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要約

片方の後足の一時的な頭皮損傷(65°C±0.5°C、3秒)は、同側側のフォンフレイフィラメント刺激に対する閾値(g)を減少させ、歩行パターンを変化させる。その上、火傷は強制水泳試験においてうつ病のような行動を誘発する。

要約

熱傷水は、高齢者と若者の両方における火傷の最も一般的な原因です。これは、低所得国および中所得国における高い死亡率および後遺症のために、主要な臨床的課題の1つである。火傷は、しばしば激しい自発的な痛みおよび持続的なアロディニアならびに生命を脅かす問題を誘発する。さらに重要なことに、過度の痛みはしばしばうつ病を伴い、生活の質を著しく低下させる可能性がある。この記事では、火傷誘発性疼痛およびうつ病様行動の研究のための動物モデルを開発する方法を示す。麻酔後、マウスの後肢の片足を温水(65°C±0.5°C)に3秒間浸漬することにより火傷を誘発した。フォン・フライ試験および自動歩行分析は、火傷傷害後2日ごとに実施した。また、強制遊泳試験を用いてうつ病様挙動を調べ、火傷後の運動機能異常を鑑別するためにロタロッド試験を行った。この研究の主な目的は、マウスにおける火傷誘発性疼痛およびうつ病様行動の研究のための動物モデルの開発を記述することである。

概要

火傷および外傷などの組織損傷は、一般に、急性疼痛の同時発生と関連している。火傷および外傷関連症状は、毎年推定1,80,000人の死亡が火傷によって引き起こされている - 大多数は、火傷の異なるタイプから低所得国および中所得国で発生します1.世界的な報告によると、火傷は小児に一般的であり、入院患者の約40%〜60%を占めています2,3。これらの特定の傷害は、沸騰または入浴水4,5などの日常生活で起こり得るため、さらに深刻である。急性疼痛は、ほとんどの場合、組織損傷からの回復後に自発的に解決することができるが、神経系6,7の異常な変化のために慢性化することができるかもしれない。

最近、急性疼痛が抑うつ気分を誘発し、慢性疼痛が不安や抑うつを引き起こす可能性があることが示唆されている8,9,10,11。痛みとうつ病の共存は、患者の治療をより困難にする。うつ病はまた、疼痛感受性を増大させる傾向があり、これは、より強いうつ病および疼痛を誘発する可能性が高い12。疼痛およびうつ病の合併症は、末梢炎症の動物モデル13、14、15、16に示されている。疼痛誘発性うつ病の根底にある詳細なメカニズムは、これまであまり知られていません17。したがって、副作用および症状を緩和するために、火傷のためのより効果的な治療法を開発する必要がある。

したがって、本研究は、マウスにおける火傷誘発性急性疼痛およびうつ病様行動を研究するための動物モデルを開発するために設計された。このために、火傷に関連する異常な触覚感受性、歩行パターンの変化、およびうつ病様行動を測定した。さらに、この研究では、NSAIDを使用してモデルを検証しようとしています。

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プロトコル

すべての実験プロトコルは、韓国の忠南国立大学の施設動物ケアおよび使用委員会によってレビューおよび承認され、その後、国際疼痛研究協会の倫理ガイドラインに基づいて実施されました18。

1.後足のやけど火傷の誘発

  1. 体重20〜25gの雄ICRマウスを、湿度40%〜60%の明温室(12/12時間明暗サイクル、22.5°C±2.5°C)に収容する。
    注:このプロトコルには、雄マウスと雌マウスの両方を使用できます。
  2. 動物が食物と水に自由にアクセスできるようにし、実験を開始する前に少なくとも1週間は順応してください。
    注:すべての動物は、孤立応力などの変数を除外するためにグループ飼育された。
  3. マウスを実験群または対照群にランダムに割り当て、動物番号をコードとして盲検実験を行う。
  4. 火傷誘発の日に、100mg / kgの用量で300μLのアルファキサロンの腹腔内(i.p.)注射によってマウスを麻酔する。手術用ガウン、手袋、マスクを着用しながら火傷誘発を行う。
  5. マウスを深く麻酔した後、右後足の周りを70%エタノールで消毒する。
    注:深い麻酔の状態を確認するために、後足のつま先または尾に加えられたピンチ刺激に対する反応の欠如を確認してください。
  6. 麻酔の誘発後の角膜乾燥を防ぐために、眼科用軟膏を眼に塗布する。
  7. 深く麻酔をかけられたマウスの右後肢を65°C±0.5°Cのお湯に3秒間浸します。後足をお湯に浸す前に、各マウスの足首に印を付け、火傷した部分の一貫性を維持します。
  8. 火傷を誘発した後、マウスを清潔な家庭用ケージに入れ、動物が麻酔から回復するまで加熱パッドの上に置きます。
    注:鎮痛剤アセトアミノフェン(200mg/kg)を火傷の日から7日間、1日1回腹腔内投与した(火傷+アセトアミノフェン群のみ)。バーングループは、車両制御として生理食塩水で処理されました。実験は、先行研究4に記載の方法に従って行った。

2. 機械的異痛症の測定

  1. マウスを行動試験室に持ってきて、試験前に少なくとも30分間は順応させてください。手術用ガウン、手袋、マスクを着用して試験を行ってください。
  2. マウスを金属メッシュの床(メッシュサイズ:0.7 cm x 0.7 cm)の正方形の箱(直径:13 cm、高さ:12 cm)に入れ、少なくとも30分間順応させます。
  3. 上昇刺激法19、20を用いて後足の機械的閾値を評価する。
  4. 5〜8秒間隔で一連のフォンフレイフィラメントを優しく突いて、後足底を刺激する。火傷誘発の前日のベースライン値を求める。
    注:0.16〜1.2gのフォン・フレイフィラメントを、それぞれすべての動物における足の離脱閾値を測定するために試験に使用した。足引き抜き応答試験は、フォン・フライフィラメントの最小曲げ力(このプロトコルでは0.16g)で開始した。応答がない場合は、次の曲げ力を持つフィラメントが適用されました。
  5. 5つの試験を実施して、各同側(負傷した)後足の機械的閾値を評価する。
    注:各動物における5回の試験の3倍以上の応答を生じるフォン・フレイフィラメントの曲げ力を、足引き抜き閾値(PWT、g)として表した。機械的閾値は、火傷の前日および1日後、3日後、5日後および7日後に測定した。鎮痛効果は、動物におけるアセトアミノフェンの投与後1時間で評価した。

3. 自動歩行解析

  1. 歩行解析システム内のマウスを、火傷傷害の5日前から10〜15分間、1日1回順応させる。歩行解析を行う際には、手術用ガウン、手袋、マスクを着用してください。
  2. 試験当日、マウスを行動試験室に持ち込み、試験前に少なくとも30分間順応させる。
    メモ: 馴化および歩行解析テストは、暗い環境で実行してください。プログラムメニューの条件を以下のように設定します。
    1. プログラムを実行した後、[ 新しい実験の作成] メニューをクリックして、データを保存するフォルダーを指定します。
    2. 指定後、最大実行時間を 5 秒、最大許容速度バリエーションを 50% に設定します。
    3. 登録したカメラを選択し、プログラムの [ 設定 ] タブで歩道の長さを 30 cm に設定します。
    4. プログラムメニューの 「 取得」タブで、「 取得を開く」を選択します。
    5. ステータスメッセージに基づいて、[ 背景のスナップ] ボタンをクリックして、空の歩道の背景画像を取得します。
  3. [ 取得の開始] ボタンをクリックし、左右のトラバース可能な歩道の入り口にマウスを置きます。記録は、マウスの自由な動きに続いて自動的に開始されます。
    注:動物の歩行が正常に記録され、すべての足音が検出された場合、緑色のアイコンで準拠実行としてマークされます。ソフトウェアが足音を検出しない場合は、赤いアイコンが表示され、その場合は録音を再度実行することをお勧めします。著者らは、同様の実行速度で実行された少なくとも5つの成功した準拠実行を収集して分析することを推奨している。
  4. プログラムメニューの [ 取得 ] タブで、[ 実行の分類] を選択します。
    注: 上記のコンプライアンスの実行が成功したときに得られたデータを選択したら、マウスの歩行パターンが記録されたビデオ分析画面に移動します。
  5. 分析する実行を選択し、[ 自動分類] ボタンをクリックします。
  6. 自動分類を行った後、鼻、性器認識、足の誤認識をジャンクデータに除去し、データを分析します。
    注:すべての統計パラメータは自動的に分析され、プログラムに保存され、生データの値は実験者の分析メニューで見つけることができます。自動歩行分析は、火傷傷害の前および1、3、5、および7日後に実施した。評価は、Burn+アセトアミノフェン群におけるアセトアミノフェン投与後30分、Burn群における生理食塩水処理後30分に行った。この実験は、先行研究4、21、22に記載の方法に従って行った。

4. うつ病様行動の測定

注:絶望ベースの行動、水中での不動時間は、強制水泳試験によって測定した。

  1. マウスを行動試験室に持ってきて、試験前に少なくとも30分間順応させる。強制水泳試験を行う間、手術用ガウン、手袋、マスクを着用してください。
  2. マウスを15cmの水(25°C±0.5°C)を含む透明なプレキシガラスシリンダー(10cm×25cm)に15分間入れます。
  3. 24時間後、同じ条件のシリンダーにマウスを入れ、不動時間を測定します。
    注:不動時間は、試験時間の5分間測定し、マウスが登山または水泳を停止し、頭を水面上に保つために浮遊した時間を記録した。強制水泳試験は、火傷後7日目に実施した。評価は、Burn+アセトアミノフェン群ではアセトアミノフェン投与後1時間、Burn群では生理食塩水処理後1時間行った。実験は、先行研究23、24に記載の方法に従って行った。

5. 正常な運動機能の測定

注:ロタロッド試験は、火傷後の異常な運動機能を区別するために実施された。

  1. マウスを行動試験室に持ってきて、試験前に少なくとも30分間順応させる。強制水泳試験を行う間、手術用ガウン、手袋、マスクを着用してください。
  2. 動物を装置の底部から16cm上に吊り下げたローリング円筒形のプラットフォーム(幅5.7cm、直径3cm)の上に置く。
  3. 各動物に、火傷を誘発する前に少なくとも5日間、ロタロッドで1日1回訓練させる。
  4. 薬物投与後2時間、20分ごとにロタロッド試験を行う。カットオフ時間を 2 分に設定します。
  5. マウスが落下することなく毎分15回転の一定速度で回転ロッド上を走る時間の長さを測定します。
    注:ロタロッド試験は、火傷傷害の誘発の7日後に実施した。評価は、Burn+アセトアミノフェン群におけるアセトアミノフェン投与直後およびBurn群における生理食塩水処理後に行った。アルファファクサロンは、この試験において実験的に処理された薬物の陽性対照として使用された。ロタロッド試験中、マウスが落下することなく回転ロッド上を走る時間の長さが測定される。実験は、先行研究22、25に記載の方法に従って行った。

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結果

動物の苦しみを最小限に抑え、3つのRs(置換、削減、および改良)ガイドラインに従って使用される動物の数を減らすために、この研究は予備実験によって確立された重要なデータを収集するために最小限の動物数で設計されました。本研究では、行動実験を以下のように2回独自に行った。歩行分析、機械的異痛症、およびうつ病様挙動試験を、対照群(n = 5)、Burn(n = 7;車両制御;生理食塩水)、?...

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ディスカッション

やけど火傷は、加熱された液体によって引き起こされる熱火傷の一種です。ほとんどの場合、第1度または第2度の火傷が起こることが示唆されているが、熱源との長期的な接触は第3度の火傷を引き起こす可能性がある26。本研究では、マウスの右後肢を65°Cの温水に3秒4、26暴露することにより火傷を誘発した。火傷を負った足に組...

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開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、忠南大学校と韓国政府(NRF)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成金(NRF-2019R1A6A3A01093963およびNRF-2021R1F1A1062509)の支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD307809
1.5 mL tubeAxygenMCT-150-C
50 mL tubeSPL50050
Acetaminophen BioXtra, ≥99.0%Sigma-AldrichA7085-100GThis analgesic agent is used as a positive control.
Alfaxan multidose (Alfaxalone)JUROX Pty.LimitedIn this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test.
CatWalk automated gait analysis systemNoldusCatWalk XTGait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction
OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment)Ashish Life ScienceThis material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia.
Plexiglass cylinderSCITECH KOREAcustom made productsUsed in forced swimming test
Rota-rod systemSCITECH KOREAAccelerating rota rodUsed in the measurement of Normal Motor Function
von Frey filamentsNorth Coast MedicalNC12775Used in the measurement of Mechanical Allodynia
WaterbathCHANGSHIN SCIENCEC-WBEUsed in the burn injury induction

参考文献

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