プリンデキストラン硫酸ナトリウムによる大腸炎モデルにおける腸内炎症の系統的採点解析

要約

無料のコンピュータ支援システムを用いた腸内炎症の系統的採点は、潰瘍および炎症性変化の存在を特徴とする大腸炎モデルにおける組織病理学的変化を定量的に比較する強力なツールである。組織学的大腸炎スコア評価は臨床観察を強化し、データ解釈を促進する。

要約

マウス大腸炎モデルは、炎症性腸疾患の病態生物学を理解することに焦点を当てた研究で広く採用されているツールです。.しかし、疾患重症度の客観的かつ再現可能な定量化のための堅牢な基準は、依然として定義されている。大腸炎分析法の多くは、腸管の小さなセグメントの限られた組織学的スコアリングに依存し、部分的または偏った分析につながる。ここでは、大腸全体の高解像度画像取得と縦断分析を組み合わせて、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発型マウス大腸炎の腸内損傷および潰瘍を定量化する。このプロトコルは、広範なユーザーの訓練なしで客観的で再現可能な結果の生成を可能にします。ここでは、DSS誘導大腸炎のデータ例を用いて、サンプル調製と画像解析に関する包括的な詳細を提供します。この方法は、粘膜損傷に関連する重大な炎症を有するマウス大腸炎の他のモデルに容易に適応することができる。我々は、結腸の全長に対する炎症/負傷および浸食/潰瘍化された粘膜の割合が、DSS誘発疾患の進行の中での体重減少などの臨床所見と密接に類似していることを示す。この組織学的プロトコルは、DSS大腸炎実験において、疾患活動の分析を公平に標準化するための、信頼できる時間と費用対効果の高い援助を提供します。

概要

消化管上皮バリアは、下層の組織区画1から発光抗原および病原体を分離する上で極めて重要な^役割を果たす。炎症性腸疾患(IBD)、虚血、または外科的傷害などの病理学的状態で見られる上皮損傷および粘膜創傷は、下痢、体重減少、便中の血液、および腹痛を含む臨床症状に関連している。傷害に対して、上皮細胞は粘膜バリア欠陥を再上皮化および修復するために移動し、増殖する。炎症の解決と粘膜完全性の払戻は、腸粘膜恒常性および機能^2、3、4を再確立するために極めて重要である。

腸上皮バリアの損傷に関連する基礎的な分子メカニズムを研究するために、様々な動物モデルが採用されています。化学的に誘発された大腸炎の確立された、容易に適用可能なモデルは、特にIBDのような炎症性傷害に関連する研究において広く使用されている。一般的な、再現性、信頼性の高いマウス大腸炎モデルは、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)媒介大腸損傷および炎症を採用しています。疾患の重症度は、マウス株、DSSの用量、DSS投与の長さ、およびDSS^5、6、7の分子量によって異なる。

DSS大腸炎中の腸粘膜損傷は、通常、体重減少、便血量、および便の一貫性によって決定される複合スコアである疾患活性指数(DAI)を用いて評価される。便の血液量は、微視的(便グアイアック酸試験を使用して検出)または巨視的であり得る。便の一貫性は、硬、軟、または液体(すなわち、下痢^)5、8に分類される。これらの臨床パラメータのスコア付けは主観的であり、ユーザーの経験やバイアスによって異なる可能性がありますが、全体的にはデータが信頼できる情報を提供し、IBDの研究者によって広く使用されています。対照的に、粘膜損傷の組織学的評価のための一般的に受け入れられている方法はない。最も一般的には、結腸の選択された領域は、訓練を受けた病理学者によって検査され、通常、脊髄損傷および白血球浸潤^9、10、11を含むいくつかのパラメータに基づいて採点される。しかし、調査対象のパラメータの数と分析した組織の量は個々の報告によってかなり異なるため、多くの公表された研究の比較可能性は限られている。観察者の偏見を減らし、研究間のコンコーダンスを強化するために、理想的な組織学的スコアリングプロトコルは、腸粘膜の炎症が最も頻繁に可変であり、スキップ病変が一般的であるため、結腸の全長を含むべきである、2)特定のキーに限定分析し、主観性を低下させるために容易に解釈可能なパラメータ、3)多数のサンプルの高速で一貫した処理を容易にし、4)広く利用可能で手頃な価格のツールを使用してデータを取得し、4)広く利用可能で手頃な価格のツールを使用する。

ここでは、小腸の結腸全体または長いセグメントを「スイスロール」構成で処理する技術と、DSS誘発性大腸炎による腸粘膜炎症および損傷を分析するための無料のコンピュータ支援スコアリングシステムの使用について説明する。

プロトコル

記述されたすべての動物実験は、ミシガン大学動物の使用とケアに関する委員会によって承認されました。

1. 組織収穫

1. イオブルラン麻酔を使用してマウスをヒューマニゼーズし、その後に子宮頸部脱臼を承認されたプロトコルに従って安楽死させる。すべての動物実験について、動物の取り扱いに関する国内および制度上のガイドラインに従って、認定審査委員会によって承認が得られました。
2. 解剖パッドの上にマウスを置きます。20 G x 1 1/2 インチ G 針を使用してマウスの四肢を固定化します。
3. 鉗子とはさみを使用して、腹部の皮膚に小さな切開を行い、腹膜を露出させるために側面に引っ張ります。
4. 腹骨から腹部の側面に正中切開で腹腔を開きます.
5. 大腸が可視化されるまで、組織や臓器を慎重に除去します。大腸の両側の骨盤骨を切って臓器を完全に視覚化し、アヌスから盲腸に向かって伸びる。
6. 結腸に付着した脂肪、小さな静脈、動脈を穏やかに取り除き、臓器を慎重に解剖し、肛門に近位に切り、盲腸に遠位します。
   注意:スイスロールの手順を完了している間、解剖されたコロンは室温のままでなければなりません。
7. 1x PBSで結腸を慎重に洗い流し、アヌスを通して挿入された柔軟なプラスチック製のガバジ針を使用して、便内容を取り除きます。
8. 結腸を直線に配置し、腸間膜動脈に沿って縦方向に開きます。遠位から近位端まで縦方向に結腸を二分する(図1A)。組織の半分は組織学的分析に使用することができ、他方はウェスタンブロット、PCR、または新鮮な凍結免疫蛍光顕微鏡¹²のために第2のスイスロールにロール加工することができる。

2. スイスロールの準備

1. カミソリの刃を使用して近位結腸から余分な組織をトリミングし、結腸全体の長さに沿ってほぼ同じ幅が得られるまで。
2. 結腸を合わせて内腔を上に露出させ、柔軟なギャージ針を使用して組織を完全に平らにします。必要に応じてPBSを追加し、手順全体を通して組織を湿らせた状態に保ちます。
3. 紙拭きで余分なPBSを取り除きます。注射器とガベージ針で、組織を固定して平らにするために2〜3分間組織の上に10%中性緩衝ホルマリン溶液を加えます。
4. ストレート鉗子を使用して遠位コロンの端をつかみ、遠位から近位端までコロンを同心円にねじります(図1B)。
   注:ティッシュがロールの中にあることを確認するために人差し指を使用して転がっている間、スイスのロールの内側を押し戻す可能性があります。
5. 27G針を挿入して、スイスのロール形状を保持するためにコロンを中央に固定します(図1C)。
6. 針でスイスロールを組織学的標本容器の中に埋め込むカセットに入れます。
   メモ:組織は固定する前にカセットに対して平行に向けていなければなりません(図1D)。
7. 4 °C¹³で一晩10%中性緩衝ホルマリン溶液で組織を固定する。
8. 一晩固定した後、PBSで組織3xを洗浄する。
9. パラフィン埋め込みプロセスの前に、組織に70%エタノールを加えます。先に進む前に、スイスロールから針を取り外してください。組織は、パラフィン埋め込み¹³まで室温でエタノールに保存することができる。
10. サンプルを組織プロセッサに入れ、パラフィンに埋め込み、正に荷電した顕微鏡スライドに取り付けられた4μmのセクションを準備する(図1E)。これは、オプションの停止点にすることができます。
    注: 画像解析に適したセクションを作成するには、適切な組織の向きが重要です。パラフィンカセットに並列スイスロールを埋め込むと、画像解析に適した完全なセクションが得られます(図1F-1H)。不完全なセクションを防ぐために斜めセクションを避ける必要があります (図 1I-1K)。詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください。
11. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)13を有するステインセクション。

3. デジタルスキャンと分析

注: 粘膜の変化を正確に評価するには、コロン全体の長さの 90% 以上を含むセクションのみを選択してください。

1. スライド スキャナーまたはイメージャーを使用して、スキャンのスキャンのセクション ( 資料の表を参照)。生成された画像は、40倍の目的と40倍の倍率でピクセルあたり0.25ミクロンの解像度を必要とします。
2. スキャンしたスライドのデジタル分析に適したソフトウェアをインストールしてダウンロードします ( 資料一覧を参照)。
3. スキャンした画像を画像処理ソフトウェアで開く (図 2A)。コロン全体が表示され、サンプルの欠落領域がないことを確認します。
4. ラベル イメージャーとスケール バー ツールをアクティブにして、[ラベル イメージャー ] (図 2A)をクリックしてスキャンしたスライドを適切に識別します。
5. [アノテーション] ( ( 図2A) をクリックしてアノテーション ツールを開き、[新規レイヤー ] をクリックして 3 つの異なるレイヤーを作成します (図 2B) をクリックして、スイス ロールの全長、炎症/損傷、および浸食/潰瘍を定量化します。[レイヤーの色] (図 2B) をクリックして、レイヤーごとに異なる色を選択します。
6. 筋肉筋粘膜を参照して、ペンツール(図2A)をクリックして、各層/カテゴリの長さを測定します。
   1. 400 μm ズーム(またはそれ以上)で画像を見て、筋肉筋粘膜を適切に可視化します。
      注:拡大はマウスのスクロールホイールを使用して簡単に制御でき、すべての線を描画するためにセクションを横切って移動しながら、必要に応じて調整する必要があります。
   2. ペンツールをクリックして、筋肉筋粘膜に続く線を描きます(図2A)。必要に応じてポインタを移動し、解析用に隣接する領域を視覚化します。
      注: ペンが停止するたびに、小さなレイヤー領域が生成されます。[レイヤー領域] タブで視覚化および編集できます (目的のセグメントを選択し、間違いや修正の場合は[レイヤーの削除] をクリックします(図 2B)。
7. すべてのレイヤー (図 2C)を定義したら、レイヤー領域オプション内の「グリッドをテキストファイルにエクスポート」ボタンを使用してデータをエクスポートします (図 2B)。
   注: データが適切に保存されるように、レイヤーを作成する際にファイルを頻繁に保存します。
8. テキスト ファイルを開き、スプレッドシート ソフトウェアでデータをコピーします。各領域のすべてのセグメントを合計し、全長に対する傷害および潰瘍の割合を計算します。
9. 組織学的大腸炎スコア(HCS)を計算し、疾患の重症度を評価するために、以下に詳述する3つの主な特徴を考慮する。
   1. 陰窩・明節軸に組織化された上皮細胞、免疫細胞の少ない層状子、および粘膜と粘膜下層と界在する下ジャセント筋粘膜を特徴とする健康な腸粘膜を確認する(図3A)。
   2. 上皮細胞が減少または部分的に欠けている上皮性陰窩および陰窩への好中球浸潤による粘膜炎症を特徴とする炎症/傷害をチェックする(図3B)。
   3. 表皮上皮を欠いた領域または関連する白血球の有無にかかわらず上皮窩窩を完全に欠いている領域によって特徴付けられる浸食/潰瘍の存在を確認してください(図3C)。
10. 次の式で全長に対する割合で表される、負傷領域と潰瘍化領域の HCS を計算します。
    
    注:HCSは、上皮の完全な損失が障壁の完全性の最大の損失をもたらし、したがって、より悪い病気をもたらすという合理的な仮定に基づいて、後者に2の要因を追加する炎症/傷害および浸食/潰瘍の割合を組み合わせた。HCSは、DSS誘発実験大腸炎によって引き起こされる形態学的変化を一貫して表す。興味深いことに、DSS大腸炎における大腸リンパ節集合体または卵胞の数と臨床疾患の重症度との間に明確な相関関係が見られなかったため、この分析には定量化は含まれなかった。
11. 代表的なイメージのスナップショットを取得し([スナップショット] をクリックして図 2A)し、保存します。必要に応じて[尺度バーの表示/非表示]をクリックして、尺度バーを含めます (図 2A)。

結果

DSSチャレンジ後の粘膜損傷とその後の大腸炎からの回復の文脈におけるこの組織学的大腸炎スコア分析の信頼性を説明するために、我々は8つの10週齢の雄C57BL6野生型マウスの飲料水中に2.5%のDSSを5日間投与し、その後5日間の規則的な水で回復期間を行った。DSSの急性投与中に体重に変化はなく、0日目から5日目(図4A)まで。体重は、マウスが通常?...

ディスカッション

私たちの組織学的大腸炎スコアシステムは、腸の組織の炎症や損傷を定量化するための信頼性の高いツールを構成します。このアプローチは、小さな領域や不完全なセクションを選択するバイアスなしで、器官全体の組織病理学的状態の理解を改善します。このプロトコルを正常に実行するための重要なステップの中には、コロンの長さの少なくとも90%の分析を可能にするスイスロールの適?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning	Leica Biosystems	Aperio AT2
Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier	VWR International	56616-032
American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg	GT Midwest	TL5837
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles	Fisher scientific	14-823-2A
Bonn Strabismus Scissors - ToughCut	Fine Science tools	11103-09
Bonn Strabismus Scissors - ToughCut	Fine Science tools	14084-09
Dumont #5 Forceps	Fine Science tools	11251-20
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501640-19L
HistoPrep 70% Ea	Fisherbran	70% denatured ethyl alcohol
ImageScope	Aperio	Version 12.3.3.5039	http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/
LeakBuster Specimen Containers: Sterile	Starplex Scientific	B120210
Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium	Corning	21-040-CV
Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm	Instech	FTP2030
PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in	BD (Becton, Dickinson and Company)	305176
PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in	BD (Becton, Dickinson and Company)	305109
Syringe, 10 ml	BD (Becton, Dickinson and Company)	302995
Unisette Tissue Cassettes	Simport	M505-2