Dolor inducido por quemaduras y comportamiento similar a la depresión en ratones

Resumen

Una lesión por escaldadura transitoria (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) de una pata trasera disminuye el umbral (g) a la estimulación del filamento von Frey del lado ipsilateral y altera el patrón de marcha. Además, la lesión por quemadura induce un comportamiento similar a la depresión en la prueba de natación forzada.

Resumen

El agua hirviendo es la causa más común de lesiones por quemaduras tanto en poblaciones de edad avanzada como jóvenes. Es uno de los principales desafíos clínicos debido a la alta mortalidad y secuelas en los países de ingresos bajos y medios. Las quemaduras con frecuencia inducen dolor espontáneo intenso y alodinia persistente, así como problemas potencialmente mortales. Más importante aún, el dolor excesivo a menudo se acompaña de depresión, lo que puede disminuir significativamente la calidad de vida. Este artículo muestra cómo desarrollar un modelo animal para el estudio del dolor inducido por quemaduras y el comportamiento similar a la depresión. Después de la anestesia, la lesión por quemadura se indujo sumergiendo una pata trasera del ratón en agua caliente (65 ° C ± 0,5 ° C) durante 3 s. La prueba de von Frey y el análisis automatizado de la marcha se realizaron cada 2 días después de la lesión por quemadura. Además, se examinó el comportamiento similar a la depresión utilizando la prueba de natación forzada, y se realizó la prueba de varilla giratoria para diferenciar la función motora anormal después de una lesión por quemadura. El objetivo principal de este estudio es describir el desarrollo de un modelo animal para el estudio del dolor inducido por quemaduras y el comportamiento similar a la depresión en ratones.

Introducción

El daño tisular, como quemaduras y traumatismos, generalmente se asocia con la co-ocurrencia de dolor agudo. Se estima que las lesiones por quemaduras y los síntomas relacionados con el trauma se estiman en que 1,80,000 muertes cada año son causadas por quemaduras; la gran mayoría ocurren en países de ingresos bajos y medios de diferentes tipos de quemaduras¹. Según un informe mundial, las quemaduras son comunes en los niños y representan alrededor del 40%-60% de los pacientes hospitalizados ^2,3. Estas lesiones específicas son aún más graves, ya que pueden ocurrir en la vida cotidiana, como hervir o bañarse^{en agua 4,5}. Aunque el dolor agudo puede resolverse espontáneamente después de la recuperación del daño tisular en la mayoría de los casos, puede ser posible que se vuelva crónico debido a cambios anormales en el sistema nervioso ^6,7.

Recientemente, se ha sugerido que el dolor agudo puede inducir un estado de ánimo deprimido, y el dolor crónico puede causar ansiedad y depresión 8,9,10,11. La coexistencia del dolor y la depresión hace que sea más difícil tratar al paciente. La depresión también tiende a aumentar la sensibilidad al dolor, lo que es probable que induzca una depresión y dolor más^{intensos 12}. Las complicaciones del dolor y la depresión se muestran en modelos animales de inflamación periférica 13,14,15,16. Los mecanismos detallados que subyacen a la depresión inducida por el dolor no son bien conocidos hasta ahora¹⁷. Por lo tanto, es necesario desarrollar tratamientos más efectivos para las quemaduras para aliviar los efectos secundarios y los síntomas.

Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para desarrollar un modelo animal para estudiar el dolor agudo inducido por quemaduras y el comportamiento similar a la depresión en ratones. Para esto, se midió la sensibilidad táctil anormal relacionada con las lesiones por quemaduras, el patrón de marcha alterado y el comportamiento similar a la depresión. Además, este estudio intenta validar el modelo utilizando AINE.

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Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional de Chungnam en Corea del Sur, y luego se llevaron a cabo en base a las pautas éticas de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor¹⁸.

1. Inducción de la lesión por quemaduras hirviendo en la pata trasera

1. Alojar a los ratones machos ICR que pesan 20-25 g en una habitación con luz y temperatura controlada (ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h, 22,5 °C ± 2,5 °C) con una humedad del 40%-60%.
   NOTA: Tanto los ratones machos como las hembras se pueden utilizar para este protocolo.
2. Permita que el animal tenga libre acceso a alimentos y agua, y aclimata durante al menos 1 semana antes de comenzar el experimento.
   NOTA: Todos los animales fueron alojados en grupo para excluir variables como el estrés de aislamiento.
3. Asigne a los ratones al azar al grupo experimental o de control y realice experimentos ciegos utilizando números de animales como códigos.
4. El día de la inducción de la quemadura, anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de 300 μL de alfaxalona a una dosis de 100 mg/kg. Use una bata quirúrgica, guantes y máscara mientras realiza la inducción de quemaduras.
5. Después de anestesiar profundamente al ratón, desinfecte alrededor de la pata trasera derecha con etanol al 70%.
   NOTA: Compruebe la falta de respuesta a la estimulación de pellizco aplicada a los dedos traseros o la cola para confirmar el estado de anestesia profunda.
6. Aplique un ungüento oftálmico en los ojos para evitar el secado corneal después de la inducción de la anestesia.
7. Sumerja la pata trasera derecha del ratón profundamente anestesiado en agua caliente a 65 °C ± 0,5 °C durante 3 s. Haga una marca en el tobillo de cada ratón antes de sumergir la pata trasera en agua caliente para mantener la consistencia en el área quemada.
8. Después de la inducción de quemaduras, lleve a los ratones a una jaula casera limpia y colóquelos en una almohadilla térmica hasta que los animales se recuperen de la anestesia.
   NOTA: El agente analgésico, paracetamol (200 mg/kg), se administró por vía intraperitoneal una vez al día durante 7 días a partir del día de la lesión por quemadura (solo burn + acetaminofén). El grupo burn fue tratado con solución salina como control vehicular. El experimento se realizó según el método descrito en un estudio previo⁴.

2. Medición de la alodinia mecánica

1. Lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento y déjelos aclimatarse al menos durante 30 minutos antes de la prueba. Use una bata quirúrgica, guantes y máscara mientras realiza la prueba.
2. Coloque los ratones en una caja cuadrada (diámetro: 13 cm, altura: 12 cm) en un piso de malla metálica (tamaño de malla: 0,7 cm x 0,7 cm) y déjelos aclimatarse durante al menos 30 min.
3. Evaluar el umbral mecánico de la pata trasera utilizando el método de estímulo ascendente ^19,20.
4. Empuje suavemente una serie de filamentos von Frey con intervalos de 5-8 s para estimular la planta posterior. Obtenga los valores basales el día antes de la inducción de quemaduras.
   NOTA: Los filamentos von Frey de 0,16-1,2 g se utilizaron en la prueba para medir el umbral de retirada de la pata en todos los animales, respectivamente. La prueba de respuesta de retirada de la pata se inició con la fuerza de flexión más baja del filamento von Frey (0,16 g en este protocolo). Si no había respuesta, entonces se aplicaba un filamento con la siguiente fuerza de flexión.
5. Realizar cinco ensayos para evaluar los umbrales mecánicos para cada pata trasera ipsilateral (lesionada).
   NOTA: La fuerza de flexión del filamento de von Frey que produce respuesta más de tres veces de los cinco ensayos en cada animal se expresó como umbral de retirada de la pata (PWT, g). Los umbrales mecánicos se midieron un día antes y a los 1, 3, 5 y 7 días después de la lesión por quemadura. El efecto analgésico se evaluó 1 h después de la administración del paracetamol en el animal.

3. Análisis automatizado de la marcha

1. Aclimatar a los ratones en el sistema de análisis de la marcha una vez al día durante 10-15 minutos desde 5 días antes de la lesión por quemadura. Use una bata quirúrgica, guantes y máscara mientras realiza un análisis de la marcha.
2. El día de la prueba, lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento y aclimatarlos durante al menos 30 minutos antes de la prueba.
   NOTA: Realice pruebas de aclimatación y análisis de la marcha en un entorno oscuro. Establezca las condiciones del menú del programa de la siguiente manera.
   1. Después de ejecutar el programa, haga clic en el menú Crear nuevo experimento para designar la carpeta para guardar los datos.
   2. Después de la designación, establezca el tiempo máximo de ejecución en 5 s y las variaciones de velocidad máximas permitidas en 50%.
   3. Seleccione una cámara registrada y establezca la longitud de la pasarela en 30 cm en la pestaña Configuración del programa.
   4. En la pestaña Adquirir del menú del programa, seleccione Abrir adquisición.
   5. Según los mensajes de estado, haga clic en el botón Ajustar fondo para adquirir una imagen de fondo de una pasarela vacía.
3. Haga clic en el botón Iniciar adquisición y luego coloque el mouse en la entrada de la pasarela transitable izquierda-derecha. La grabación se iniciará automáticamente tras el libre movimiento del ratón.
   NOTA: Si la marcha del animal se ha registrado con éxito y se han detectado todos los pasos, se marcará como Compliant Run con un icono verde. Si el software no detecta ningún paso, se muestra un icono rojo, en cuyo caso se recomienda realizar la grabación nuevamente. Los autores recomiendan recopilar y analizar al menos cinco ejecuciones compatibles exitosas realizadas con velocidades de ejecución similares.
4. En la pestaña Adquirir del menú del programa, seleccione Clasificar ejecuciones.
   NOTA: Después de seleccionar los datos obtenidos de la ejecución de cumplimiento exitosa anterior, vaya a la pantalla de análisis de video donde se registraron los patrones de marcha de los ratones.
5. Seleccione la ejecución que desea analizar y haga clic en el botón Clasificación automática .
6. Después de realizar la clasificación automática, elimine la nariz, el reconocimiento genital y el reconocimiento incorrecto de las patas a los datos basura en cada carrera, y luego analice los datos.
   NOTA: Todos los parámetros estadísticos se analizan y guardan automáticamente en el programa, y los valores de datos sin procesar se pueden encontrar en el menú de análisis del experimentador. El análisis automático de la marcha se realizó antes y a los 1, 3, 5 y 7 días después de la lesión por quemadura. La evaluación se realizó 30 min después de la administración de paracetamol en el grupo Burn + Acetaminophen y 30 min después del tratamiento salino en el grupo Burn. Este experimento se realizó según el método descrito en los estudios previos ^4,21,22.

4. Medición del comportamiento similar a la depresión

NOTA: El comportamiento basado en la desesperación, el tiempo de inmovilidad en el agua se midió mediante la prueba de natación forzada.

1. Lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento y aclimatarlos durante al menos 30 minutos antes de la prueba. Use una bata quirúrgica, guantes y máscara mientras realiza la prueba de natación forzada.
2. Coloque el ratón en un cilindro de plexiglás transparente (10 cm x 25 cm) que contenga 15 cm de agua (25 °C ± 0,5 °C) durante 15 min.
3. Después de 24 h, coloque el ratón en el cilindro de las mismas condiciones y mida el tiempo de inmovilidad.
   NOTA: El tiempo de inmovilidad se midió durante 5 minutos de tiempo de prueba, y se registró el tiempo en que los ratones dejaron de escalar o nadar y simplemente flotaron para mantener la cabeza por encima de la superficie del agua. La prueba de natación forzada se realizó el día 7 después de la lesión por quemadura. La evaluación se realizó 1 h después de la administración de paracetamol en el grupo Burn + Acetaminophen, y 1 h después del tratamiento salino en el grupo Burn. El experimento se realizó según el método descrito en estudios previos^23,24.

5. Medición de la función motora normal

NOTA: La prueba de varilla rotativa se realizó para diferenciar la función motora anormal después de una lesión por quemadura.

1. Lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento y aclimatarlos durante al menos 30 minutos antes de la prueba. Use una bata quirúrgica, guantes y máscara mientras realiza la prueba de natación forzada.
2. Coloque a los animales en una plataforma cilíndrica rodante (5,7 cm de ancho; 3 cm de diámetro) suspendida 16 cm por encima de la parte inferior del aparato.
3. Permita que cada animal entrene una vez al día en una varilla giratoria durante al menos 5 días antes de la inducción de la lesión por quemadura.
4. Realice la prueba de varilla rotativa cada 20 minutos durante 2 h después de la administración del medicamento. Establezca el tiempo de corte en 2 min.
5. Mida la duración del tiempo que el ratón funciona en una varilla giratoria a la velocidad constante de 15 revoluciones por minuto sin caer.
   NOTA: La prueba de varilla rotatoria se realizó 7 días después de la inducción de la lesión por quemadura. La evaluación se realizó inmediatamente después de la administración de paracetamol en el grupo Burn + Acetaminophen y después del tratamiento con solución salina en el grupo Burn. La alfaxalona se utilizó como un control positivo para los fármacos tratados experimentalmente en esta prueba. Durante la prueba de rotarod, se mide la duración del tiempo que el ratón corre sobre la varilla giratoria sin caerse. El experimento se realizó según el método descrito en estudios previos^22,25.

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Resultados

Con el fin de minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados según las tres R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento), este estudio fue diseñado con el número mínimo de animales para la recopilación de datos significativos establecidos a través de experimentos preliminares. En este estudio, los experimentos conductuales se realizaron de forma independiente dos veces de la siguiente manera. El análisis de la marcha, la alodinia mecánica y las pruebas de comportamiento similares...

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Discusión

La quemadura por escaldado es un tipo de quemadura térmica causada por líquidos calentados. Se ha sugerido que las quemaduras de primer o segundo grado ocurren en la mayoría de los casos, pero el contacto a largo plazo con fuentes de calor puede causar quemaduras de tercer grado²⁶. En el presente estudio, la lesión por quemaduras se indujo al exponer la pata trasera derecha de los ratones en agua caliente a 65 ° C durante 3 s ^4,26. Se...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	307809
1.5 mL tube	Axygen	MCT-150-C
50 mL tube	SPL	50050
Acetaminophen BioXtra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	A7085-100G	This analgesic agent is used as a positive control.
Alfaxan multidose (Alfaxalone)	JUROX Pty.Limited		In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test.
CatWalk automated gait analysis system	Noldus	CatWalk XT	Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction
OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment)	Ashish Life Science		This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia.
Plexiglass cylinder	SCITECH KOREA	custom made products	Used in forced swimming test
Rota-rod system	SCITECH KOREA	Accelerating rota rod	Used in the measurement of Normal Motor Function
von Frey filaments	North Coast Medical	NC12775	Used in the measurement of Mechanical Allodynia
Waterbath	CHANGSHIN SCIENCE	C-WBE	Used in the burn injury induction