粒子テンプレート化乳化により、マイクロ流体フリーのドロップレットアッセイが可能

要約

油中水滴アッセイは、分析化学、酵素進化、単一細胞分析に有用であるが、通常は液滴を形成するためにマイクロ流体が必要である。ここでは、液滴アッセイを行うマイクロ流体フリーアプローチである粒子鋳型乳化について述べている。

要約

単分散液滴で行われる反応は、一括で行われる同等のものと比較して、精度と感度が向上します。しかし、制御された液滴を形成するためのマイクロ流体の要件は、非専門家に障壁を課し、その使用を制限する。ここでは、微粒子を鋳型乳化、マイクロ流体を使用しない単分散液滴を生成するアプローチについて述べている。水ゲル球をテンプレート化して、単純な渦によって単分散液滴にサンプルをカプセル化する。マイクロ流体フリーのデジタルPCRを行う手法を用いて実証します。

概要

液滴マイクロ流体は、ピコリットル液滴の区画化を利用して、バルク反応と比較してアッセイの感度と精度を高め、化学スクリーニング、タンパク質工学、次世代シーケンシング^1,2,3に数多くの用途を持っています。例えば、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(ddPCR)は、がんの遺伝的変異、変異を引き起こす疾患の検出、および出生前診断の応用により、バルク定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)と比較して精度が^{向上します。}しかし、液滴マイクロ流体の課題は、サンプルを分割するためのマイクロ流体デバイスの要件です。マイクロ流体は液滴特性を優れた制御を可能にする一方で、構築および操作に専門的な専門知識を必要^{とします7,8}.その結果、液滴ベースの方法は、主に専門家のラボに限定されるか、まれに市販の機器が利用可能なアプリケーション^9,10に限定されます。液滴アッセイの使用を広げるためには、特殊なマイクロ流体機器の要件は克服しなければならないハードルです。

本稿では、単分散液滴で反応を行うマイクロ流体フリー法である粒子テンプレート乳化(PTE)について述べた。PTEでは、単純な渦によってサンプルをキャリアオイル中の液滴に巻き込む粒子(図1)。システムが混合するにつれて、水性部分断片は、液滴が単一粒子を含むまで小さくなるサイズの小滴に、その時点で粒子を破壊する必要があるため、さらに断片化は不可能である。巻き込まれたサンプルは、粒子を液滴の中のシェルとして囲み、それによって分散した細胞、試薬、または機能部分を封入する(図1D)。したがって、PTEは、共通のボルテクサーを超えて液滴反応を行う装置や専門知識を必要としません。さらに、液滴の生成はマイクロ流体で分または時間に比べて数秒かかり、生成される量は、デバイスの操作時間ではなく、コンテナの体積に比例し、最高にスケーラブルになります。これらの利点は、マイクロ流体が実用的でない様々な状況で液滴アッセイを実施するためのPTEを理想的にします。ここでは、PTE をデモンストレーションし、それを使用して ddPCR を実施します。

図 1.粒子テンプレート化乳化プロセスの概要。 (A)テンプレート粒子を試薬と混合する。(B)過剰試薬は遠心分離後に除去される。(C)鋳物分子の添加は、油を添加する前に起こる。(D) 渦は単一の鋳片分子を含む液滴を生成する。(E) その後の熱サイクルおよびイメージングにより、ターゲットテンプレートのデジタル液滴分析が可能になります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1. 粒子テンプレート化乳化のためのヒドロゲル粒子の調製。

粒子テンプレート化乳化に用いるヒドロゲル粒子は、2つの異なる方法を用いて調製することができる。

1. 市販の粒子を用いた調製
   1. PTEと互換性のある乾燥ポリアクリルアミド粒子(例えば、バイオゲルP-60ゲル(バイオ・ラッド)、直径45~90μm)を50mL円錐チューブに30mLの無菌水に加え、よく混ぜます。室温で30分間インキュベートします。
2. 微粒子のマイクロ流体製造を用いた調製
   注:PTEと互換性のあるポリアクリルアミド粒子は、市販のドロップメーカー(例えば、QX200ドロップ発生器(バイオ・ラッド)、レイドロップ(フルージェント)など)、またはカスタムマイクロ流体設計を使用して調製することができます。
   1. カスタムマスターの製作
      1. コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、柔らかいフォトリソグラフィマスクを設計します。基板フィルムに10μmの解像度でフォトマスクを印刷します。
      2. シリコンウエハーの3の中心にフォトレジストの1 mLを注ぎます。スピンコーターを使用して、500 rpmで30秒間回転させ、その後30秒間1250 rpmで回転させることで、フォトレジストの50 μm層を作成します。ウエハーをホットプレートに置き、95°Cに設定して15分間置き、溶剤を蒸発させます。
      3. カバーガラススライドでシリコンウエハにフォトマスクを固定し、コリメートされた190 mW、365 μm UV LEDの下でウエハーを2.5分間露出させます。ウエハーをホットプレートに置き、95°Cに設定して5分間、露光後焼成します。
      4. フォトレジストシリコンウエハーを100%プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(PGMEA)の浴中に15分間浸漬して開発します。新鮮な100%PGMEAでウエハーをリンスし、その後100%イソプロパノールを続けてください。空気はウエハーを乾燥させる。
      5. 95°Cに設定したホットプレートでウエハを1分間乾燥させて、残留イソプロパノールを取り除きます。ペトリ皿の清潔な3にウエハースを置きます。
   2. カスタムマイクロ流体デバイスの製造
      1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)シリコンベースと硬化試薬を10:1の割合で質量で混合します。空気泡が観察されなくなるまで、ハウス真空下でデシケータを使用して混合PDMSを脱気する。
      2. シャーレのマスターの上に脱気PDMSを注ぎ、シリコンウエハーが完全に水没していることを確認します。シリコンウエハとPDMSを脱気し、注ぎ込み中に形成された気泡を除去する。
      3. シリコンウエハとPDMSを65°Cにセットしたオーブンに60分以上入れることで、PDMSを硬化します。メスを使用してシャーレからマイクロ流体特徴を含むPDMSのブロックを物品化する。シリコンマスターに存在する機能を損なわないように、細心の注意を払ってください。
      4. 0.75 mm のバイオプシー パンチを使用して、マイクロ流体デバイスの入口と出口に対応する PDMS ブロックに入口と出口をパンチします。PDMSブロックの表面への包装テープの除去を繰り返し塗布し、除去して、ほこりや微粒子を除去します。
      5. 50mm x 75 mmガラススライドを100%イソプロパノールで洗浄し、その後空気で表面を乾燥させます。プラズマは、プラズマボンダを使用して1分間の_O2 プラズマの1 mbarを使用して、ガラススライドとPDMS(上向きの特徴)の両方を処理します。
      6. ガラススライド上に下向きの特徴を備えたプラズマ処理されたPDMSを置くことによって、PDMSをガラススライドに貼り付け、プラズマ処理された側面を上に向けて処理する。スライドを65°Cに設定したオーブンに30分以上入れ、ボンディングを完了します。
      7. フッ素化表面処理でマイクロ流体チャネルをすべて処理し、表面の疎水性を確保し、濡れ防止を行います。65°Cで10分以上焼きます。
   3. テンプレート粒子の製作
      1. 6.2%のアクリルアミド、0.18%N、N'-メチレンビス(アクリルアミド)、および0.3%の過硫酸アンモニウムからなるポリアクリルアミド(PAA)溶液を調製します。この溶液を28G針で1mLの注射器に入れる。
      2. 5%(w/w)フルオロサーファクタントと1%N、N、NN-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)からなる不溶性連続相をハイドロフルオロエーテル(HFE)油中に調製し、液滴の生成と安定化を行います。新しい1 mLシリンジに溶液をロードします。
      3. 注射器を含むPAAとHFE溶液の両方をシリンジポンプにロードします(例えば、NE-501)。両方のシリンジをマイクロ流体デバイスに接続するには、シリンジに挿入されたポリエチレンチューブを使用してデバイスに接続します。接続する前に、ポンプをプライムしてチューブから空気を取り除く。
         注:モデルによっては、インプット、製造ソフトウェア、またはカスタムスクリプト(https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program で利用可能)でシリンジポンプを制御することができます。
      4. PAAおよびHFEオイル入力をそれぞれ300 μL/hおよび500 μL/hでドロップ生成装置を実行します。15 mLの回収チューブに液滴1mLを回収し、重合のために室温で3時間インキュベートします。インキュベーション後、ピペット処理により下層の油を除去する。
      5. HFEオイルに20%(v/v)パーフルオロ-1オクタノール(PFO)の1 mLを化学デマルシファーとして15 mL回収管に加えます。混合後、2000 x g で 15 mL のコレクションチューブを 2 分間回転させます。ピペット処理でPFO/HFE上清を取り外します。1x を繰り返します。
      6. 2%ソルビタンモノオレネートの2 mLをヘキサンに加えて、15 mLのコレクションチューブと渦を混ぜます。3000 x g でチューブを 3 分間回転させます。界面活性剤/ヘキサン溶液を除去するためにピペット処理することにより上清を除去します。2x を繰り返します。
      7. TEBSTバッファー(20 mMトリス-HCl pH 8.0、274 mM NaCl、5.4 mM KCl、20 mM EDTA、0.2%トリトンX-100)を5 mL加え、よく混ぜます。3,000 x g で 3 分間スピンダウンします。上清をピペットで取り除く。3x を繰り返します。
      8. 5 mL TEBST で再中断します。この溶液は、4°Cで無期限に保存することができる。

2.粒子テンプレート乳化。

粒子のテンプレート化の調製に続いて、PTEは、液滴中のサンプルおよび試薬をカプセル化するために使用される。

1. 粒子をペレットに6000 x g で遠心して粒子を鋳造した乳化用のポリアクリルアミド粒子を調製し、その後、ピペット処理により上清を除去し、滅菌水を使用して再懸濁液を行う。残りの TEBST を確実に除去するために 3x を繰り返します。
2. ヘモサイトメーター(または同等)を使用して、テンプレート粒子の濃度と直径を決定します。直径をピクセル単位で測定し、ミクロンに変換することで、個々の粒子径を計算します。ピクセルからミクロンへの変換は、測光スライドとしてヘモサイトメーター(または同等)を用いて計算し、既知のグリッド距離をピクセル単位で測定することができる。
3. PCRマスターミックスを用いて1.5mLマイクロ遠心分離管に分散相を調製し、適当なプライマー、およびフルオレセイン加水分解プローブを 表1に記載する。穏やかな攪拌(10 rpm)下で室温で5分間インキュベートし、チューブ回転器を使用して、成分の均質な分布を確保します。
   注: パーティクルの体積とターゲットの濃度は、ポアソンの負荷に基づいています。一般的に、パーティクルの数は、カプセル化するサンプルの数よりも桁違いにする必要があります。未知の濃度のサンプルの場合、ポアソンの負荷を確実にするために希釈シリーズが必要です。

容積	試薬
100 μL	粒子(450粒子/μL)
200 μL	2x PCR マスターミックス
18 μL	10 μMフォワードプライマー
18 μL	10 μM リバースプライマー
18 μL	10 μM プローブ
0.8 μL	トリトンX100
45.2 μL	ヌクレアーゼフリーウォーター

表 1.PTEと共に使用するPCRマスターミックスの調製

4. 6000 x g で分散相を 1 分間遠心し、上清を除去します。抽出した上清の体積を記録し、 2.3 で計算した分散相総体積を用いてペレット体積を決定する。
   注:抽出される上清の量は、粒子のパッキング、直径、および最小予想体積300 μLの濃度によって異なります。
5. 1.62 pg /μL サッカロミセスセレビシエ ゲノムDNAを2.4からペレットに1 μL加え、ピペットまたは活発なタッピングで十分に混合します。
   注: 過剰な水性コンテンツが存在すると、カプセル化の効率が低下する可能性があります。サンプル量がペレット体積の1%を超える場合は、サンプルを濃縮します。サンプルを濃縮できない場合は、サンプル量に応じて PCR マスターミックスと結果ペレットの量をスケールします。PTEは、小さな(10 μL)から大きい(2 mL)の粒子の乳化を可能にします。PCRマスターミックス(2.3)とオイル(2.6)は、それぞれ粒子ペレットの目標(2.3)および測定(2.4)体積に応じてスケーリングすることができる。
6. 200 μL 2% HFE油中のフルオロサーファクタントを、乳化のための不溶な連続相としてチューブに加えます。ピペットまたはチューブをタップ/フリックしてペレットが外れていることを確認します。その後、3000rpmで30秒間渦を起用する。
   注:3000 rpm に対応する設定は、ブランドやモデルによって異なります。
7. エマルジョンが1分間落ち着くようにします。底部油相の100 μLを取り除き、HFEオイルのフレッシュ2%フルオロサーファクタントに交換してください。チューブを数回軽く反転して混ぜます。3~5倍、または小さな衛星液滴が取り除かれるまで繰り返します。

3. デジタル液滴 PCR および分析。

1. 沈降の2〜5分後、底部の油相を取り除きます。この容量をフルオロカーボン油中の5%のフルオロサーファクタント(例えばFC-40)に交換してください。
2. 広いボアピペットチップを使用して、100 μLのサンプルを200 μLのPCRチューブに慎重にピペットします。PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、 表2に従って実行します。

歩	温度	期間	筆記
1	95°C	2分
2	95°C	30 s
3	50°C	90 s
4	72°C	60 s
5			x34 の手順 2 ~ 4 を繰り返します。
6	72°C	2分
7	4°C	持つ

表 2.PTEエマルジョンを用いたデジタル液滴PCRの熱サイクル条件

3. 蛍光イメージング用の広いボアピペットチップを使用して、サンプルを計数スライドにピペットします。490 nm励起および525 nmの発光検出波長を有する蛍光顕微鏡を使用してサンプルを画像化する。
4. 正の蛍光滴(_Np)と総滴(_NT)を定量化して存在を確認し、正の液滴(_Np/_NT)とポアソン統計量の割合を使用してテンプレート分子(λ)の数を計算します。
   
5. 95% 信頼区間 (_zc = 1.96) を計算するには、次の手順を実行します。
   
6. 以下に示す式を使用して、ステップ 2.5で添加したサンプルの体積(μLでν)を用いて、サンプル濃度(分子/μL)を計算します。技術的な反復を使用して、サンプル濃度の平均と標準偏差を決定します。
   

結果

図 2.粒子鋳液化乳化を用いた液滴へのサンプルのカプセル化。 (A)粒子のテンプレート化乳化に用いられる粒子をテンプレート化する。(B)遠心後の上清から粒状の粒を凝光する分離。(C)粒子テンプレート化(D)識別可能な水性シェルを用いた乳化に起因する液滴。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

PTEでは、エマルジョンの単分散性は、粒子よりもわずかに大きい直径を有するので、粒子のテンプレート化によって決められる。したがって、均一な粒子は、制御PTEカプセル化¹¹に中心となる。化学(ゾルゲル、乳化重合)、流体力学的(膜乳化、均質化)、濾過法など、均一なテンプレート粒子を生成するための様々な方法が存在します。特にマイクロ流体アプローチは、優れた単分散性(図2A)を提供し、^PTE12の機能性を高めるために追加の粒子工学を可能にします。あるいは、テンプレート粒子は、それらの均一性が、適切であるが、典型的にはマイクロ流体生成¹¹よりも少ないが、購入することができる。

PTEを行うために、粒子は、カプセル化されるサンプル(図1A)と混合され、過剰な上清が遠心分離およびピペット化によって除去される(図1B)、PCRチューブの底部にある粒子ペレットの写真で示されるように(図2B)。次いで安定化界面活性剤を含む封入油を加え(図1C)、30秒間ボルテックスする前に試料を静かに配管し(図1D)、エマルジョンを生成する(図2C)。得られた液滴は、初期サンプルを含む粒子コアおよび水性シェルを含み、その中に試薬、標的分子、および反応に必要な細胞を含む(図2D)。液滴マイクロ流体カプセル化と同様に、小さなビーズや細胞のような離散体は、PTE物理学の性質のために、ほぼすべての液滴にテンプレート粒子が含まれているが、ポアソン分布に従ってランダムにカプセル化される。

図 3.粒子鋳液化乳化液滴の同定とクリーンアップ。 (A)不十分な渦から1滴当たり複数の粒子を伴う不均一な液滴生成の例。(B)粒子鋳液化乳化および(C)油中水分画に続く衛星および液滴の存在が予想される。(D)油洗浄後にエマルジョンを生じる。(E) 粒子鋳型乳化中の残留上清に起因する過剰な衛星生成。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

成功したPTEでさえ、二重または三重のコア液滴が存在するが、それらはまれなものであるならば、一般的に反応に無視できる寄与する。適切なシェルを保持しながらマルチコア液滴の低周波を達成するには、表面張力、粒子間接着力、サンプル粘度、容器サイズ、および渦力と時間を含むプロセスパラメータの最適化が必要です。例えば、最適化が不十分な乳化は、多くのテンプレート粒子を有する多分散液滴を含んでいてもよい(図3A)、渦は試料を完全に乳化するのに不十分であることを示す。このような場合、洗浄剤を添加して粒子間接着を低減し、表面張力を低下させ、あるいは渦力または時間を増加させることができる。もう一つの共通の問題は、小さな空の液滴である過剰な衛星の生成である(図3B)。試料とキャリアオイルの界面張力とレオロジー特性に応じて、PTEエマルジョンでは衛星が避けられない場合があります。しかし、乳化前に過剰なサンプルを十分に除去しないこと(図2B)、またはあまりにも多くの電力で渦を出し、液滴から殻を剥ぎ取ることから生じることがよくあります。PTE乳化が成功した場合、サテライトは、カプセル化されたサンプルの総量の10%以下を含んではならない(図3C)¹¹。このレベルでは、通常、反応に対して無視して寄与し、無視することができます。審美的な目的のために、それらは新鮮な油で洗浄することによってエマルジョンから取り除くことができる(図3D)。

図 4.粒子鋳型乳化乳化デジタル液滴PCRの評価 (A)液滴の蛍光イメージングは、陽性蛍光液滴と陰性非蛍光滴を識別する。(B) デジタル液滴PCRを用いた希少な鋳型または低濃度のテンプレートの同定。(C)過剰なテンプレートカプセル化により、1滴当たりの可変数のテンプレート分子が生じる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

PTEの有用性を実証するために、マイクロ流体フリーのデジタル^PCR11を行うために使用しました。このプロセスを用いて、 S.セレビシエ ゲノムDNAを含む試料をカプセル化し、それを熱サイクルした。デジタルPCRでは、増幅された標的を含む液滴は蛍光となり、そうでないものは薄暗いままです。このように、蛍光滴は標的を示し、陽性の液滴を数えることによって標的を直接定量することができる(図4A)。蛍光滴の数は、このように標的分子と共にスケールし、標的が稀である場合には数少ない陽性を生み出す(図4B)、そしてそれが豊富な場合には多く(図4C)。他の離散成分のカプセル化と同様に、標的カプセル化はポアソン分布に従い、正の液滴分率を標的濃度に変換することを可能にし(図4D)、それによって^PTE11を用いてデジタルPCRを行う能力を実証する。

図 5.市販のPAAを用いたデジタル液滴PCRの実証 (A)液滴の蛍光画像は、陰性の非蛍光滴を特定する。(B) デジタル液滴PCRによる低濃度のテンプレートの同定。(C) デジタル液滴PCRを用いた高濃度のテンプレートの同定。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

これらの結果は、市販のポリアクリルアミド粒子(図5)を用いて繰り返し可能であり、市販のポリアクリルアミド粒子を用いて標準のデジタルPCRを実行するPTEの能力を実証し、同じ範囲で正確な測定を達成する。

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ディスカッション

PTEは粒子を使用して、渦を起させることによって単分散液滴にサンプルをカプセル化します。PTE は、そのシンプルさとアクセシビリティに加えて、大量の液滴を瞬時に生成するといったいくつかの利点を提供します。さらに、このプロセスは、サンプルをマイクロ流体デバイスに転送する必要性を排除し、サンプルの汚染や損失の機会を制限する、分離チューブで行うことができます。また、テンプレート粒子は、得られた液滴反応の内容を設計する手段も提供します。例えば、粒子サイズ、化学、および湿潤性は、標的化された生体分子または細胞捕捉のために設計することができ、一方、酵素、活性物、または核酸などの機能部分は、単一細胞のシーケンシングまたは機能特性化のために、反応を促進するために粒子上に表示することができる。このアプローチは柔軟ですが、その使用には重要な制約があります。例えば、マイクロ流体で頻繁に行われるように、現在のところ液滴添加を行うことは不可能であり、カプセル化の前にすべての反応成分を導入する必要があります。これは、液滴が生成されるまで試薬が互換性があり、安定であることが必要であり、面倒な組み合わせの場合、しばしば氷上でサンプルを素早く混合して乳化することによって対処することができます。あるいは、光や熱で外部から引き起こすことができる反応成分を^{使用することができる13}。PTEは、非専門家がアクセスできる液滴アッセイを実施するための柔軟でスケーラブルな方法を提供します。この機能は、その自然なシンプルさと柔軟性と相まって、PTEを多数の液滴アプリケーションの実行と開発に最適にします。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 um syringe filter	Milipore Sigma	SLGP033RS
0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo-Fisher	15575020
0.75 mm biopsy punch	World Precision Instruments	504529
1 mL syringes	BD	309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)	Sigma-Aldrich	370533
1M Tris-HCI, pH 8.0	Thermo-Fisher	15568025
27 gauge needles	BD	305109
3" silicon wafers, P type, virgin test grade	University Wafers	447
3D-printed centrifuge syringe holder	(custom)	(custom)
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A4058-100ML
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Aquapel (fluorinated surface treatment)	Pittsburgh Glass Works	47100
Hexane	Sigma-Aldrich	139386
FC-40 fluorinated oil	Sigma-Aldrich	F9755
Isopropanol	Sigma-Aldrich	109827
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma-Aldrich	146072-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil)	3M	98-0212-2928-5
polyethylene tubing	Scientific Commodities	B31695-PE/2
fluorosurfactant	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactant
PGMEA developer	Sigma-Aldrich	484431
Photomasks	CadArt Servcies	(custom)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)	Applied Biosystems	4464263
Spin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
Span 80 (sorbitane monooleate)	Sigma-Aldrich	s6760
SU-8 3025 photoresist	Kayaku	17030192
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	t8787
Tween 20 (polysorbate 20)	Sigma-Aldrich	p2287
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)	Applied Biosystems	4464263
Yeast FWD	IDT	5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′
Yeast REV	IDT	5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3
Yeast Probe	IDT	5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′
EVOS FL AUTO	Life Technologies
EVOS LED Cube, GFP	Life Technologies	AMEP4651
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents)	Dow Corning	DC4019862
TEMED	Thermo Fisher	17919
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA	Milipore	69240-3
Expanded plasma cleaner (plasma bonder)	Harrick Plasma	PDC-002 (230V)