Method Article
Капельные анализы «вода в масле» полезны для аналитической химии, эволюции ферментов и анализа одиночных клеток, но обычно требуют микрофлюидики для образования капель. Здесь мы описываем шаблонную эмульгацию частиц, безфлюидный подход к выполнению капельных анализов.
Реакции, выполняемые в монодисперсных каплях, обеспечивают повышенную точность и чувствительность по сравнению с аналогичными реакциями, выполняемыми оптом. Однако требование микрофлюидики к образованию контролируемых капель накладывает барьер для неспециалистов, ограничивая их использование. Здесь мы описываем шаблонную эмульгацию частиц, подход к генерации монодисперсных капель без микрофлюидики. Используя шаблонные гидрогелевые сферы, мы инкапсулируем образцы в монодисперсные капли простым вихрем. Мы демонстрируем этот подход, используя его для выполнения цифровой ПЦР без микрофлюидности.
Микрофлюидика капель использует компартментализацию в пиколитрных каплях для повышения чувствительности и точности анализов по сравнению с объемными реакциями и имеет многочисленные применения в химическом скрининге, белковой инженерии и секвенировании следующего поколения1,2,3. Например, цифровая капельно-полимеразная цепная реакция (ddPCR) обеспечивает повышенную точность по сравнению с объемной количественной полимеразной цепной реакцией (qPCR), с приложениями для генетических вариаций при раке, обнаружения мутаций, вызывающих заболевание, и пренатальной диагностики4,5,6. Однако одной из проблем, связанных с микрофлюидикой капель, является требование к микрофлюидным устройствам разделять образцы; в то время как микрофлюидика обеспечивает превосходный контроль над свойствами капель, они требуют специализированных знаний для создания и эксплуатации7,8. Следовательно, методы на основе капель в значительной степени ограничены экспертными лабораториями или, в редких случаях, приложениями, в которых доступен коммерческий инструмент9,10. Для расширения использования капельных анализов потребность в специализированных микрофлюидных приборах является препятствием, которое необходимо преодолеть.
В этой статье мы опишем эмульгирование частиц (PTE), метод без микрофлюидности для выполнения реакций в монодисперсных каплях. В PTE частицы шаблона поглощают образец в капли в масле-носителе простым вихрем (рисунок 1). По мере смешивания системы водная часть распадается на капли уменьшающегося размера, пока капли не содержат одиночные частицы, и в этот момент дальнейшая фрагментация невозможна, поскольку это требует разрушения частиц. Поглощенный образец окружает частицы как оболочку в каплях, тем самым инкапсулируя любые дисперсные клетки, реагенты или функциональные фрагменты (рисунок 1D). Таким образом, PTE не требует никакого оборудования или опыта для выполнения капельных реакций за пределами общего вихря. Кроме того, генерация капель занимает секунды по сравнению с минутами или часами с микрофлюидикой, а производимое количество пропорционально объему контейнера, а не времени работы устройства, что делает его в высшей степени масштабируемым. Эти преимущества делают PTE идеальным для проведения капельных анализов в различных обстоятельствах, в которых микрофлюидика непрактична. Здесь мы демонстрируем PTE и используем его для проведения ddPCR.
Рисунок 1. Обзор процесса эмульгирования по шаблонам частиц. (А) Частицы шаблона смешиваются с реагентами. (B) Избыточные реагенты удаляются после центрифугирования. (C) Добавление шаблонных молекул происходит до добавления масла. (D) Вихрь производит капли, содержащие одну молекулу шаблона. (E) Последующая термоциклировка и визуализация позволяют проводить цифровой капельный анализ целевого шаблона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
1. Подготовка частиц гидрогеля для шаблонной эмульгирования частиц.
Частицы гидрогеля, используемые для эмульгирования частиц по шаблонам, могут быть получены с использованием двух различных методов.
2. Эмульгирование частиц.
После приготовления шаблонных частиц PTE используется для инкапсулирования образца и реагентов в капли.
Том | Реагент |
100 мкл | Частицы (450 частиц / мкл) |
200 мкл | 2x ПЦР мастер микс |
18 мкл | 10 мкМ прямая грунтовка |
18 мкл | Обратная грунтовка 10 мкМ |
18 мкл | Зонд 10 мкМ |
0.8 мкл | Тритон X100 |
45.2 мкл | Вода без нуклеаз |
Таблица 1. Приготовление мастер-микса ПЦР, используемого с ПТЭ для цифровой капельной ПЦР.
3. Цифровая капельная ПЦР и анализ.
Шаг | Температура | Длительность | Примечания |
1 | 95 °С | 2 мин | |
2 | 95 °С | 30 с | |
3 | 50 °С | 90 с | |
4 | 72 °С | 60 с | |
5 | Повторите шаги x34 со 2 по 4 | ||
6 | 72 °С | 2 мин | |
7 | 4 °С | держать |
Таблица 2. Условия термоциклирования для цифровой капельной ПЦР с использованием эмульсий PTE.
Рисунок 2. Инкапсуляция образца в капли с использованием шаблонной эмульгирования частиц. (A) шаблонизация частиц, используемых для эмульгирования частиц. (B) Отделение гранул частиц шаблона от супернатанта после центрифугирования. (C) Капли, образующиеся в результате эмульгирования по образцу частиц с (D) идентифицируемой водной оболочкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В PTE монодисперсность эмульсий диктуется монодисперсностью частиц шаблона, потому что капли имеют диаметр немного больше, чем частицы. Таким образом, однородные частицы занимают центральное место в контролируемой инкапсуляции PTE11. Существует множество методов генерации однородных шаблонизирующих частиц, включая химические (золь-гель, эмульсионная полимеризация), гидродинамические (мембранная эмульгация, гомогенизация) и методы фильтрации. Микрофлюидные подходы, в частности, обеспечивают превосходную монодисперсность (рисунок 2A) и позволяют дополнительной инженерии частиц для повышения их функциональности в PTE12. В качестве альтернативы можно приобрести частицы-шаблоны, хотя их однородность, хотя и адекватна, обычно меньше, чем при микрофлюидной генерации11.
Для выполнения PTE частицы смешивают с образцом, подлежащим инкапсулированию (рисунок 1A), а избыток супернатанта удаляют центрифугированием и пипетированием (рисунок 1B), как показано фотографией гранулы частицы на дне трубки ПЦР (рисунок 2B). Затем добавляют инкапсулирующее масло, содержащее стабилизирующее поверхностно-активное вещество (рисунок 1C), и образец осторожно пипетируют перед вихрем в течение 30 секунд (рисунок 1D), чтобы получить эмульсию (рисунок 2C). Полученные капли содержат ядро частицы и водную оболочку, содержащую исходный образец, внутри которого находятся реагенты, молекулы-мишени и клетки, необходимые для реакции (рисунок 2D). Так же, как и в микрофлюидной инкапсуляции капель, дискретные сущности, такие как маленькие шарики или клетки, инкапсулируются случайным образом и в соответствии с распределением Пуассона, хотя почти все капли содержат частицу-шаблонистку из-за природы физики PTE.
Рисунок 3. Идентификация и очистка капель эмульгирования по шаблонам частиц. (A) Пример неоднородного образования капель с множественными частицами на каплю от недостаточного вихря. B) ожидаемое присутствие спутников и капель после эмульгирования по образцу частиц и С) фракционирования воды в масле. (D) Полученная эмульсия после промывки масла. Е) чрезмерная спутниковая генерация в результате остаточного супернатанта в ходе эмульгирования по образцам частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Даже при успешном ПТЭ существуют капли с двойным или тройным ядром, хотя они, как правило, незначительно влияют на реакцию, при условии, что они редки. Достижение низкой частоты многоядерных капель при сохранении адекватных оболочек требует оптимизации параметров процесса, включая поверхностное натяжение, силы адгезии между частицами, вязкость образца, размер контейнера, а также мощность и время вихря. Например, плохо оптимизированное эмульгирование может содержать полидисперсные капли со многими шаблонизирующими частицами (фиг.3А), что указывает на то, что вихрь был недостаточным для полной эмульгации образца. В таких случаях моющие средства могут быть добавлены для уменьшения адгезии между частицами и снижения поверхностного натяжения, или может быть увеличена вихревая мощность или время. Другой распространенной проблемой является генерация избыточных спутников, которые представляют собой небольшие пустые капли (рисунок 3B). Спутники могут быть неизбежны в эмульсиях PTE в зависимости от межфазного напряжения и реологических свойств образца и масла-носителя. Однако они часто возникают в результате недостаточного удаления избыточного образца перед эмульгированием (рисунок 2B) или вихря со слишком большой мощностью, удаляя оболочки из капель. При успешном эмульгировании PTE спутники должны составлять не более ~10% от общего объема инкапсулированного образца (рисунок 3C)11. На этом уровне они обычно вносят незначительный вклад в реакцию и могут быть проигнорированы. В эстетических целях их можно очистить от эмульсии путем промывки свежим маслом (рисунок 3D).
Рисунок 4. Оценка цифровой капельной ПЦР эмульгирования частицами. (A) Флуоресцентная визуализация капель идентифицирует положительные флуоресцентные капли и отрицательные нефлуоресцентные капли. (B) Идентификация редкого шаблона или низких концентраций шаблона с помощью цифровой капельной ПЦР. (C) Чрезмерная инкапсуляция шаблона, приводящая к переменному количеству молекул шаблона на каплю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы продемонстрировать полезность PTE, мы использовали его для выполнения цифровой PCR11 без микрофлюидности. Используя этот процесс, мы инкапсулировали образец, содержащий геномную ДНК S. cerevisiae , и термоциклировали его. При цифровой ПЦР капли, содержащие амплифицированные мишени, становятся флуоресцентными, в то время как без них остаются тусклыми. Таким образом, флуоресцентная капля указывает цель, позволяя напрямую количественно оценивать цели путем подсчета положительных капель (рисунок 4A). Таким образом, количество флуоресцентных капель масштабируется вместе с молекулами-мишенями, давая мало положительных результатов, когда мишень редка (рисунок 4B) и много, когда она в изобилии (рисунок 4C). Как и в случае с инкапсуляцией других дискретных компонентов, целевая инкапсуляция следует распределению Пуассона, позволяя положительной фракции капель трансформироваться в целевую концентрацию (рисунок 4D), тем самым демонстрируя способность выполнять цифровую ПЦР с PTE11.
Рисунок 5. Демонстрация цифровой капельной ПЦР с использованием коммерчески доступной ПАА. (A) Флуоресцентная визуализация капель идентифицирует отрицательные нефлуоресцентные капли. (B) Идентификация низких концентраций шаблона с помощью цифровой капельной ПЦР. (C) Идентификация высоких концентраций шаблона с помощью цифровой капельной ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Эти результаты повторяются с использованием коммерчески доступных полиакриламидных частиц (рисунок 5) и демонстрируют способность PTE выполнять стандартную цифровую ПЦР с коммерчески доступными полиакриламидными частицами, достигая точных измерений в том же диапазоне.
Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
PTE использует частицы для инкапсуляции образцов в монодисперсные капли путем вихря. В дополнение к своей простоте и доступности, PTE обеспечивает несколько дополнительных преимуществ, в том числе позволяет мгновенно генерировать большие объемы капель. Кроме того, процесс может проводиться в изолированной пробирке, устраняя необходимость передачи образцов в микрофлюидные устройства, оптимизируя общий рабочий процесс и ограничивая возможности для загрязнения или потери образцов. Частицы шаблона также обеспечивают средство, с помощью которого можно спроектировать содержание результирующих капельных реакций. Например, размер частиц, химический состав и смачиваемость могут быть спроектированы для целенаправленного захвата биомолекул или клеток, в то время как функциональные фрагменты, такие как ферменты, активные вещества или нуклеиновые кислоты, могут отображаться на частицах для облегчения реакций, таких как секвенирование отдельных клеток или функциональная характеристика. Хотя этот подход является гибким, тем не менее существуют серьезные ограничения на его использование. Например, в настоящее время невозможно выполнять капельные добавления, как это часто проводится с микрофлюидикой, требуя, чтобы все компоненты реакции были введены перед инкапсуляцией; это требует, чтобы реагенты были совместимыми и стабильными до тех пор, пока не будут образовываться капли, а в случае неприятных комбинаций часто могут быть устранены путем быстрого смешивания и эмульгирования образца на льду. Альтернативно, могут быть использованы реакционноспособные компоненты, которые могут быть вызваны внешним воздействием света или тепла13. Таким образом, PTE обеспечивает гибкий и масштабируемый метод проведения капельных анализов, доступный для неспециалистов. Это, в сочетании с присущей ему простотой и гибкостью, делает PTE идеальным для выполнения и разработки многочисленных капельных приложений.
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа по разработке этого протокола была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01-EB019453-02), Управлением директора Национальной разведки, деятельностью по перспективным исследовательским проектам разведки через Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Программой исследователей биохабов Чан-Цукерберга, Агентством перспективных исследовательских проектов министерства обороны через Техасский университет A & M (W911NF1920013) и Центрами по контролю и профилактике заболеваний через Университет Джона Хопкинса Applied Лаборатория физики (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Мнения и выводы, содержащиеся в настоящем документе, являются мнениями и выводами авторов и не должны толковаться как обязательно представляющие официальную политику, выраженную или подразумеваемую, вышеуказанных организаций или правительства США. Правительство США уполномочено воспроизводить и распространять перепечатки для правительственных целей, несмотря на любые аннотации, содержащиеся в авторских правах.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 | |
Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ | |
EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены