2209For Western blotting
Electrophoresis ChamberBIO-RADMini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrateFUJIFILM Wako Pure Chemical345-01865For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paperADVANTEC590For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotorBECKMAN COULTER357656TLA-120.2
Fixing solutionFor SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbraneBIO-RAD1620177For Western blotting
Lumino image analyzerGE HealthcareFor Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrerADVANTECSR-304For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARKBIO-RADFor lipids measurment
MicrotubeINA-OPTIKASC-0150
Orbital agitator USBDboStovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibodyJackson ImmunoResearch705-035-003For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibodyJackson ImmunoResearch715-035-150For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical433-36201For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge TubesBECKMAN COULTER343778
Potassium BromideFUJIFILM Wako Pure Chemical168-03475For density solution
Power SupplyBIO-RADFor SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual XtraBIO-RAD161-0377For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainerNatsume SeisakushoKN-318For blood collection
RotorHITACHIT15A43
SDS-PAGE running buffer25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x)0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powderFUJIFILM Wako Pure Chemical190-12865For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical439-17501For lipids measurment
Triglyicerides assay kitFUJIFILM Wako Pure Chemical432-40201For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tubeBECKMAN COULTER347960For lipoprotein isolation
Tween 20SIGMA-ALDRICHP1379For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
UltracentrifugeBECKMAN COULTERA95761Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer systemBIO-RADMini Trans-Blot Cell

Referências

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